Extracto
invasión de la célula a través de una matriz tridimensional densa (3D) se cree que dependerá de la capacidad de las células para generar fuerzas de tracción. Para cuantificar el papel de tracciones de células durante la invasión en 3D, se presenta una técnica para medir la energía de deformación elástica almacenada en la matriz debido a las deformaciones de tracción inducida. Las deformaciones de la matriz alrededor de una célula se midieron mediante el seguimiento de las posiciones 3D de perlas fluorescentes firmemente embebidas en la matriz. Las posiciones de cuentas sirven como nodos de un mosaico de elementos finitos. A partir de la tensión en cada elemento y la elasticidad de la matriz conocida, se calculó la energía de deformación local en la matriz que rodea la célula. Aplicamos la técnica para medir la energía de deformación de MDA-MB-231 de carcinoma de mama altamente invasivas y A-125 células de carcinoma de pulmón en geles de colágeno. Los resultados se compararon con la energía de deformación generada por no invasiva MCF-7 de mama y A-549 células de carcinoma de pulmón. En todos los casos, las células contratados localmente la matriz. células de mama y carcinoma de pulmón invasoras mostraron una contractilidad significativamente mayor en comparación con las células no invasivas. la contractilidad superior, sin embargo, no fue universalmente asociada con una mayor capacidad de invasión. Por ejemplo, células de carcinoma de vulva A-431 no invasivos fueron las células más contráctiles entre todas las líneas celulares ensayadas. Como una característica universal, sin embargo, encontramos que las células invasoras asumieron un alargado morfología de huso como en oposición a una forma más esférica de las células no invasivas. En consecuencia, la distribución de la densidad de energía de deformación alrededor de las células invasoras seguido patrones de aumento de la complejidad y la anisotropía. Estos resultados sugieren que no es tanto la magnitud de la generación de la tracción pero su direccionalidad es importante para la invasión de células cancerosas
Cita:. Koch TM, Münster S, N Bonakdar, Butler JP, Fabry B (2012) Fuerzas de tracción 3D en Cancer Cell Invasion. PLoS ONE 7 (3): e33476. doi: 10.1371 /journal.pone.0033476
Editor: Harry Mellor, Universidad de Bristol, Reino Unido
Recibido: 7 Julio, 2011; Aceptado: 15 Febrero 2012; Publicado: 30 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Koch et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyada por el texto siguiente: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FA336 /2-1; Institutos Nacionales de la Salud - Asociaciones de Bioingeniería de investigación NIH-BRP: HL65960. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la migración celular a través de una matriz de tejido conectivo es una parte importante de la función fisiológica normal, por ejemplo durante la curación de heridas, pero es también una característica de comportamiento aberrante visto en la invasión de células de cáncer a través del tejido conectivo. La migración celular en matrices 2D planas, como en un plato de cultivo de tejido de plástico común, se ha descrito como un proceso cíclico que implica la polarización, la formación saliente en el borde delantero, la generación de la tracción por la maquinaria acto-miosina de las células, y retracción en la parte trasera extremo de la célula [1]. las fuerzas de arrastre inercial y viscosos son insignificantes, y se necesitan tracciones de células sólo para la propagación de células y para superar las fuerzas de adhesión integrina mediada.
La migración celular a través de una red 3D densa de proteínas de matriz extracelular, a diferencia de la migración 2D, sólo es posible cuando la célula genera suficientes tracciones para superar el impedimento estérico de los alrededores [2]. La velocidad de migración de las células en una matriz 3D se correlaciona con los desplazamientos máximos de la matriz, que son indicativos de las fuerzas de tracción que estas células ejercen [3]. Las células en las que se inhibe la contracción acto-miosina no son capaces de migrar a través de matrices densas 3D [4]. Estos resultados conducen a la hipótesis de que las células cancerosas que generan altas tracciones son más invasivos que las células con tracciones inferiores. En este estudio se presenta un método por el cual estos tracciones pueden ser cuantificadas, y se prueba esta hipótesis en líneas celulares de carcinoma de manera diferente invasivos.
