Extracto
Antecedentes
Recientemente ha habido un interés creciente en el productos naturales farmacológicamente activos asociados con los recursos de diversos tipos de enfermedades, incluyendo cáncer. Fucoidan es un polisacárido derivado de las algas marinas marrones y ha sido utilizado como un ingrediente en algunos productos de suplementos dietéticos. A pesar de que el fucoidan ha sido conocido por tener actividad contra el cáncer, los efectos anti-metastásicos y su mecanismo detallado de las acciones han sido mal entendido. Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron para demostrar las funciones anti-metastásicos de fucoidan y su mecanismo de acción utilizando el A549, una línea celular de cáncer de pulmón humano altamente metastásico.
métodos y las conclusiones principales
Fucoidan inhibe el crecimiento de las células A549 a una concentración de 400 mg /ml. tratamiento Fucoidan de la dosis no tóxica (0-200 mg /ml) exhibe un efecto inhibidor dependiente de la concentración en la invasión y la migración de la célula de cáncer a través de la disminución de su actividad de MMP-2. Para conocer el mecanismo de estos efectos inhibidores, se realizó la transferencia Western. tratamiento fucoidan regula a la baja extracelular quinasa relacionada señal 1 y 2 (ERK1 /2) y fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) -Akt diana de la rapamicina en mamíferos (PI3K-Akt-mTOR) itinerarios. Por otra parte, el fucoidan disminuye los niveles citosólicos y nucleares del factor nuclear-kappa B (p65).
Conclusiones /Importancia
El presente estudio sugiere que el fucoidan exhibe efecto anti-metastásico de células de cáncer de pulmón A549 a través de la baja regulación de ERK1 /2 y Akt-mTOR, así como las vías de señalización NF-kB. Por lo tanto, el fucoidan se puede considerar como un potencial reactivo terapéutico contra la metástasis de las células cancerosas de pulmón humano invasivos
Visto:. Lee H, Kim JS, Kim E (2012) a partir de algas Fucoidan
Fucus vesiculosus
inhibe la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón a través de PI3K-Akt-mTOR Caminos. PLoS ONE 7 (11): e50624. doi: 10.1371 /journal.pone.0050624
Editor: Renping Zhou, Universidad de Rutgers, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Agosto, 2012; Aceptado: 23 de octubre de 2012; Publicado: noviembre 30, 2012
Copyright: © 2012 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la metástasis es la causa principal (hasta el 90%. ) de las muertes relacionadas con el cáncer. El desarrollo de la metástasis del cáncer consiste en múltiples procesos, en los que las células cancerosas primero se desprenden del tumor primario, invaden los tejidos circundantes y intravasate en los sistemas linfáticos sangre y /o y extravasado de la vasculatura y posteriormente se asientan y colonizan en los órganos diana. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) desempeñan un papel clave en la metástasis tumoral, donde MMPs degradan la matriz extracelular (ECM) proteínas tales como colágeno, proteoglicanos, elastina, laminina, fibronectina y [1], [2]. Entre ellos, MMP-2 (gelatinasa A) y MMP-9 (gelatinasa B) se expresan en abundancia en varios tipos de cáncer malignas y degradan el colágeno de tipo IV, que es un componente principal de la membrana basal. Generalmente, MMP-2 es sobre-expresa constitutivamente en los cánceres altamente metastáticos, mientras que MMP-9 es inducido por algunos factores estimulantes tales como citoquinas inflamatorias, factor de crecimiento epidérmico y de forbol-12-miristato-13-acetato de [3]. Por lo tanto, la MMP-2 puede jugar un papel más importante en la migración de las células del cáncer y la invasión.
El cáncer de pulmón es uno de los cánceres más comunes en el mundo y la principal causa de muerte por cáncer, lo que representa más de una millón de muertes al año en todo el mundo [4]. En particular, es un tumor extremadamente agresivo y metastásico probablemente debido a la secreción de altos niveles de MMPs en comparación con otros tipos de cáncer. Por lo tanto, la inhibición de MMP-2 en células de cáncer parece ser una diana terapéutica interesante de las células de cáncer de pulmón altamente metastásicas. expresión MMP está regulada por factores de transcripción (AP-1 y NF-kB) a través de vías de aguas arriba incluyendo quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) y las vías PI3K-Akt [5]. MAPKs consisten de tres quinasas, incluyendo extracelular quinasa relacionada señal-1 y 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal quinasa /estrés proteína quinasa activada (JNK /SAPK), y p38. MAPKs están implicados en una variedad de funciones celulares tales como la proliferación, la migración y la invasión [3]. La activación de PI3K puede estimular su objetivo abajo, Akt, y luego regular el crecimiento celular, la adhesión y la invasión
[6].
