Extracto
Antecedentes
receptores de neurotrofinas se identificaron inicialmente en células neuronales. Ellos fueron detectados recientemente en algunos tipos de cáncer en asociación con la capacidad invasora, pero la función de estos receptores tirosina quinasa no se ha investigado previamente en células de cáncer colorrectal (CRC).
métodos y las conclusiones
Se presenta en este documento que las líneas celulares de CRC humanos sintetizan el factor de factor de crecimiento neuronal neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) bajo condiciones de estrés (privación de suero). En paralelo, las células de CRC expresaron alta (TrkB) y de baja afinidad (p75
NTR), los receptores en la membrana plasmática, mientras que TrkA y TrkC, otros dos receptores de alta afinidad para NGF y NT-3, respectivamente, fueron indetectables. Demostramos que BDNF inducida por la proliferación de células y tenía un efecto anti-apoptótico mediado a través de TrkB, según la evaluación de K252a, un inhibidor farmacológico Trk. Se suprime la proliferación celular y la supervivencia de las células de CRC que no expresan TrkA ni TrkC. Paralelamente al aumento de la secreción de BDNF, sortilin, una proteína que actúa como un transportador de neurotrofina, así como un co-receptor para p75
NTR, se aumentó en el citoplasma de las células de CRC primarios y metastásicos, lo que sugiere que sortilin podría regular neurotrofina transporte en estas células. Sin embargo, a favor de BDNF, también detectado en las células CRC, fue co-expresada con p75
NTR en la membrana celular y co-localizada con sortilin. En contraste con BDNF, exógeno apoptosis inducida por CRC BDNF pro, lo que sugiere que un mecanismo de contrapeso está implicado en el control de la supervivencia celular CRC, a través de sortilin como el co-receptor para p75
NTR, el receptor de alta afinidad para pro- neurotrofinas. Del mismo modo, se muestra que BDNF y TrkB transcripciones (y no p75
NTR) se sobreexpresa en los tumores de los pacientes en comparación con sus tejidos normales adyacentes, sobre todo en etapas avanzadas de la CRC.
Conclusión
en conjunto, estos resultados ponen de manifiesto que el BDNF y TrkB son esenciales para el crecimiento celular y la supervivencia CRC in vitro y en los tumores. Este bucle autocrino podría ser de gran importancia para definir nuevas terapias dirigidas
Visto:. Akil H, Perraud A, C Mélin, Jauberteau MO, Mathonnet M (2011) Funciones de Ajuste Fino de factor neurotrófico derivado de cerebro Endógeno , TrkB y sortilin en la célula de supervivencia del cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (9): e25097. doi: 10.1371 /journal.pone.0025097
Editor: Mark P. Mattson, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento Programa de Investigación Intramural, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Julio, 2011; Aceptado: 23 Agosto 2011; Publicado: 26 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Akil et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Ligue contre le Cancer y el Conseil Régional du Limousin. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cerebro-factor neurotrófico derivado (BDNF), un miembro de la familia de las neurotrofinas, se sabe que juega un papel crítico en la modulación de la supervivencia celular, la diferenciación y la apoptosis en el sistema nervioso [1].
señales de BDNF a través de dos tipos de receptores de superficie celular: la alta afinidad de la quinasa relacionada con tropomiosina-(Trk) receptor B (TrkB), un receptor de tirosina quinasa y el receptor de baja afinidad (p75
NTR), así como un receptor de dominio de muerte que pertenece al factor de necrosis tumoral (TNF) de la familia del receptor, un receptor común para todos factor de crecimiento de las neurotrofinas del nervio (NGF), neurotrofina-3 (NT-3), y neurotrofina-4/5 (NT-4/5 ). Las neurotrofinas se sintetizan como precursores (proneurotrophins) que se cortan proteolíticamente para madurar neurotrofinas. Pro-BDNF escisión puede ocurrir ya sea intracelularmente por la acción de la furina o proconvertasa, o extracelularmente por la acción de la plasmina, la metaloproteinasa de matriz 7 (MMP-7) o MMP-9 [2]. Tanto el BDNF maduro y pro-BDNF son biológicamente activos, con papeles divergentes que reflejan diferentes afinidades: pro-BDNF muestra afinidades más altas para p75
NTR, mientras que el BDNF maduro tiene una mayor afinidad por TrkB
Se liga BDNF. el 145 TrkB de longitud completa del receptor y una variante gp95TrkB truncado que conserva las actividades de señalización directa [3] y aumenta la especificidad para BDNF [3], [4], [5]. Mientras que los receptores Trk están implicadas en la mayor parte de las propiedades de supervivencia y crecimiento de las neurotrofinas, las funciones de p75
NTR, ampliamente estudiado en las neuronas, depende del tipo de célula neural, la presencia de ligando, y su asociación a un co- receptor. De hecho, p75
NTR asociado con realza Trk co-receptor [6] o suprimir la supervivencia celular mediada por la neurotrofina-[7]. Recientemente se demostró que ser capaz de unirse a favor de BDNF e inducir la muerte celular cuando se asocia con sortilin (un miembro de la Vps10p-dominio receptores de la familia) [8], [9], [10].