tracciones de células 2D se pueden medir mediante la observación de los desplazamientos de los granos embebidos en una plana flexible sustrato gel en el que se cultivan las células. Matemáticamente, esto es un problema mal planteado a la que varios enfoques se han desarrollado con éxito [5]. Early enfoques invertida la relación entre los desplazamientos y tracciones de una célula en un semiespacio elástico utilizando regularización semi-infinito [6] o de Fourier [7] métodos. Esos enfoques se refinaron recientemente para tener en cuenta un espesor finito del sustrato elástico [8], [9], [10], para mejorar la resolución espacial [11], y para incluir componentes de tracción normales al sustrato [12].
cuentas también pueden dispersarse en sistemas de cultivo celular en 3D para estimar la contractilidad celular durante la migración [13], [14]. Usando este enfoque, tracciones de células en 3D y su distribución espacial se midieron recientemente por primera vez mediante la extensión de las ideas de 2D microscopía de tracción a la tercera dimensión [15]. Este nuevo método es técnicamente y computacionalmente implicados, sin embargo, y requiere de un gel de polímero sintético con propiedades elásticas lineales como una matriz 3D. Aquí presentamos un método para cuantificar la contractilidad 3D de las células en prácticamente cualquier red biopolímero usando un microscopio de fluorescencia estándar. El método es computacionalmente eficiente y robusto frente al ruido de medición. En lugar de calcular el mapa de tracción completa en 3D de la célula, se mide la energía de deformación y su distribución de la densidad de la matriz extracelular 3D células aisladas alrededor. Este método proporciona una medida escalar para el contractilidad celular total. El código fuente de todos los programas necesarios para llevar a cabo las mediciones se proporciona en apoyo S1 Información de archivo.
Hemos utilizado este método para comparar la capacidad de contracción de varias líneas de células tumorales con capacidades diferentes para invadir una red de colágeno denso. Se demuestra que se requiere una alta contractilidad, pero no es suficiente para la invasión a través de una red densa 3D; algunas células tumorales no invasivas también pueden generar altas fuerzas contráctiles pero carecen de la capacidad para dirigir esas fuerzas para impulsar su locomoción.
Resultados
Medición de la energía de deformación
Para medir la energía de deformación que las células gastan para deformar su entorno de tres dimensiones, las células están incrustadas ya sea dentro de colágeno monomérico antes de la polimerización, o se cultivan en una superficie de gel de colágeno y después se dejó invadir espontáneamente en la mayor parte de colágeno. En ambas condiciones, las células se extienden y se extienden en la estructura de colágeno poroso y ejercen fuerzas de tracción que deforman el gel. La energía así gastado se almacena como energía de deformación elástica en los geles. Mediante la medición de la deformación de los geles de colágeno, es posible calcular la energía de deformación si se conocen las propiedades mecánicas elásticas de la matriz de colágeno.
deformaciones de gel se determina a partir de la medición de las posiciones de perlas de marcador fluorescente que están incrustados en todo el gel. Registramos todas las secciones ópticas 2 micras a través de todo el espesor (~ 500 micras) de los geles (película S1). El uso de un algoritmo de diferencia-con-interpolación, podemos resolver los desplazamientos del talón con resolución sub-píxel (información de apoyo Texto S1). La exactitud de la medición de desplazamiento de Ø 1 micra bolas al aumento de 10x es de 22 nm en el plano xy y 130 nm a lo largo del eje óptico