Ha habido numerosos informes que investigan la quimioprevención del cáncer o agentes terapéuticos a partir de productos naturales. Muchas especies de algas marinas han sido utilizados en la dieta alimentaria y también documentado como siendo utilizado en la medicina tradicional oriental por más de 1000 años [7], [8]. Contienen varios componentes funcionales, tales como porphyran, gepsin, ácido algínico, y oligosacárido. Fucoidan, cuyo promedio de peso molecular es de aproximadamente 20.000, es un polisacárido sulfatado extraído de las algas marinas marrones y consta de grupos L-fucosa y éster sulfato. Se ha sugerido anteriormente que fucoidan tiene diversas actividades biológicas tales como antibacteriano [9], antioxidantes [10], anti-inflamatoria [11], anticoagulante [12], y las actividades anti-tumorales [2]. En ratones C57BL /6 transplantados con células de adenocarcinoma de pulmón de Lewis, fucoidan de
evanescens Fucus
producen antitumoral moderada y efectos anti-metastáticos y potenció el anti-metastásico, pero no antitumoral actividades de ciclofosfamida [13]. Además, fucoidan inhibió MMP-2/9 actividades y la invasividad de las células HT-1080 y la formación de túbulos vascular a través de la supresión de la expresión y secreción de un factor de la angiogénesis [14]. Sin embargo, el mecanismo molecular de su acción ha sido rara vez se entiende todavía.
Se incubaron células A549 Subconfluent (A) durante 48 horas en ausencia o presencia de fucoidan (0, 12.5, 25, 50, 100, y 200 g /ml) en medio RPMI libre de suero. Se recogieron los medios condicionados, y su actividad MMP-2 se estimó usando zimografía de gelatina. (B) MMP-2 la actividad mediante el análisis de zimografía se cuantificó mediante la medición de las intensidades de banda utilizando software Image J. (C) Total de lisados de células se sometieron a análisis de transferencia Western sondada con anticuerpo anti-MMP-2. (D) Expresión de MMP-2 por análisis de transferencia de western se cuantificó mediante la medición de las intensidades de banda utilizando software Image J. Los datos mostrados son las medias ± SD de seis experimentos. Diferencia significativa del grupo de control, * p & lt; 0,05 y ** p & lt;.
0,01
En el presente estudio, se investigó el efecto del fucoidan sobre la migración, invasión y MMP-2 expresión de humano A549 las células de cáncer de pulmón y de su subyacente mecanismos anti-metastásicos de acción.
Materiales y Métodos
Preparación de Fucoidan y Reactivos
extracto de algas marinas Fucoidán de
Fucus vesiculosus
se obtuvo de Sigma (Sigma, St. Louis, Mo, EE.UU.). polvo Fucoidan se disolvió en PBS, a continuación, se esterilizó usando un filtro de 0,45 micras de poro (Sartorius Biotech GmbH, Göttingen, Alemania) y se almacena como "extracto de fucoidan (20 mg /ml) 'a 4 ° C hasta su uso. reactivos de MTT y gelatina (G8150) fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.). Medio RPMI 1640 sin rojo fenol, tripsina-EDTA, solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (10.000 U /ml, 10 mg /ml, y 25 g /ml), suero fetal bovino (FBS), y solución tampón de fosfato (PBS) eran de Gibco BRL, Life Technologies (EE.UU.). LY294002 (inhibidor de PI3K), U0126 (ERK1 /2 inhibidor), y rapamicina (inhibidor de mTOR) se obtuvieron de Tocris Cookson Ltd. (Bristol, Reino Unido). Para ERK1 /2, p38, JNK, Akt, mTOR (Ser2448), y NF-kB, anticuerpos totales y /o fosforiladas específicos de proteínas se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). kit de ensayo de invasión fue de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.).
células A549 (A) se sembraron en 12 pocillos y se cultivaron hasta 90% de confluencia en RPMI que contiene 10% de SFB. Las células se rascaron con una punta de pipeta y luego tratados con fucoidan (0, 50, 100, y 200 mg /ml). distancia (B) La migración celular se estimó midiendo la anchura de la herida. Los datos mostrados son las medias ± SD de seis experimentos. Diferencia significativa del grupo de control, * p & lt; 0,05 y ** p & lt;.