Así , la regulación del procesamiento de pro-BDNF añade control adicional sobre el equilibrio entre p75
NTR y el compromiso TrkB [11], [12]. La función antiapoptótica del BDNF está mediada aunque la interacción con el de alta afinidad de receptores 95 y 145TrkB [5], mientras que pro-BDNF induce la apoptosis a través de la interacción con un complejo de receptor de p75
NTR y sortilin [10], [13].
sortilin se expresa en varios tejidos, especialmente del cerebro, la médula espinal, corazón, músculo, adipocitos [14] y los linfocitos B [8]. Sortilin fue descrita inicialmente en células neurales humanas como una proteína de transporte intracelular de las neurotrofinas y proneurotrophins [15] y, recientemente, como un transportador de Trk receptores de neurotrofinas en las células neuronales [16]. Por otra parte, sortilin también era conocido como un correceptor (NTSR3) para un receptor acoplado a proteína G, el receptor-1 (NTSR1) neurotensina que es activado por la neurotensina [17]. Neurotensina se demostró inicialmente para jugar un papel en el crecimiento y supervivencia de células de cáncer colorrectal (CRC), a través de su unión a este sortilin /NTSR1 complejo [18].
BDNF se ha implicado en la patogénesis y el pronóstico de numerosos tumores malignos humanos, tales como los neuroblastomas [19], [20], el meduloblastoma [21], el cáncer de próstata [22], [23], el cáncer de pulmón [24], el carcinoma de páncreas [25], [26], [27], y carcinoma hepatocelular [28]. En CRC, una sobreexpresión de BDNF [29] y TrkB [30] Recientemente se ha informado en los tejidos de los pacientes, pero no hay ofertas de datos con la función de BDNF como un bucles autocrinos en la supervivencia celular CRC. Dado que la expresión de TrkB está asociado a varios tipos de cáncer; El objetivo de este estudio fue definir las condiciones de la secreción endógena de BDNF y la expresión de receptores de neurotrofinas en el CCR. En este documento, se muestra que BDNF endógeno es secretada por las células de CRC presentados a suero privación e induce la supervivencia celular a través de TrkB receptor tirosina quinasa que se expresa en la membrana de las células estresadas. Es de destacar que TrkB y BDNF expresión fue mayor en los tumores de los pacientes, especialmente en etapas avanzadas. En conjunto, estos datos muestran la importancia de la vía /TrkB BDNF en el crecimiento y la invasividad potencial de la CRC.
Materiales y Métodos
Células y Cultura y
líneas celulares de CRC Humano correspondiente a las etapas de tumores diferentes se adquirieron de la American Type Culture Collection. WiDr [31] y SW480 [32] fueron primaria líneas celulares de CRC-derivados, mientras que las otras dos líneas se derivaron de metástasis de CCR, en los ganglios linfáticos (SW620 derivado del mismo paciente como la línea SW480) [32] y ascitis (COLO 205) [33]. En condiciones basales, se mantuvieron las células WiDr en medio MEM (Gibco) suplementado con inactivado por calor 10% suero fetal de ternera (FCS) (Gibco), piruvato sódico 1 mM (Gibco), aminoácidos no esenciales al 1% (Gibco), 100 IU /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco). SW480, SW620 y COLO 205 líneas se cultivaron en medio RPMI (Gibco) suplementado con 10% FCS, 100 UI /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina, a 37 ° C en atmósfera humidificada y 5% de CO2. Las células cultivadas se destacaron por los de 24 a 72 h de privación de suero. El clon de 35.928,11 (10 g /ml) de ratón anticuerpo monoclonal antagonista anti-BDNF (mAb) se adquirió de Calbiochem. BDNF humano recombinante (100 ng /ml), recombinantes pro-BDNF (4 ng /ml), y K252a (200 nM) fueron adquiridos de los laboratorios Alomone.
