Extracto
Los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes, que regulan la expresión génica mediante la represión selectiva de la transcripción y la traducción. En este estudio se muestra que los genes miARN-23b (miR-23b) actúa como un supresor tumoral en el cáncer de vejiga. Análisis en tiempo real PCR cuantitativa mostró que el miR-23b es significativamente baja regulado en líneas celulares de cáncer de vejiga y tejidos tumorales en comparación con las células no malignas y muestras de tejidos normales. También demuestran que la expresión de miR-23b tiene un potencial para ser biomarcador diagnóstico y pronóstico en el cáncer de vejiga. La expresión de alto miR-23b está correlacionada positivamente con una mayor supervivencia global de los pacientes con cáncer de vejiga como lo revela el análisis de Kaplan-Meier. ROC análisis mostró que la expresión de miR-23b puede distinguir entre los tejidos normales y cancerosas de la vejiga. Además hemos permitido comprender la importancia biológica de miR-23b en el cáncer de vejiga. La sobreexpresión de miR-23b en las células de cáncer de vejiga inhibieron la proliferación celular y la formación de colonias deteriorada. Fluorescencia clasificación de células análisis activado (FACS) reveló que re-expresión de miR-23b en las células de cáncer de vejiga inducida G0 detención del ciclo celular /G1 y la apoptosis, mientras que la inhibición de la migración celular y la invasión. los ensayos de reportero de luciferasa demostraron que ZEB1, un regulador crucial de la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT), es un objetivo directo de miR-23b en el cáncer de vejiga. Estos resultados muestran que la pérdida de miR-23b confiere una ventaja proliferativa y promueve la migración de células de cáncer de vejiga y la invasión. Por otra parte, re-expresión de miR-23b puede ser una estrategia terapéutica beneficiosa para el tratamiento de cáncer de vejiga humana
Visto:. Majid S, Dar AA, S Saini, Deng G, I Chang, Greene K, et Alabama. (2013) Funciones microARN-23b como un supresor tumoral mediante el control de ZEB1 en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (7): e67686. doi: 10.1371 /journal.pone.0067686
Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Marzo, 2013; Aceptado: 20-may de 2013; Publicado: 2 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Majid et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos para la investigación de los Institutos nacionales de Salud a través de los números de subvención RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, I01BX001123, VA Merit Review y el proyecto del Programa de VA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común en los Estados Unidos y uno de los más costosos de administrar clínicamente [1]. Más de 90% de los tumores de vejiga urinaria se componen de carcinoma de células transicionales (TCC) que surge de epitelio de transición [2]. tumores de vejiga urinaria se clasifican en dos categorías distintas: no muscular y cáncer de vejiga invasivo muscular [3], [4]. La mayoría de los tumores (75-80%) se presentan como tumores papilares no invasivos de bajo grado que rara vez progresan hasta convertirse en letales, pero casi siempre se repiten. Este tipo de cáncer se llama cáncer de vejiga "superficial" y requiere costoso tratamiento a largo plazo. El resto son tumores de alto grado del músculo invasivos (~ 15%) que rápidamente puede evolucionar hasta convertirse metastásico y conducir a la muerte [4]. Los factores etiológicos implicados en la carcinogénesis de la vejiga no han sido identificados, y los marcadores moleculares efectivos para la enfermedad son limitados.
Los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes, que regulan la expresión génica mediante la represión selectiva de la transcripción y la traducción. Varios estudios han realizado un análisis global de la expresión de los genes miARN en líneas celulares humanas y se encontró tejidos y patrones de expresión específicos de la enfermedad [5], [6]. También hay evidencia creciente de que los perfiles de expresión de genes miARN pueden ser indicativos de riesgo de la enfermedad y la carga. Por lo tanto, miRNAs se están evaluando como biomarcadores potenciales para ayudar en el diagnóstico y pronóstico de diferentes tipos de cáncer [7], [8]. Varios miRNAs humanos han demostrado que están alteradas en el cáncer de vejiga, incluyendo el miR-1280, miR-203, miR-125 ter y miR-133a [9], [10], [11], [12] y contribuir al desarrollo y la progresión de la enfermedad. Aquí mostramos que el miR-23b es significativamente baja regulado en tejidos de cáncer de vejiga y líneas celulares y que alto nivel de expresión de miR-23b se correlaciona positivamente con una mayor supervivencia global de los pacientes después de la cirugía. Además, se analizó el significado funcional de miR-23b y se identificaron ZEB1 como objetivo directo de miR-23b en el cáncer de vejiga. Por primera vez, este estudio muestra que el miR-23b es un biomarcador potencial y supresor tumoral en el cáncer de vejiga directamente dirigidas oncogén ZEB1.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
SV-HUC-1, las células T24 y J82 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron de acuerdo con los protocolos de ATCC. Estas líneas celulares derivadas de seres humanos fueron autenticadas por el análisis de repetición corta en tándem de ADN por ATCC. Los experimentos con líneas celulares se llevaron a cabo dentro de los 6 meses siguientes a su adquisición /reanimación. células SV-HUC-1 se cultivaron en F-12K Medio (ATCC) con 10% de FBS. células T24 se cultivaron en medio 5A de McCoy suplementado con 10% de FBS y las células J82 se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% FBS. Las células se mantuvieron en una incubadora con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C.