0,01
(A) Efectos de fucoidan en las células cancerosas invasión fueron examinadas usando celular kit de ensayo de invasión (BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.). Para ello, se sembraron células A549 en la cámara superior del filtro recubierto con Matrigel y se incubaron en ausencia o presencia de fucoidan (0, 50, 100, y 200 mg /ml) durante 48 hr. Las células invasoras en la superficie inferior de la membrana se visualizaron por tinción con cristal violeta y se observaron con microscopio de luz. (B) La cantidad de células invasoras se cuantificó usando el software Image J. Los datos mostrados son las medias ± SD de tres experimentos. Diferencia significativa del grupo de control, * p & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0.01
Cultivo celular
Se cultivaron células A549 de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) en medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, solución de 100 mg /ml de penicilina-estreptomicina-anfotericina B a 37 ° C en un 5% CO
2 incubador humidificado. Las células se pasaron tres veces a la semana por tratamiento con tripsina-EDTA y los de después de que se utilizan cinco pasajes para los experimentos.
células A549 (A) se trataron con fucoidan 200 g /ml para los períodos de 0, 1 , 3, 6 y 9 h, respectivamente. Se incubaron (B) células A549 durante 6 horas con fucoidan a diversas concentraciones (0, 50, 100 y 200 g /ml). Los niveles de fosfato JNK media, fosfo-ERK media, y fosfo-p38 se analizaron por transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos. GAPDH se utilizó como control de carga. (C y D) El nivel de fosforilación de ERK1 /2 se cuantificó mediante el análisis con el software Image J. Los datos mostrados son las medias ± SD de tres experimentos independientes. Diferencia significativa del grupo de control, * p & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0.01
células A549 (A) se trataron con fucoidan 200 mg /ml para los períodos de 0, 1, 3, 6 y 9 h, respectivamente. Se incubaron (B) células A549 durante 6 horas con fucoidan a diversas concentraciones (0, 50, 100 y 200 g /ml). Los niveles de fosfo-PI3K y fosfo-Akt se analizaron por transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos. GAPDH se utilizó como control de carga. Los niveles de fosforilación de PI3K (C y D) y Akt (E y F) se cuantificaron por el análisis con el software Image J. Los datos mostrados son las medias ± SD de tres experimentos independientes. Diferencia significativa del grupo de control, * p & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0.01
Se incubaron células A549 (A) durante 24 horas con fucoidan a diversas concentraciones (0, 50, 100 y 200 g /ml). Los niveles de fosforilación de mTOR, p70S6K y 4EBP1 se cuantificaron mediante el análisis con el software Image J. GAPDH se utilizó como control de carga. (B, C y D) Las intensidades de las bandas (niveles de fosforilación) de cada moléculas de señalización se cuantificaron mediante el análisis con el software Image J. Los datos mostrados son las medias ± SD de tres experimentos. Diferencia significativa del grupo de control, * p & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01.