Pacientes y muestras de tejidos
Todo tejidos derivados del paciente se recogieron y se archivan, en el Tumorotheque del hospital de la Universidad de Limoges, en virtud de los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional (CA N 2007-34, DC 2008-604 y 72-2011-18). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos de este estudio. Los tejidos tumorales se obtuvieron de 20 pacientes, que fueron sometidos a la extirpación quirúrgica de CRC en el Hospital de la Universidad de Limoges entre enero de 2006 y febrero de 2007. Cuatro pacientes con adenocarcinoma por etapa (según la clasificación pTNM [34]) han sido elegidos para este estudio. Los tejidos de los cuatro pacientes con una enfermedad benigna colorrectal, megadolichocolon, se utilizaron como controles.
RT-PCR análisis
CRC líneas celulares se cultivaron en un medio que contenía o no FCS al 10% durante 24 a 72 -marido. se utilizó SV total del sistema de aislamiento de ARN (Promega) para aislar el ARN total de las líneas celulares como se describe en las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARN extraído se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando el espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Labtech). La pureza del ARN se comprobó mediante la relación DO260 /DO280 nm entre 1,83 y 2,00. La ausencia de degradación del ARN se confirmó por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio. Se realizaron la extracción de ARN de tejidos de los pacientes como se describe [35]. la síntesis de ADNc de primera cadena se generó mediante el uso de superíndice III (Invitrogen). PCR se realizó utilizando Taq ADN polimerasa (Invitrogen). El ARN total aislado a partir de líneas celulares de neuroblastoma humano (IMR32, SH-SY5Y) y células K562 de leucemia humana erythromyeloblastoid se utilizaron como controles positivos. muestras (fabricados por la omisión de la transcriptasa inversa) no transcrito de forma inversa se corrieron en paralelo con las muestras a transcripción inversa para excluir la contaminación de ADN genómico.
Los cebadores fueron diseñados utilizando Primer 3 (proporcionado en el dominio público por el Instituto de Investigación Biomédica Whitehead /MIT Center for Genomic Research, Cambridge, MA, y está disponible en http://www.wi.mit.edu). pares de cebadores diseñados se enumeran, junto con sus temperaturas esperadas dimensiones y recocido en la Tabla 1.
Secuenciación
Después de la extracción de los productos de PCR con Rapid PCR Purification Systems (Marligen Bioscience), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, los productos PCR fueron secuenciados directamente utilizando el Kit de BigDye® Terminator Cycle Sequencing v1.1 (Applied Biosystems) en un termociclador GeneAmp® PCRSystem 2700 (Applied Biosystems). Los fragmentos se purificaron por precipitación con isopropanol. El gel de secuenciación se llevó a cabo en un láser automatizada fluorescente secuenciador de ADN ABI Prism® 3130 × l Analizador genético (Applied Biosystems) y se comprobaron las homologías, utilizando Finch TV, después de la voladura con el BDNF, TrkB145, TrkB95, p75
NTR, y sortilin secuencias de GenBank (NM_001143816, NM_001018064, NM_001007097, NM_002507, NM_002959 y, respectivamente).