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En este estudio utilizamos geles de colágeno reconstituido que se forman espontáneamente durante auto -montaje de las redes de fibra de colágeno (Fig. S1a). A una concentración de colágeno de 2,4 mg /ml, estas redes forman una estructura porosa con un tamaño medio de poro de 1,3 micras [16]. En una escala de longitud mayor que 10 micras, la morfología de la red puede ser considerado como homogéneo e isotrópico [16]. La distancia media entre las perlas fluorescentes incrustados es ~ 24 mm (fig. S1b), que es mucho más grande que el tamaño de los poros para que podamos usar una aproximación continua para describir las propiedades mecánicas de la red de colágeno. Para una validación de esta aproximación ver información de apoyo Texto S1 (Fig. S8, S9). Las mediciones con un reómetro de cono placa revelaron una respuesta predominantemente elástica de la red de colágeno (Fig. S1d). geles de colágeno también exhiben un comportamiento no lineal con la cepa prominente de refuerzo (Fig. S1c), pero para las cepas de hasta 5%, las propiedades del material pueden ser aproximadas por un comportamiento elástico lineal con un módulo de corte
G
de 118 Pa. Destacamos en esta aproximación en Discusión
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la energía de deformación de las células en geles de colágeno se calcula a partir de los desplazamientos de cuentas entre el estado deformado y no deformado de los geles. El estado no deformado, libre de fuerzas del colágeno se obtiene por tratamiento de las células con 4 M citocalasina D que interrumpe el citoesqueleto de actina y suprime la generación de la fuerza (Película S2). Las posiciones de talón del gel no deformada se utilizan para teselados el microambiente extracelular y sirven como los nodos de esquina de elementos finitos tetraédricos (Fig. S3). Los desplazamientos de talón a continuación, dan lugar a una energía de deformación en cada elemento finito. La energía de deformación de un elemento, normalizado por el volumen elemento, da la densidad de energía de deformación (información de apoyo Texto S1).
Este método de derivar la deformación del material a partir de un mosaico de posiciones medidas es sensible al ruido de medición, y se debe tener cuidado para suprimir su contribución a los resultados de energía de tensión. Este efecto es debido al hecho de que la energía de deformación es una función cuadrática del campo de desplazamiento. Por lo tanto, el valor esperado de las contribuciones de ruido es distinto de cero, incluso si el ruido fluctúa en torno a cero. energías de deformación erróneas de ruido puede evitarse en gran medida la identificación y eliminación de elementos tetraédricos que son planas en el sentido de la plana casi degeneración (Fig. S4, S5), y restando una línea de base de energía de deformación determinado experimentalmente causada por el ruido del grano de desplazamiento (Fig . S6 y la información de apoyo Texto S1).
la densidad de energía de deformación se distribuye en patrones complejos en el volumen que rodea a la célula (Fig. 1). En general, la densidad de energía de deformación es más alta en las proximidades de la célula, en particular cerca de los polos de la célula, y cae rápidamente a niveles insignificantes en todas las direcciones fuera de la celda. La energía de deformación total se obtiene integrando la densidad de energía de deformación sobre un gran volumen alrededor de la célula. Nuestro método incluye el volumen de la celda en sí, suponiendo que para tener un módulo de elasticidad similar a la de la matriz extracelular -. Destacamos en esta suposición en Discusión
densidad de energía de tensión alrededor de un carcinoma de mama alargado MDA-MB-231 celular incrustado ~ 400 micras de profundidad en un gel de colágeno. Un isosuperficie de energía de deformación se muestra con recortes proyectados a los planos de coordenadas según lo indicado por los planos transparentes. La densidad de energía de deformación es más alta en las proximidades de los polos de la célula y se desintegra rápidamente en todas las direcciones fuera de la celda. La integración de la densidad de energía de deformación da la energía de deformación total y fue de 3,7 PJ en este ejemplo. La barra de escala es de 50 micras.