Las células (A) fueron pretratadas con U0126 (10 o 20 mM) (A), LY294002 (10 o 20 mu M ) (B), o rapamicina (1 o 2 mM) (C) durante 2 horas y después se incubaron en ausencia o presencia de fucoidan (25 mg /ml) durante 48 hr. Las alteraciones de MMP-2 actividades fueron cuantificados midiendo las intensidades de las bandas utilizando el software Image J. Los datos mostrados son las medias ± SD de tres experimentos independientes. Diferencia significativa del grupo de control, * p & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01
células A549 se incubaron durante 24 h con fucoidan a diversas concentraciones (0, 50, 100 y 200 g /ml). . (A) El extracto citosólico se prepararon y analizaron por Western Blot con fosfo-IkB y fosfo y total- NF-kB (p65). (B, C y D) El nivel de fosfo-kappa B y phosphor- y el total de NF-kB se cuantificaron mediante el análisis con el software Image J. GAPDH se utilizó como control de carga en la fracción citosólica y Lamin B estaba cargando de control en la fracción nuclear. Las intensidades de las bandas de cada uno moléculas de señalización se cuantificaron mediante el análisis con el software Image J. Los datos mostrados son las medias ± SD de tres experimentos. Diferencia significativa del grupo de control, * p & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01
MTT Ensayo para la viabilidad celular
La viabilidad celular se midió mediante MTT (3- (4,5. dimetil-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) ensayo de reducción como se describe anteriormente [15]. Brevemente, las células A549 se incubaron a una densidad de 4 × 10
4 células /pocillo en placas de 24 pocillos durante 24 h. Las células se trataron con varias concentraciones de fucoidan durante 48 h. Después, se añadió MTT colorante (5 mg /ml) a las células y se incubaron durante 3 h adicionales. Después se retiró el medio, DMSO se añadió a las células para la solubilización de sales de formazán generados. La cantidad de sal de formazán se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 540 nm usando GENios® espectrofotómetro de microplacas (PowerWave TMXS BioTek Instruments, Inc., Winooski, EE.UU.
,). la viabilidad celular relativa del tratamiento se calculó como un porcentaje de control tratado con vehículo ([OD de células tratadas - OD de blanco /OD del control - OD de blanco] x 100).
herida migración Ensayo
ensayo de migración celular se realizó utilizando placas de 12 pocillos como se describe anteriormente [16]. Las células A549 se sembraron en placas de 12 pocillos (1 x 10
5 células /ml) y crecido a 80~90% de confluencia para el experimento. Después de aspirar el medio, las células se rasparon con una punta de pipeta estéril de 200 l para crear un rasguño recta. Se lavaron dos veces con PBS para eliminar los desechos celulares y se reemplaza por células completas A549 RPMI 1640. fueron tratados con fucoidan (0, 50, 100, y 200 g /ml) y se incubaron durante 48 hr. La migración celular en el área de la herida fue fotografiado en las etapas de las 0 horas y 48 horas, respectivamente, para el análisis de imágenes de cada tratamiento. El nivel de la migración de células se determinó usando un escáner Hewlett-Packard y software Image NIH (Image J), y luego se expresó como un porcentaje de cada control para la media de la zona de cierre de la herida.
ensayo de invasión de la célula
El comportamiento invasivo de las células A549 fue probada usando kit de cámara de invasión celular (BD Bioscience, San Jose, CA, EE.UU.) [17]. Las células A549 se resuspendieron en un medio RPMI 1640 libre de suero (5 × 10
4 células /200 l) en la ausencia o la presencia de fucoidan (0, 50, 100 y 200 g /ml). Las células fueron sembradas en la cámara superior del filtro recubierto con Matrigel y FBS se añadió 500 l en la cámara inferior de un medio RPMI 1640 que contiene 10%. Después de 48 h de incubación, las células no invasoras se eliminaron de la superficie superior de la membrana de filtro. Las células invasoras en la superficie inferior de la membrana de filtro se tiñeron con cristal violeta durante 1 hora y se enjuagaron con agua y se secaron. Se determinó la cantidad de invadir las células en la superficie inferior de la membrana de filtro usando un microscopio de luz y el software NIH Image (Imagen J).
Gelatina Zymography
MMP-2 la actividad se determinó por zimografía de gelatina [18]. Brevemente, se sembraron células A549 (1 × 10
5 células /pocillo) y se dejaron crecer hasta la confluencia durante 24 hr y se mantuvieron en RPMI 1640 con 10% de FBS. Las células se lavaron con PBS y se incubaron con varias concentraciones de fucoidan (0, 50, 100, y 200 mg /ml) en medio RPMI libre de suero 1640 durante 48 horas. Se recogió el sobrenadante y se mezcla con no reductor tampón de muestra, a continuación a electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% que contiene 0,1% (w /v) de gelatina. Después de la electroforesis, el gel se lavó durante 30 min dos veces con 2,5% Triton X-100 y se incubaron durante 18 h más a 37 ° C para la reacción enzimática de MMPs en tampón de reacción zimografía (NaCl 200 mM, mM CaCl 10
2 , Tris-HCl 50 mM, pH 7,4). A continuación, el gel se tiñó con azul de Coomassie R-250 (0,125% azul de Coomassie R-250, 50% de metanol, 10% de ácido acético) y se destiñó (metanol /ácido acético /agua, 40/10/50, v /v /v ).