Western blot
mouse anti-BDNF (1 mg /ml) y el ratón anti-TrkB (1 mg /ml) anticuerpos (Abs) se adquirieron de R & amp; D Systems, conejo anti-P75
NTR (1 mg /ml), anticuerpo de cabra anti-sortilin (1 mg /ml) y de conejo anti-fosfo-Akt (Ser 473 ; 1 mg /ml) Abs de Santa Cruz Biotechnology, conejo anti-TrkA (1:1000), de conejo anti-TrkC (1:1000) y ratón (1:2000) Abs-Akt contra de Señalización celular Tecnología. Se lisaron cultivos subconfluentes líneas celulares (5 minutos en hielo) en los matraces de cultivo por 1 × tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology) que contiene PMSF 1 mM (Sigma-Aldrich). La suspensión se sometió a ultrasonidos durante 1 min (una pulsación de 40 Hz cada 20 seg) para degradar el ADN cromosómico y se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos. Se recogieron los sobrenadantes y se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de concentración de proteínas Bradford (Sigma). SDS-PAGE se realizó y las proteínas se electro-transfirieron a membranas de PVDF (BioTrace ™). Después de una hora de incubación a temperatura ambiente en solución (leche en polvo 5% no grasa en PBS) de bloqueo, las membranas se expusieron a la Abs primario específico en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C. A continuación, las membranas se lavaron tres veces durante 5 minutos con TBS /0,1% Tween-20 y las inmunorreacciones se detectaron por peroxidasa de rábano picante conjugada con Ab secundario a ratón, conejo, cabra o Ig (DakoCytomation) diluido en 1:2000 en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado, la visualización de los inmunocomplejos se realizó utilizando el Immobilon Western quimioluminiscente HRP Sustrato (Millipore). control de la proteína de carga se realizó con anti-actina Ab (Cell Signaling Technology). Las transferencias Western fueron escaneados utilizando un sistema de bio-imágenes (GeneSnap; Genetool; Syngene). Los análisis densitométricos se realizaron utilizando un programa de software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE.UU. http://rsb.info.nih.gov/ij/). La expresión de proteínas se determinó en unidades relativas en referencia a la expresión de actina.
inmunofluorescencia
Las células cultivadas en cubreobjetos de 12 mm se fijaron con PFA al 4% a temperatura ambiente durante 30 min, y se permeabilizaron o no con 0,1% Triton X-100. La unión no específica fue bloqueada por 30 min de incubación con PBS-BSA al 2% a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C en solución con el Ab primario de bloqueo. Se utilizaron los siguientes Abs: conejo anti-BDNF Ab (1 mg /ml; Santa Cruz Biotechnology), de conejo anti-pro-BDNF Ab (8 mg /ml; Alomone Labs), ratón anti-TrkB Ab (2,5 mg /ml; R & amp; D Systems), de conejo anti-p75
NTR (2 mg /ml; Santa Cruz Biotechnology) y de cabra anti-sortilin Ab (1 mg /ml; Santa Cruz Biotechnology). Las células se lavaron 3 veces en PBS, y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con Alexa Fluor conjugado Abs secundario (Invitrogen) diluido 1:5000 en PBS. Después de 3 lavados en PBS, los núcleos se tiñeron durante 5 minutos con DAPI. Después de lavados intensivos, cubreobjetos fueron invertidos en portaobjetos y se montaron con Dako fluorescente Medio de Montaje (DakoCytomation). Los controles negativos fueron células incubadas con conejo irrelevante normales, ratón, o IgG de cabra (Sigma). Fotos fueron tomadas usando un microscopio confocal (Carl Zeiss, LSM 510); representaciones gráficas de superficie de los datos de fluorescencia se han generado con el programa de software ImageJ.
ELISA
Después de 24 h, 48 hy 72 h de cultivo, se recogieron las muestras de sobrenadante de líneas celulares y se almacena a -80 ° C hasta el día de ensayo. Inmunoensayos Systems (Promega), específicos para BDNF se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como media ± SEM (pg /ml). Al menos tres experimentos independientes se realizaron para cada condición experimental, cada uno con mediciones por triplicado.
Ensayos de proliferación celular
La proliferación celular se midió utilizando el Click-it EdU Alexa Fluor 488 de citometría de flujo ensayo ( Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células (2 × 10
5 por pocillo) se incubaron durante la noche en placas de doce pocillos antes del tratamiento, a continuación, se cultivaron durante 24 h en medio libre de suero con o sin exógeno BDNF, K252a o ambos BDNF y K252a añaden simultáneamente . valores de proliferación se midieron usando un citometría de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences). Los experimentos se realizaron por triplicado, y se recogieron tres conjuntos de 50.000 células para cada condición. Los datos se adquirieron y se analizaron mediante el software FACSDiva BD 6.0 (BD Biosciences). Cada experimento se repitió al menos tres veces.