Energía de deformación de las células de carcinoma invasivos y no invasivos
Para probar la hipótesis de que las células de carcinoma invasivo generan tracciones más altas en comparación con las células no invasivas, que mide la energía de deformación 3D de las células invasoras (A-125 de pulmón y MDA-MB-231 células de carcinoma de mama), y de las células no invasivas (A-549 de pulmón, MCF-7 de mama y A-431 células de carcinoma de vulva (ATCC -LGC-Promochem, Wesel, Alemania)). La invasividad de estas líneas celulares se determinó mediante siembra de las células en un gel de colágeno de espesor y lo que les permite invaden los geles. Después de tres días, se midió el perfil de invasión como la distribución espacial de la densidad de células a varias profundidades de gel [17]. La mayoría de las células de las líneas celulares no invasivos fueron incapaces de invadir en la masa del gel de colágeno, y las pocas células que no invaden permanecieron cerca de la superficie (Fig. 2a). las células invasoras, por el contrario, eran capaces de invadir profundamente en los geles
a (Fig. 2a):. perfiles de invasión de la A-125 y A-549 de pulmón, MDA-MB-231 y MCF-7 de mama y A-431 células de carcinoma de vulva. Las células se sembraron en la superficie de geles de colágeno y se dejaron difundir e invadir durante 3 días. El perfil de invasión vs. profundidades de gel describe la probabilidad acumulada de la búsqueda de una célula a una profundidad dada. células invasoras se caracterizaron por su capacidad para invadido profundamente en los geles. b: Energía de deformación de las células de carcinoma no invasivas e invasivas. pulmonar invasiva (n = 36) y de mama (n = 33) células de carcinoma generan significativamente más altas energías de deformación en comparación con el de pulmón no invasiva (n = 49) y de mama células (n = 31) de carcinoma. células de carcinoma de vulva no invasivos (n = 35), sin embargo, generan la mayor energía de tensión de todas las líneas celulares ensayadas (Fig. S10). c: La anisotropía de la forma celular. Las células no invasivas son significativamente más redondo en comparación con las células invasoras. d: La anisotropía de la densidad de energía de deformación es significativamente mayor en invasivo en comparación con células no invasivas. Debido a que los valores de energía de anisotropía de deformación y de diferentes células siguen una distribución logarítmica normal (información de apoyo Texto S1, Fig. S10, S11, S12), la media geométrica ± error estándar geométrica se muestran en la Fig. b-d.
Para las mediciones de energía de tensión, las células fueron incorporados en los geles antes de la polimerización, y se seleccionaron las células aisladas en la región central del gel para las mediciones. Tanto las células de pulmón y carcinoma de mama invasivo generado tracciones 3D considerablemente más altas que las células del pulmón y carcinoma de mama no invasivas, como se refleja en la energía de deformación significativamente mayor de las células (Fig. 2b). La contractilidad alta, sin embargo, no siempre se correlaciona con la invasión de células. Encontramos que las células no invasivas A-431 de carcinoma de vulva fueron sorprendentemente contráctil (Fig. 2b). Además, las células de carcinoma de pulmón invasivo eran 4 veces más contráctil de las células de carcinoma de mama invasivo, sin embargo, eran menos invasiva (Fig. 2a).
Hemos observado que las células de carcinoma invasoras tanto del pulmón y el de mama tenían una alargado morfología de huso como, las células no invasivos, mientras que tenían una forma más redonda (Fig. 3a-e). Se cuantificó la anisotropía forma de la célula por la relación de máxima a valores propios mínimos de los segundos momentos del contorno celular. Un valor de 1 corresponde a una forma circular, y el aumento de los valores a las formas más alargadas. líneas de células invasoras mostraron una significativamente mayor anisotropía forma de las células en comparación con las células no invasivas (Figura 2b).
a-e:. campos Desplazamiento (proyectadas en el plano xy, normalizadas con respecto a los desplazamientos más grandes) alrededor invasiva y células de carcinoma no invasivo. Las células no invasivas contraigan los geles más isótropa. células invasivas generan campos de desplazamientos altamente anisótropas con grandes desplazamientos en los polos de la célula y una región de relativamente pequeños desplazamientos cerca del centro de la célula. f-j: campos de desplazamientos en 3D de las mismas células que se muestran en a-e. k-o: Colar la densidad de energía en torno a las mismas células como se muestra en a-e. Un isosuperficie cerrado de la densidad de energía de deformación (30% del valor máximo) se muestra con los recortes proyectados a los planos coordenados. La densidad de energía de deformación se distribuye más isótropa alrededor de las células no invasivas con isosuperficies casi esféricos, y se distribuye más anisotrópicamente alrededor de las células invasoras con formas isosuperficie complejos.
anisotropía forma de la célula se acompaña de una distribución anisotrópica de tracciones celulares y energía de deformación alrededor de la célula (Fig. 2c). Se cuantificó la anisotropía energía de deformación de nuevo por la relación de máxima a valores propios mínimos de los segundos momentos de la densidad de energía de deformación alrededor de una célula. La energía de deformación se distribuye de manera más anisotrópica alrededor de las células invasoras mientras que las células no invasivas contrajeron el gel más isótropa en todas las direcciones.