Preparación de lisados de células
Después de los tratamientos fucoidan, las células A549 se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo, y después se añadió con 100 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,25% de desoxicolato de sodio, EDTA 150 mM, PMSF 1 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, NaF 1 mM, Na 1
3Vo
4, 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina, 1 mg /ml de pepstatina). La reacción se llevó a cabo la lisis en hielo con agitación durante 3 min y las células se raspó usando goma de policía en tubos de microcentrífuga Eppendorf. Se dejó que las células tomadas de lisar por 30 minutos adicionales en hielo con agitación periódica. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (22.000 x
g
, a 4 ° C durante 30 min) y se recogió y se determinó por su concentración de proteína usando un reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad el sobrenadante resultante, CA, EE.UU.). Las muestras fueron cocidas con tampón de muestra SDS en agua hirviendo durante 5 min.
Western Blotting
Los componentes de la proteína (50 mg) se separaron en gel 12% SDS-poliacrilamida, se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad, CA, EE.UU.), y posteriormente se sometió a análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos primarios específicos para la noche a 4 ° C. Después del lavado, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las transferencias se visualizaron luego utilizando el método de quimioluminiscencia (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) en la película sensible a la luz azul (Fujifilm Corporation, Tokio, Japón). Si es necesario, las membranas fueron despojados y borrados reprobed usando otros anticuerpos primarios. Densitometría análisis se realizó con un escáner Hewlett-Packard y el software NIH Image (Imagen J).
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar (S. D.). Se utilizó el análisis de una vía de la varianza (ANOVA) para evaluar la significación de la diferencia entre los dos valores medios. *
P Hotel & lt; 0,05 y **
P
. & Lt; 0,01 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Fucoidan inhibe la actividad de MMP -2 en células de cáncer de pulmón humano A549
con el fin de determinar la concentración no citotóxica de fucoidan, A549 células fueron incubadas con varias concentraciones de fucoidan (0-1000 mg /ml) durante 24 horas o 48 horas, y a continuación, la viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT (datos no mostrados). Fucoidan no mostró ningún efecto tóxico significativo sobre las células A549 dentro de la gama de concentración de 0 a 200 mg /ml. A concentraciones más altas (400 a 1.000 g /ml), sin embargo, fucoidan inhibió la proliferación celular y la disminución de la viabilidad celular de una manera dependiente de la concentración. Por lo tanto, el presente estudio se aplicó el tratamiento de fucoidan en concentraciones iguales o inferiores a 200 g /ml, a la que no se observó ningún efecto citotóxico significativo de células A549.
La degradación de la matriz extracelular (ECM) es fundamental para la invasión celular, lo que indica la implicación inevitable de las proteinasas que degradan la matriz para el proceso. Por lo tanto, se evaluó el efecto de fucoidan sobre la actividad de MMP-2, tal como una molécula clave de la degradación de ECM, por zimografía de gelatina. Como se muestra en la Figura 1A, fucoidan suprime la actividad de MMP-2 de una manera dependiente de la concentración. Por otra parte, el impacto del fucoidan sobre la actividad de MMP-9 fue concluyente, ya que sólo hay un nivel extremadamente bajo de actividad intrínseca MMP-9 detectable en células A549 (datos no mostrados). la actividad de MMP-2 se redujo en un 36%, 53%, y 72% a los 50, 100, y 200 mg /ml, respectivamente, después del tratamiento con el fucoidan durante 48 horas (Fig. 1B). Los resultados obtenidos mediante zimografía se confirmaron adicionalmente mediante análisis de transferencia de Western. MMP-2 expresión se redujo gradualmente con el aumento de concentraciones de fucoidan (Fig. 1C). El nivel de proteína se redujo en un 38%, 48%, y 60% a los 50, 100, y 200 g /ml, respectivamente. La reducción de la actividad de MMP-2 fue probablemente debido a la disminución de la expresión de MMP-2 (fig. 1B y 1D).