Apoptosis ensayo
La apoptosis se midió por la detección de nucleosomas solubles citoplásmicos usando un ensayo calorimétrico, Cell Death Kit de detección ELISAPLUS (Roche Molecular Diagnostic) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. Los valores de absorbancia se midieron a longitudes de onda 405-490 nm duales. La absorbancia obtenida en los controles se normalizó a un valor de 1, como [7] se describe anteriormente. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
El análisis estadístico
Significación estadística fue determinada por un solo sentido el análisis de varianzas (ANOVA) con el software Statview 5.0 (Abacus Concepts ).
Los valores P Restaurant & lt; 0,05 se consideró significativo. La media y los valores SEM se obtuvieron a partir de al menos 3 experimentos independientes.
Resultados
líneas celulares de cáncer colorrectal expresan TrkB y p75
NTR pero no los receptores TrkA o TrkC
TrkB y p75
se detectaron expresiones NTR en líneas celulares de CRC bajo basal (10% FCS) las condiciones de cultivo, tanto en los niveles de proteína (Figura 1D) ARNm (Figura 1A) y con algunas diferencias dependiendo de las líneas celulares. Mientras que la longitud total TrkB (TrkB145) y p75
transcripciones NTR fueron predominantes en una primaria (SW480) y una metástasis (SW620) línea (dos líneas de células aisladas de un mismo paciente), las transcripciones más fuertemente expresado (Figura 1A) fueron los de la isoforma truncada (TrkB95) en todas las líneas celulares (Figura 1A), excepto para las células WiDr que expresa TrkB95 y p75
NTR sólo después de un suero de privación de 48 h (Figura 1B). TrkB y p75
secuenciación NTR después de geles de agarosa de elución validados estos resultados. Sin embargo, no se detectaron TrkA y TrkC transcripciones (Figura 1C), así como los receptores de proteínas (Figura 1D), cualesquiera que sean las condiciones de cultivo, en contraste con la línea celular de leucemia K562 erythromyeloblastoid conocido para expresar estos receptores de neurotrofinas [36].
(a): RT-PCR de BDNF, su alto (TrkB) y baja (p75
NTR), los receptores de afinidad, TrkA y TrkC partir de células cultivadas en basal (10% de medio FCS), WiDr (carril: 1 ), SW480 (carril: 2), SW620 (carril: 3), COLO 205 (carril 4). los niveles de ARNm de GAPDH se utilizó como control interno. control positivo (carril 5) fue la línea celular de neuroblastoma (IMR32) para BDNF, TrkB y p75
NTR; y las células de la leucemia erythromyeloblastoid (K562) para TrkA y C. Un resultado representativo de al menos tres a cinco experimentos independientes. (B) Comparación de TrkB95 y p75
NTR en ARN total extraído de células WiDr cultivadas en 10% de FCS o después de 24-72 h privación de suero (0% de FCS). TrkB95 y p75
NTR mRNA /mRNA GAPDH cuantificación de las intensidades de banda evaluadas por densitometría aparecen arriba carriles y se expresa en unidades arbitrarias (media de tres experimentos independientes). (C) El mismo experimento: RT-PCR de TrkA y TrkC en ARN total extraído de células WiDr cultivadas en condiciones de cultivo basal (10% FCS) y después de 24 a 72 h de privación de suero en comparación con el control positivo (K562) (D) La expresión de pro-BDNF y BDNF, TrkB larga duración 145 y TrkB truncada 95 y p75
NTR proteínas en líneas celulares de CRC cultivadas en FCS al 10%. TrkA y TrkC no fueron detectados. La actina se utilizó como control de carga de proteína. WiDr (carril: 1), SW480 (carril: 2), SW620 (carril: 3), COLO 205 (carril 4). control positivo (carril: 5) fueron células IMR32 para BDNF, pro-BDNF, TrkB y p75
NTR y las células K562 o TrkA y TrkC. Un resultado representativo de al menos tres experimentos independientes.