Se puede comprender mejor el papel de la distribución de la fuerza anisotrópico durante la invasión de células de carcinoma se puede obtener mediante la combinación de energía de deformación mediciones de la densidad con la grabación de lapso de tiempo. MDA-MB-231 células de carcinoma de mama invasivo adaptan sus estados contráctiles (Fig. 4B) en concierto con su migración a través del gel. imágenes con lapso de tiempo de un espectáculo célula representativa que los cambios direccionales en la densidad de energía de deformación locales preceden al cambio en la dirección de migración (Fig 4g-j; ver Fig. S15, S16 y S17 y S4 película de conjunto de datos completo.). Un conjunto de datos de contraste muestra una medición de lapso de tiempo de una célula de carcinoma de la vulva altamente contráctil, pero no invasivo. comportamiento contráctil de la célula (Fig. 4a) también no es estática, aunque las fluctuaciones son más pequeñas en comparación con las células invasoras (Fig. 4b). Es importante destacar, sin embargo, la célula no es capaz de generar una distribución anisotrópica de tracciones y energía de deformación durante períodos prolongados de tiempo (Fig 4c-f; ver Fig. S13, S14 y de la película S3 para conjunto de datos completo.), Y por lo tanto la red el movimiento de la célula es insignificante (información de apoyo Texto S1)
a:. Evolución temporal de la energía de deformación total de alrededor de un carcinoma de la vulva de células no invasiva (a-431) en un gel de colágeno 3D. La referencia cero de energía se midió después de liberar la tensión citocalasina D-inducida. La energía de deformación total fluctúa en alrededor de ± 25% en torno a un valor medio de alto. b: Evolución temporal de la energía de deformación total de alrededor de un celular de carcinoma de mama invasivo (MDA-MD-231) en un gel de colágeno 3D. La energía de deformación muestra grandes fluctuaciones de alrededor de ± 50% alrededor de la media. c-j: series de tiempo de las imágenes de campo claro de una célula no invasivo carcinoma vulva (A-431) (c-f) y una invasiva MDA-MB-231 de células de carcinoma de mama (g-j) en un gel de colágeno 3D. Superponen son curvas de nivel que muestran los cambios relativos en la densidad de energía de deformación entre dos intervalos de tiempo posteriores. colores azules indican regiones en las que se relajó la tensión entre los pasos sucesivos de tiempo, y los colores rojos indican las regiones donde aumenta la tensión. La forma de la célula se expone en blanco para mayor claridad. flechas de color azul oscuro indican la dirección del movimiento de las células entre los dos pasos de tiempo (ver Fig. S13, S14, S15, S16, S17 y Películas y S3 y S4 para más detalles).
Discusión
La energía de deformación que las células ejercen sobre su entorno es una medida escalar robusta de tracciones de células en una matriz de biopolímero 3D tal como un gel de colágeno. El método es computacionalmente eficiente; el análisis de aproximadamente 10.000 desplazamientos de cuentas entre dos imagen consecutiva apila junto con la evaluación del mapa de densidad de energía de deformación resultante tarda sólo unos minutos en un equipo de escritorio estándar. Además, el método se puede implementar fácilmente en cualquier microscopio de fluorescencia con un motorizado z-enfoque.
El método se basa en varias suposiciones de simplificación. En primer lugar, descuidamos la estructura fibrosa de la red del gel de colágeno y lo describen como un continuo. deformaciones de gel se muestrean en los lugares de talón, y el campo de deformación entre las perlas se calcula mediante una interpolación tri-lineal. En la escala de longitud de una separación media gota de 24 micras (Fig. S1b), este enfoque es una buena aproximación, pero subestima la verdadera energía de deformación (Fig. S7).