Fucoidan Suprime la migración de las células A549
La migración celular es una medida de potencial metastásico de las células cancerosas. Efectos de fucoidan sobre la migración celular se investigaron mediante un ensayo de curación de la herida. Las células A549 tratadas con fucoidan mostraron una reducción de la migración (Fig. 2A). Como se muestra en la Figura 2B, la migración celular se inhibió en un 25%, 46%, y 57% a 48 hr en la presencia de 50, 100, y 200 mg /ml de fucoidan, respectivamente. En conjunto, estos datos demuestran que el fucoidan puede suprimir la propiedad migratoria de las células de cáncer de pulmón.
Fucoidan inhibe la invasión de las células A549
Para dilucidar efecto inhibidor de fucoidan sobre la invasión de las células A549, que era probado usando el kit de cámara de invasión (BD Bioscience, San Jose, CA, EE.UU.), en el que las células invaden a través de la matriz extracelular, tales como filtro recubierto con Matrigel en la cámara. Como se ilustra en la Figura 3A, el número de células con la invasión (tinción con cristal violeta) redujo notablemente de una manera dependiente de la concentración, lo que sugiere fucoidan pueden inhibir la invasión de las células A549. Los efectos inhibidores de fucoidan sobre la invasión de células de cáncer eran 35%, 68% y 86% a las concentraciones de 50, 100, y 200 mg /ml de fucoidan, respectivamente (Fig. 3B). Estos resultados indicaron que el fucoidan puede inhibir directamente el potencial invasivo de células de cáncer de pulmón.
Fucoidan inhibe la actividad de MMP-2 mediante el bloqueo de ERK1 /2 y PI3K-Akt en las células A549 Rutas
Nuestros hallazgos mostró que el fucoidan inhibe drásticamente la migración, la invasión y la actividad de MMP-2 en células A549. Sin embargo, los mecanismos de señalización responsables del efecto inhibidor del fucoidan sobre la metástasis aún no se han dilucidado. Varias evidencias sugieren que MAPKs (JNK media, ERK 1/2, y P38) juegan un papel importante en la migración de células de cáncer, invasión, y la actividad de MMP-2 [5]. Teniendo en cuenta el fuerte potencial anti-metastática de fucoidan, se ensayó si se puede regular la transducción de señal de MAPKs en células de cáncer de pulmón metastásico. Los resultados de la Figura 4 muestran que fucoidan reducida fosforilación de ERK1 /2 de una manera de la concentración y dependiente del tiempo, mientras que casi no tenía o marginal, en su caso, el efecto sobre p38 y JNK1 /2. Como se muestra en la figura 4A y 4C, un estudio dependiente del tiempo demostró que fucoidan reducido progresivamente la fosforilación de ERK1 /2 de 1 hr a 9 horas después del tratamiento. La Figura 4B y 4D muestran que fucoidan inhibió significativamente fosfato ERK1 /2 de una manera dependiente de la concentración con un efecto inhibidor máximo en la concentración más alta (200 mg /ml). Además de las MAPK, la señalización celular de PI3K /Akt también se ha propuesto como un actor clave en la regulación de la actividad de MMP-2 [19]. Nuestro estudio revela que el fucoidan inhibió marcadamente las fosforilaciones de PI3K y su diana aguas abajo, Akt, de una manera de la concentración y dependiente del tiempo (Fig. 5). Basándose en estos resultados, fucoidan inhibió la actividad metastásica de las células cancerosas de pulmón humano, posiblemente por las supresiones de ERK1 /2 y las vías PI3K-Akt.