CRC células producen BDNF endógeno
Desde el CRC expresó receptores TrkB, se realizaron búsquedas para una producción endógena de BDNF, TrkB un ligando. BDNF mRNA se detectó en todas las líneas celulares estudiadas bajo basal (FCS 10%) las condiciones, sobre todo en las dos líneas primarias (CRC WiDr y SW480). Curiosamente, después de la privación de suero durante 24 a 72 h, los niveles de mRNA del BDNF (Figura 2A), así como la proteína BDNF maduro (17 kDa) detectada por Western blot en los lisados celulares, se mejoraron en las cuatro celdas de CRC (Figura 2B), como se muestra por los valores de densitometría (proporciones de BDNF /GAPDH para relaciones de ARNm y BDNF /actina de proteínas) (Figura 2A, B). Además, la secreción de BDNF se detectó por ELISA en el sobrenadante de cultivo de líneas celulares de CRC. liberación de BDNF se incrementó significativamente por la privación de suero en las dos líneas celulares primarias WiDr y SW480 CRC (Figura 2C y la Tabla 2), mientras que, sin que se mejoró significativamente en SW620 metastásico y COLO 205 líneas celulares de CRC (Tabla 3). privación de suero condujo a un aumento de los niveles de BDNF en el citoplasma de estas cuatro líneas de células como se muestra para SW480 en la Figura 2D. La cuantificación de la intensidad de fluorescencia verde en cada condiciones de cultivo confirman las conclusiones de las imágenes de fluorescencia (Figura 2D) y reforzó los resultados obtenidos por Western Blot.
producción (A) BDNF evaluada por RT-PCR de ARN total extraído de células cultivadas en condiciones basal (10% FCS) y de 24 a 72 h de privación de suero. La cuantificación de las intensidades de banda se muestra como anteriormente (media de tres experimentos independientes). expresión (B) BDNF por Western Blot (en referencia a la actina) en la proteína celular total extraído de líneas de células cultivadas en condiciones basales (10% FCS) y después de 24-72 h de privación de suero (0% de FCS). Según los análisis densitométricos, la cuantificación mostró un incremento en la expresión significativa de BDNF en las células cultivadas. Los histogramas son medias ± SEM de al menos tres experimentos independientes. **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
p
& lt; 0,001, en comparación con las condiciones de cultivo basal. (C) La secreción de BDNF evaluó mediante ELISA en el sobrenadante de las líneas celulares WiDr y SW480 bajo condición basal (10% FCS) y después de 24 a 72 h de privación de suero (0% de FCS). Los resultados se expresan como la media ± SEM de los triplicados de tres experimentos diferentes. ***,
p Hotel & lt; 0,001, en comparación con las condiciones de cultivo basal. (D) Comparación de la expresión de BDNF por SW480 células cultivadas en 10% de FCS y después de 72 h de privación de suero. La microscopía confocal con anti-BDNF Ab y Alexa Fluor 488-conjugado (verde) y núcleos contador manchada con el azul fluorescente DAPI mancha de ADN. cuantificación relativa se evaluó mediante la representación gráfica de superficie verde fluorescente. Imágenes eran representativos de al menos tres experimentos independientes. Las barras de escala, 10 m. Se observaron resultados similares con las otras tres líneas (datos no mostrados).
Suero hambre induce la expresión de TrkB membranosa y su colocalización con BDNF
El hallazgo BDNF endógeno que se secreta en condiciones de privación de suero nos ha llevado a buscar la expresión de su receptor de alta afinidad. En basal (que contenía FCS) culturas (Figura 3A, C), el TrkB receptor de alta afinidad y su ligando BDNF fueron secuestradas en todas las líneas celulares de CRC. A la privación de suero de 24 h indujo una reubicación de TrkB a la membrana celular (Figura 3B, D). Curiosamente, se detectó una colocalización de TrkB y BDNF en la membrana en todas las líneas celulares estudiadas y alcanzó un máximo a las 72 h de privación, como se muestra para WiDr y células COLO 205 (Figura 3B, D). Se obtuvieron patrones de tinción similares para SW480 y SW620 (datos no mostrados). La co-expresión en la membrana de ambos TrkB y BDNF endógeno sugiere que BDNF y TrkB podrían estar implicados en un bucle autocrino en las células estresadas CRC
.
La microscopía confocal de WiDr (A, B) y COLO 205 (C, D ) las células teñidas con un Ab anti-BDNF (rojo), anti-TrkB mAb (verde) o ambos (overlay) cultivadas con 10% de FCS (A, C) o después de 24 h de privación de suero (B, D). En condiciones de cultivo basal (10% FCS), TrkB y BDNF fueron secuestradas en el citoplasma (flechas) en WiDr (A) y células COLO 205 (C). Los mismos patrones de tinción se obtuvieron con las otras dos líneas celulares (datos no mostrados). Después de la reubicación privación de suero a la membrana celular y colocalización de TrkB y BDNF (amarillo en fusionadas, flechas) fueron detectados en WiDr (B) y COLO 205 (D). Imágenes eran representativos de al menos tres a cinco experimentos independientes.