En segundo lugar, asumimos que las propiedades del material elástico lineales e ignorar la cepa de refuerzo de respuesta de la matriz. Esto conduce a una subestimación de la energía de deformación absoluta especialmente para las células altamente contráctiles en matrices altamente no lineales. Esto no es un defecto intrínseco de nuestro método, sin embargo. La matriz de rigidez lineal del colágeno puede ser fácilmente reemplazado por un modelo constitutivo no lineal para los geles de colágeno (información de apoyo Texto S1). Alternativamente, el régimen lineal de las redes de biopolímero fibrosos se puede ampliar mediante la adición de un hidrogel [18].
En tercer lugar, las propiedades mecánicas de la célula se supone que son el mismo que el gel de colágeno que rodea, y la energía de deformación se calcula sobre todo el volumen, es decir, el colágeno que rodea la célula y el volumen ocupado por la propia célula. Sin embargo, como el volumen de la celda es pequeño - típicamente menos de 3 elementos tetraédricos - el error resultante es insignificante
Una limitación inherente de los ensayos de tracción en 3D es que las células pueden degradar de forma local, sintetizar y reticular la matriz extracelular y. por lo tanto alterar las propiedades mecánicas de la matriz. Para minimizar la remodelación de la matriz global, mezclamos sólo un pequeño número de células con el gel antes de la polimerización. Cualquier cambio locales en las propiedades mecánicas de la matriz a continuación, se puede suponer razonablemente que limitarse a un volumen alrededor de la célula que es pequeño comparado con el volumen de gel típico con densidades de energía de alta tensión
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Mientras que nuestra técnica no puede proporcionar una tracción detallada mapa sobre la superficie celular, que ofrece varias ventajas en comparación con los enfoques recientemente desarrollados. La distribución de la densidad de energía de deformación se resuelve con una resolución espacial suficiente para distinguir las zonas de alta y baja contractilidad lo largo de la forma de la célula. Junto con el campo de desplazamiento, esta es una información adecuada sobre la contractilidad celular 3D para muchas cuestiones biológicas. Además, la distribución de energía de deformación se puede integrar sobre el volumen de la matriz que rodea la célula para obtener una sola, escalar y medida biológicamente relevante de la contractilidad celular - la energía total de deformación. Lo más importante, nuestra técnica se puede utilizar para medir 3D contractilidad celular en cualquier red de biopolímero. Si la red biopolímero no es lineal sino una aproximación lineal se utiliza para el cálculo de la energía de deformación, habrá inevitablemente algún error en las densidades de energía de tensión en aquellas áreas donde la tensión inducida por células de alcanzar el régimen no lineal. Sin embargo, este error no es degenerativa en el sentido de que se produce sólo una vez en cada posición espacial de un elemento y no se propaga a los elementos vecinos (como es el caso de tracciones que son altamente sensibles a los desplazamientos distantes y la matriz no linealidades).
Nuestros datos demuestran que las células invasoras ejercen fuerzas considerables sobre su medio ambiente. La energía de deformación ejercida por MDA-MB-231 células de carcinoma de mama en un (118 Pa) gel 3D suave fue de aproximadamente 10 veces mayor que los valores que se han medido para células cultivadas en rígidas (4,8 kPa) geles de poliacrilamida [17]. Esto es sorprendente, ya que muchos tipos de células se vuelven más contráctil en matrices más rígidos [19]. Especulamos que la dimensionalidad de la matriz circundante puede jugar un papel importante para la capacidad de las células para generar tracciones.
fuerzas de contracción grande, sin embargo, no son suficientes para la invasión celular. Nuestros datos muestran que las células de carcinoma no invasivos son capaces de generar energías muy altas de deformación. Para la invasión de células eficiente, es importante que las tracciones de células se utilizan de manera eficiente por dirigirlos a lo largo de una ruta de migración particular. De acuerdo con este punto de vista, se encontró que la forma de la célula y la distribución de la densidad de energía de deformación son altamente anisotrópicos en células invasivas, pero casi isotrópico en las células no invasivas. Una conexión entre la forma celular anisotrópica y el comportamiento invasivo se ha descrito previamente en las células después epitelial a mesenquimal transición [20], y se ha especulado que el mecanismo de aumento de la capacidad de invasión en estas células es una distribución de la fuerza anisotrópico [21] y la resultado de la coordinación espacio-temporal de la protuberancia, el apego, la generación de la tracción, y la liberación [22], [23]. Los resultados presentados aquí apoyan este punto de vista y el punto a la importancia de la anisotropía de forma y polaridad en la migración de las células. Nuestra técnica ofrece una herramienta para estudiar estos procesos en un entorno 3D.