Fucoidan Suprime mTOR Signaling
Ha sido informó de que PI3K se asocia con una serie de procesos celulares incluyendo la proliferación, la diferenciación, la apoptosis, la motilidad celular, la invasión y la angiogénesis [20], [21]. La señalización de mTOR se ha surgido especialmente como un efector crucial de la vía de transducción de señales de PI3K en diversos cánceres humanos [22]. Sobre la base de nuestra conclusión de que el fucoidan suprime la vía PI3K-Akt en células de cáncer de pulmón humano, se examinó si el fucoidan modula mTOR y sus moléculas de señalización corriente abajo. Como se muestra en la Figura 6A y 6B, fucoidan inhibió la fosforilación de mTOR de una manera dependiente de la concentración. Además, 4E-BP1 y p70S6K, dos abajo objetivos inmediatos de mTOR y los indicadores de la actividad de mTOR, también se suprimieron significativamente (Fig. 6C y 6D).
Fucoidan Inhibe la actividad de MMP-2 mediante el bloqueo de ERK1 /2 y PI3K-Akt-mTOR vías en las células A549
Para confirmar si la inhibición de la actividad de MMP-2 por el fucoidan se basan principalmente en la supresión de las vías de ERK1 /2 y PI3K-Akt-mTOR, las células A549 fueron premeditados, en el presencia o ausencia de U0126 (un inhibidor de ERK), LY294002 (un inhibidor de PI3K) o rapamicina (un inhibidor de mTOR) durante 2 horas, después se examinan para los efectos del tratamiento fucoidan (Fig. 7). En comparación con los respectivos controles de vehículo, los tratamientos individuales con U0126 (Fig. 7A, carril 3 y 4), LY294002 (Fig. 7B, carril 3 y 4) o rapamicina (Fig. 7C, carril 3 y 4) dio una reducción significativa de la actividad de MMP-2. Los resultados son consistentes con los de los experimentos fucoidan del presente estudio en que la inhibición de MMP-2 puede estar mediada por las modulaciones de ERK1 /2, PI3K-Akt y /o vías de mTOR. Describiendo en detalle, el cotratamiento de U0126 (10 mM y 20 mM) y fucoidan reducen aún más la actividad de MMP-2 en un 66% y 75% en comparación con U0126 solo (46% y 65%) (Fig. 7A). De la misma manera, los tratamientos combinados de LY294002 y fucoidan, además, suprimieron la actividad de MMP-2 en un 65% y 86% en comparación con LY294002 solo (27% y 43%) (Fig. 7B). Sin embargo, a diferencia de otros, la rapamicina y el tratamiento concomitante fucoidan no dio una disminución adicional de la actividad de MMP-2 en comparación con rapamicina sola (Fig. 7C). Todavía no se entiende claramente por qué no había ni aditivos ni efectos sinérgicos de la rapamicina con fucoidan. En resumen, la inhibición de MMP2 por tratamiento fucoidan es, posiblemente, exhibido por las modulaciones de ERK1 /2 y /o PI3K-Akt-mTOR vías. Estos resultados propusieron el potencial terapéutico de fucoidan como un agente anti-metastásico en pacientes con cáncer de pulmón humano.
Fucoidan Reduce la translocación nuclear de NF-kappa B
ruta de NF-kappa B se ha demostrado que depender sobre secuencialmente activado cascadas de quinasa [23]. En la activación, NF-kappa B se transloca desde el citoplasma en el núcleo y regula la expresión de una amplia variedad de genes diana, incluyendo MMPs [5]. Desde NF-kappa B puede desempeñar un papel clave en MMP-2 de la expresión génica, los efectos de fucoidan se evaluó en I? B? Y transducción de señales NF-kB. Como se muestra en la Figura 8A y 8B, fucoidan inhibió la fosforilación de I? B? De una manera dependiente de la concentración, mientras que la I? B? Total se aumentó inversamente por fucoidan. Ser coherente con esto, fosfo-p65, un indicador de la activación de NF-kappa B a través de la degradación de I? B?, Se redujo en el tratamiento de fucoidan (Fig. 8A y 8C), que se acompaña por el aumento de p65 total en la fracción citosólica y su disminución de la fracción nuclear (Fig. 8A y 8D). Los resultados demostraron que el fucoidan inhibió significativamente la activación de NF-kB en las células A549.