BDNF promueve la proliferación y supervivencia de las líneas celulares de CRC a través de TrkB
Para determinar la función de este sistema ligando-receptor en el la proliferación y la supervivencia de WiDr, SW480, SW620 y COLO 205 CRC células, proliferación y apoptosis ensayos se realizaron con exógenos BDNF ya sea en FCS-libre o en 10% de cultivos FCS contienen. Después de un cultivo de 24 h en medio libre de suero, exógeno BDNF aumentó significativamente la proliferación de todas las líneas celulares estudiadas, en contraste con la ausencia de efecto en la presencia de 10% de FCS (Figura 4A y Tabla 2, 3). Desde TrkB se expresa en la superficie de las células estresadas, la hipótesis de su posible papel en la proliferación celular en tales condiciones. De hecho, la adición de K252a, un inhibidor de Trk [37], suprimió el efecto proliferativo de exógena BDNF en cultivos libres de suero en todas las líneas celulares estudiadas (Figura 4A) lo que sugiere que BDNF endógeno estaba implicado en el crecimiento celular a través de TrkB (Fig. 4A y en la Tabla 2, 3). A fin de evaluar el papel de TrkB y BDNF en la supervivencia celular CRC estresado, la apoptosis se evaluó por los niveles citoplasmáticos de nucleosomas solubles en cultivos con y sin BDNF exógeno o K252a. Después de una privación de suero de 24 h, WiDr, SW480, SW620, y COLO 205 células estimuladas con exógeno BDNF había disminuido significativamente las proporciones de apoptosis, mientras que no se observó efecto significativo en células mantenidas en medio normal (Figura 4B, C y en la Tabla 2, 3 ). Por otra parte, 200 nM K252a aumentó las proporciones apoptóticos de WiDr, SW480, SW620, y COLO 205 (Figura 4B, C y en la Tabla 2, 3). Los resultados obtenidos después de la hambruna 48 y 72-h suero confirmaron estos datos (Fig. 4B, C), lo que sugiere que la proliferación de células de CRC puede estar mediada por una vía de señalización de BDNF /TrkB.
(A) Papel de BDNF endógeno y su receptor TrkB sobre la proliferación celular CRC: efectos del BDNF exógeno y la supresión de los receptores TrkB endógena sobre la proliferación celular. Las cuatro líneas de células se cultivaron durante 24 h en medio libre de FCS (FCS 10%, -) en presencia de BDNF exógeno (+), K252a (+) solo o en combinación. La proliferación celular se determinó por análisis de citometría de flujo utilizando EdU Alexa Fluor 488. Los datos se presentan como histogramas de la proliferación de células en unidades relativas ± SEM de cinco experimentos independientes. *,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
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& lt; 0,001, en comparación con medio libre de suero. (B, C) Efectos del BDNF exógeno y la supresión de receptor TrkB endógena sobre la supervivencia celular. relaciones apoptótica de nucleosomas solubles se detectaron mediante ELISA celular para WiDr, SW480, SW620, y COLO 205 inducidas por la privación de suero solo (FCS 10%, -) o en asociación, ya sea con BDNF exógeno (+), o con K252a (+), durante 24 a 72 h de privación de suero. Los histogramas, significan proporción de células apoptóticas ± SEM de al menos tres experimentos independientes. *,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
p Hotel & lt; 0,001, en comparación con la condición de libre de suero solo. (D, E) Relación de apoptosis después de 24 h de privación de suero solo (0% de FCS) o con la combinación con un neutralizante anti-BDNF mAb (0% anti-BDNF). Los histogramas, significan proporción de células apoptóticas ± SEM de tres experimentos independientes. *,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
p
. & Lt; 0,001, en comparación con la condición de libre de suero sola
Para definir la vía de transducción de señales inducida por la activación /TrkB BDNF, se realizaron búsquedas de Akt fosforilación en dos líneas celulares de CRC después del tratamiento BDNF. De hecho, el Western Blot reveló que la exposición de WiDr o SW480 de BDNF después de una privación de suero de 16 horas, induce la fosforilación de Akt (Ser 473) después de 5 minutos, alcanzó el máximo a los 30 minutos (de 7 a 8 veces aumento) y, sin embargo detectada después 24 horas (3 a 4 veces mayor) (Figura 5).