Métodos
tridimensional ensayo de colágeno
colágeno de cola de rata (colágeno I, Serva, Heidelberg, Alemania ) y colágeno de piel bovina (colágeno G, Biochrom, Berlín, Alemania) se mezclaron en una proporción de 01:01. A continuación, añade 10% en volumen de bicarbonato de sodio (23 mg /ml), perlas de látex fluorescentes de color naranja con 1 m de diámetro (FluoSpheres®, Invitrogen, F8820) y 10% en volumen de 10 × DMEM (Biochrom). La solución se neutralizó con hidróxido de sodio 1N. Aproximadamente 2.000 células se mezclaron en solución de colágeno 1,2 ml y se añadieron a una placa de cultivo de 35 mm. La solución se polimerizó a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO
2 para 1 h. geles de colágeno polimerizado tenían un espesor de aproximadamente 500 micras.
Secciones ópticas
Para cuantificar la deformación del gel 3D, que graban de forma repetida z secciones ópticas equidistantes (2 micras aparte) a través de todo el espesor de gel utilizando una motorizado microscopio de fluorescencia invertido (DMI6000B, 20 × objetivo, NA = 0,4, 0,5 × vídeo acoplador, Leica Microsystems, Alemania) equipado con una cámara CCD (ORCA ER, Hamamatsu Photonics, Alemania). El microscopio fue adicionalmente equipado con una incubadora de carga a medida para mantener las células a 37 ° C, alta humedad y 5% de CO
2. El proceso de medición se automatizó con software personalizado. Para determinar la deformación de los geles de colágeno, se registraron al menos dos pilas de imágenes. La primera pila de imágenes correspondía al estado deformado del gel. La segunda pila de imágenes se registró después de las células fueron tratadas durante al menos 10 minutos con citocalasina D (4 M) para interrumpir el citoesqueleto de actina y para obtener el estado libre de fuerzas, no deformada del gel.
posiciones 3D de perlas
se determinó el desplazamiento 3D de cada cuenta utilizando un algoritmo de diferencias 3D-con-la interpolación se aplica a las dos pilas de imágenes. Las posiciones del talón en la primera pila de imágenes se identifican con un umbral de intensidad simple. Un volumen secundario de 4,5 m x 4,5 m x 14,0 m en las direcciones x, y y z-dirección fue entonces cortada alrededor de cada perla. La posición de la misma del talón en la segunda pila de imágenes se determinó a continuación desplazando el volumen secundario de la primera pila con respecto a la segunda pila hasta que las diferencias al cuadrado de las intensidades de los píxeles se reducen al mínimo (Fig. S2). una precisión inferior al pixel se logró mediante la interpolación tri-lineal de intensidades de píxel. Con este método, los desplazamientos en 3D de los granos se pueden medir con una precisión de 22 nm en los ejes x y la dirección y-, y 130 nm en la dirección z.
Medición de la energía de deformación
Para calcular un campo de deformación continua de las posiciones de talón discreta y sus desplazamientos, se utiliza una aproximación de elementos finitos del gel donde las posiciones de perlas sirven como los nodos de elementos tetraédricos lineales. La malla de elementos finitos se obtuvo de Delaunay teselación. Los desplazamientos de nodo se da entonces por los desplazamientos de cuentas entre dos pilas de imágenes. Cada elemento se le asigna las propiedades del material elástico isótropo lineal (módulo de corte 118 Pa, el coeficiente de Poisson de 0,35). A continuación, la energía de deformación de cada elemento se calcula como el producto de la matriz de rigidez de los componentes de desplazamiento (información de apoyo Texto S1).