Discusión
Es bien sabido que las MMP proporcionan un acceso para las células tumorales a la vascular y los vasos linfáticos, que apoyan el crecimiento del tumor y constituyen una vía de escape para su difusión [24]. Además, las MMP promueven la transformación maligna en las primeras etapas de cáncer y suprimir la apoptosis de células de cáncer y mejorar la angiogénesis, así como destruyen el equilibrio quimiocinas por el sistema de defensa anti-tumor de acogida [25]. En consecuencia, el bloqueo de la actividad de MMPs y de expresión puede conducir al desarrollo de una terapia eficaz en pacientes con cáncer metastásico. Aunque muchos científicos han hecho grandes esfuerzos para desarrollar potenciales agentes anticancerosos de los inhibidores de MMP, la mayoría de los ensayos clínicos no se han completado con éxito aún [26].
En busca de supresores de metástasis eficaces, una amplia variedad de productos naturales y su ingredientes farmacológicos pueden ser una buena fuente de búsqueda de candidatos prometedores, que tiene varias ventajas sobre los productos químicos sintéticos sobre los efectos secundarios y la diversidad farmacóforo. Algunos de ellos procedentes de diversos recursos naturales ya han sido caracterizados como potenciales agentes terapéuticos con actividad anti-metastásico [27]. Entre ellos, el fucoidan se ha puesto de manifiesto que poseen efectos antiproliferativos y citotóxicos en las células de cáncer de mama MCF-7, pero no las células epiteliales mamarias humanas (HMECs) [28]. Recientemente, fucoidan se ha demostrado para inhibir la metástasis a través de MMP-2 /-9 supresión, así como someter a la expresión y secreción de un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [14]. La actividad anti-metastática de fucoidan también se probó en el modelo animal de carcinoma de pulmón de Lewis trasplantado experimental (LLC) [13]. Sin embargo, el mecanismo inhibitorio sobre la metástasis del cáncer no ha sido claramente dilucidado en detalle todavía. Por primera vez, en este estudio, es al menos en parte identificado el mecanismo molecular anti-metastática de fucoidan.
El estado de la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT en ausencia o presencia de varias concentraciones de fucoidan . Fucoidan inhibió el crecimiento celular a 400 g /ml, pero no a entre 0 a 200 mg /ml, en la que la migración y la invasión inhibe eficazmente sin efecto citotóxico significativo. Por lo tanto, los efectos anti-invasivos y anti-migratorias de fucoidan observados desde el presente estudio no dependían de su efecto anti-proliferación. El aumento de la actividad MMP-2 ha sido bien caracterizado en células de cáncer de pulmón humano altamente metastásicas [29]. Sin embargo, MMP-9 aún no es concluyente, ya que sólo hay un nivel extremadamente bajo de MMP-9 detectado en las células de cáncer de pulmón humano A549. Sobre la base de nuestro presente estudio, los efectos anti-metastáticos de fucoidan parecen estar mediados por su actividad inhibidora de la MMP-2. (Figs. 1, 2 y 3). Nuestros resultados muestran que el efecto fucoidan es más como la supresión de la secreción de MMP-2 y /o expresión en lugar de la inhibición directa de su actividad.
2 vía /ERK1 está implicado en el comportamiento invasivo o migratorio de un número de tumores malignos, tales como cáncer de colon, melanoma, cáncer de mama y cáncer de próstata y esto está bien establecida en estudios previos [30] - [32]. Por otra parte, ERK1 /2 regula la adhesión focal y la reorganización del citoesqueleto a través de las fosforilaciones de proteínas del citoesqueleto y específica de adhesión focal, incluyendo paxillin, FAK, la miosina de cadena ligera quinasa [33]. Como se muestra en la Figura 4, el efecto anti-metastática de fucoidan se debe a su inactivación de la vía ERK1 /2 en células de cáncer de pulmón humano A549. Además de ERK1 /2, la señal vía PI3K-Akt se ha demostrado que regulan la invasión y la metástasis de cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC), así como el desarrollo y el progreso de varios otros tumores. Es decir, PI3K sobre-expresión está altamente correlacionado con el desarrollo, invasión y metástasis de NSCLC [34]. Varios otros estudios también han demostrado que la orientación de la vía de señalización de PI3K-Akt con antisentido, ARNsi o pequeños resultados inhibidores de moléculas en la baja regulación de la invasión tumoral y la tumorigénesis en células de cáncer malignas [6], [35].