La capacidad de BDNF para activar PI3-kinase /Akt se evaluó vía de señalización en las células de CRC utilizando anticuerpos específicos para Akt y fosfo-Akt (pAkt ). WiDr células SW480 y fueron suero de hambre durante 16 h. Las células fueron entonces expuestos a BDNF (100 ng /ml) y se recogieron en diferentes momentos, durante 5 minutos (min) a 24 horas (h). Treinta g de proteína lisados se analizó para pAkt (Ser473) y Akt total mediante Western blot. La densidad de cada banda pAkt se corrigió para la variación en la carga, el uso de la densidad de la Akt total correspondiente. El veces de inducción se evaluó como la relación de densidades fosforilados proteína Akt entre el control (0 min) y las células tratadas. Un resultado representativo de al menos tres experimentos independientes.
Por lo tanto, determina los niveles de apoptosis de las cuatro líneas celulares en presencia de un neutralizante anti-BDNF mAb [38]. Este mAb de hecho aumentó la apoptosis de las líneas de CRC primarias: WiDr (Figura 4D, la izquierda y la Tabla 2), SW480 (Figura 4D, la derecha y la Tabla 2) y las líneas metastásicas, SW620 (Figura 4E, la izquierda y la Tabla 3) y COLO 205 ( Figura 4E, a la derecha y en la Tabla 3).
en conjunto, estos datos sugieren que BDNF endógeno está implicada en la supervivencia celular CRC en cultivos libres de suero a través de TrkB a través de un bucle autocrino. Esto llevó a estudiar el papel de sortilin en el tráfico de BDNF.
sortilin, una proteína BDNF tráfico, se expresa mediante líneas celulares de CRC
Los cebadores utilizados en el estudio de las transcripciones sortilin reconoció la parte intracelular de la proteína (sortilin IC involucrado en el tráfico neurotrofina) y la parte extracelular (EC sortilin implicado en sus propiedades de los receptores). transcripción sortilin (Figura 6A) y la proteína (Figura 6B) se detectaron en todas las líneas celulares estudiadas. En comparación con las células cultivadas en 10% de FCS, una mayor expresión sortilin 24-72-h suero privación como se detecta en inmunotransferencias de WiDr, SW480, SW620 y COLO 205 extractos (Figura 6B). Sortilin se sabe que existe en dos estados diferentes de la glicosilación en células de CRC. En efecto, se detectó como un doblete en la línea celular SW480 (Figura 6B), pero apenas en otros (WiDr, Colo205) con una variable de expresión entre las líneas celulares y cultivos (Figura 6B). Sortilin se detectó en todas las líneas celulares de CRC por microscopía confocal también, como se muestra para SW620 (Figura 6C). Haga doble tinción para sortilin y BDNF mostraron una sorprendente colocalización con un aumento de la intensidad de fluorescencia después de la hambruna de 24 h en suero (Figura 6C). La cuantificación del verde (BDNF) y las intensidades (sortilin) fluorescencia roja en cada condiciones de cultivo confirmó los hallazgos de las imágenes de fluorescencia (Figura 6C). Se observaron patrones de tinción similares con WiDr, SW620, y COLO 205 líneas celulares en las mismas condiciones (datos no mostrados). En conjunto, nuestros resultados están de acuerdo con la hipótesis de que sortilin podría ejercer la función del transportador de BDNF.
(A) Detección sortilin por RT-PCR del ARN total extraído de células cultivadas en FCS al 10% y después de 24 -72 h de privación de suero. La expresión se controla con cebadores específicos para su extracelular (sortilin CE) y partes intracelular (IC) sortilin. Un resultado representativo de al menos tres experimentos independientes. (B) Evaluación por el Western Blot de la expresión sortilin (en referencia a la actina) en la proteína celular total extraído de las líneas celulares estudiadas cultivadas en condiciones basales y después de 24-72 h de privación de suero. Según los análisis densitométricos, la cuantificación mostró un incremento en la expresión significativa de sortilin en células cultivadas. Las barras de escala, 10 m.