Ruido eliminación
El cálculo de energía de deformación de los datos de desplazamiento es sensible a ruido de medición, pero tiene solamente un efecto aditivo que se puede corregir en gran medida para por simple resta. El grado en que se ve afectado un elemento tetraédrico individual depende de su volumen y su forma. Cuanto menor sea el elemento y el plano de su forma, más propenso es a los resultados de energía de tensión espurias. La forma de un elemento puede ser cuantificado con una medida de forma apropiada. Aquí se utiliza una relación de volumen de elemento a la suma de longitudes de sus bordes al cubo. Normalizado por, este valor varía entre 0 (correspondiente a un máximo de elementos degenerados) a 1 (el valor de un tetraedro regular con los 6 bordes de la misma longitud). Los elementos con un factor de forma menor que 0,5 son desproporcionadamente sensible al desplazamiento de ruido y por lo tanto se excluyen del cálculo. Las lagunas en el campo de densidad de energía de deformación por aquellos elementos que faltan son llenados por la interpolación del vecino más cercano. El error de energía de deformación de los elementos restantes se puede calcular a partir del conocimiento de los errores de desplazamiento y se resta de los resultados.
Tumor invasión de células de ensayo
geles de colágeno se prepararon como se ha descrito anteriormente, pero sin la incorporación de perlas fluorescentes. 25.000 células fueron sembradas en la parte superior de la matriz de colágeno y se cultivaron durante 72 h. En este período de tiempo, las diferencias en la invasividad de las células eran claramente visibles. Después de la fijación con solución de glutaraldehído al 2,5% en PBS y Hoechst 33342 núcleos de tinción, se determinaron el número de células invadidas y su profundidad invasión en 50 campos que no se solapan de vista alrededor del centro de los geles. Esta medición se automatizó por software a medida que localiza los núcleos de células en pilas de imágenes grabadas en 2 micras intervalo a través de todo el espesor de los geles.
anisotropía forma de la célula
Para cuantificar las células forma se empleó un análisis de segundos momentos en proyecciones 2D de la célula. Cada célula se esbozó manualmente con un polígono cerrado imagen de contraste de la fase en la en la posición z de mayor nitidez como se define por una medida gradiente Tenenbaum [24]. A continuación se utilizó el polígono cerrado para crear una imagen binaria de la célula,. Una matriz de segundos momentos puede calcularse entonces como, en las coordenadas de píxeles X e Y están centradas en el centro de masa de. anisotropía forma celular se define por la relación de la máxima a valor propio mínimo de. Una célula perfectamente redonda dispondría así de un valor de anisotropía de 1, y los valores crecientes denotar formas cada vez anisotrópicos tales como formas de huso alargado.
Anisotropía de energía de deformación distribución de la densidad
Para caracterizar la anisotropía de la distribución de la densidad de energía de deformación alrededor de una célula, calculamos el segundo momentos de la densidad de energía de deformación como, en las direcciones x, y, z las coordenadas están centradas en el centro de masa de la densidad de energía de deformación. El índice de la anisotropía de la distribución de la densidad de energía de deformación se define entonces como la relación de máxima a valor propio mínimo de los segundos momentos. Por lo tanto, una distribución perfectamente isótropo de la densidad de energía de deformación daría lugar a un valor de 1, y los valores crecientes en este índice son indicativos de las distribuciones con el aumento de anisotropía.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Propiedades de geles de colágeno. a) Sección confocal a través de un gel de colágeno. b) La distribución de distancias grano-grano. c) la relación de tensión-deformación de la red de colágeno medido en un reómetro de cono placa durante una rampa de tensión (velocidad: 1% /s). El comportamiento es aproximadamente lineal para las cepas inferiores al 5%; d) Respuesta de frecuencia medido en un reómetro de cono-placa. La amplitud de las oscilaciones sinusoidales era 5%. El módulo de almacenamiento G 'es de 118 Pa a una frecuencia f de 1 Hz. (5).