Los plásmidos, Precursores y transfección
sondas TaqMan y precursores para la HSA -miR-23b y control negativo pre-MIR se compraron de Applied Biosystems (Foster City, CA). PMIR-GLO Dual-Luciferase miRNA Target vector de expresión se adquirió de Promega. microARN-23b, el control-microARN y siRNAs se utilizaron a una concentración de 50 nM y Lipofectamine 2000 (Invitrogen) se utilizó para todas las transfecciones.
La extracción de RNA
miARN y el ARN total se extrajeron de las líneas celulares utilizando un Kit miRNeasy Mini y un Kit RNeasy Mini (Qiagen). miRNAs de muestras clínicas se obtuvieron mediante técnicas de microdisección de captura por láser con un kit miRNeasy FFPE (Qiagen).
muestras clínicas humanas
Las muestras clínicas se obtuvieron de los Asuntos de Veteranos de San Francisco (VA) Medical Center . escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de la UCSF (Número de autorización: H9058-35751-01).
Cuantitativo PCR en tiempo real
miRNAs maduro se analizaron utilizando TaqMan microARN los ensayos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). Todas las reacciones de RT, incluidos los controles sin plantilla y RT menos controles, se llevaron a cabo en un Sistema de PCR rápida Tiempo real 7500 (Applied Biosystems). las concentraciones de ARN se determinaron con un NanoDrop (Thermo Scientific, Rockford, IL). Las muestras se normalizaron a RNU48 (Applied Biosystems). los niveles de expresión de genes se cuantificaron utilizando el software Fast 7500 secuencia sistema de detección en tiempo real (Applied Biosystems). Comparativo PCR en tiempo real se realizó por triplicado, incluidos los controles sin plantilla. Expresión relativa se calculó utilizando el Ct comparativa.
viabilidad celular y Clonability Ensayos
viabilidad celular se determinó a las 24, 48 y 72 h utilizando el CellTiter 96 Una solución acuosa kit de ensayo de proliferación celular ( Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se midió la absorbancia a 490 nm usando SpectraMax 190 (Molecular Devices). Los datos se presentan como el valor medio para los experimentos por triplicado en comparación con el control negativo. Para el ensayo de formación de colonias, las células se sembraron a baja densidad (1000 células /placa) y se dejaron crecer hasta que las colonias visibles aparecieron. A continuación, las células se tiñeron con Giemsa y se contaron las colonias.
migración y la invasión ensayos
Cytoselect 24 pocillos kits de migración celular y la invasión de ensayo (Cell Biolabs, Inc) se utilizaron para la migración y la invasión los ensayos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células T24 y J82 transfectadas con precursor de miARN Pre-MIR o control negativo se cosecharon 72 horas después de la transfección y se resuspendieron en suero libre de Opti-MEM. Las células (10 x 10
4 por 300 l de medios sin suero) se añadieron a la cámara superior y la cámara inferior se llenó con 500 l de medio que contenía FBS al 10%. Las células se incubaron durante 16 horas a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora. Después de 16 horas, no emigraron células /no-invasores se retiraron del lado superior de los cartuchos de filtro de membrana trans-pocillos utilizando un hisopo de algodón. /células invadidas migrado en el lado inferior se tiñeron y se leyó la absorbancia a 560 nm de acuerdo con el protocolo del fabricante.
inmunotransferencia
La proteína se aisló de confluentes (70-80%) de las placas células cultivadas utilizando el reactivo de extracción M-PER proteínas de mamíferos (Pierce Biotechnology, Rockfield, IL) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de proteína se determinaron por el método de Bradford. Igual cantidad de proteína se resolvieron en geles de poliacrilamida al 4-20% de sodio dodecil sulfato (SDS) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia gradiente de tensión. Las transferencias resultantes se bloquearon con leche en polvo no grasa 5% y se sondaron con anticuerpos específicos. Las transferencias se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa adecuadas y se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
El agotamiento de ZEB1 El uso de ARN de interferencia pequeño (ARNip)
cáncer de vejiga T24 células se sembraron 24 horas antes de la transfección. En 40 a 50% de confluencia, las células fueron transfectadas utilizando Lipofectamine-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con ARNsi dúplex específicos para ZEB1 humana (SR304746; Tecnología Origene, Rockville, MD) o de control no silenciamiento (NS) siRNA durante 72 horas . Inicialmente, dos conjuntos diferentes de dúplex de siRNA se ensayaron para evaluar la especificidad de la diana y la eficiencia caída. Un dúplex de siRNA se utilizó para experimentos adicionales en una concentración de 50 nM.
luciferasa reportero de ensayo
Un pmirGLO Dual-Luciferase miARN se utilizó el vector de expresión diana para 3'-UTR ensayos de luciferasa (Promega, Madison , WI). El oncogén objetivo de miARN-23b fue seleccionado sobre la base de microARN en línea http://www.microrna.org/microrna/home.do base de datos destino. El primer secuencias de tipo salvaje 3'UTR fueron: 'CGCGGCCGCTAGTATTATGTTTTTTAAAATGTGAGT 3' Forward 5 y retroceso 5 'CTAGACTCACATTTTAAAAAACATAATACTAGCGGCCGCGAGCT 3'. Para el mutante 3'UTR, las secuencias de los cebadores fueron: Delantero 5 'CGCGGCCGCTAGTATCGTGCGCACTAAGGCTCACTT 3' y revertir 5 'CTAGAAGTGAGCCTTAGTGCGCACGATACTAGCGGCCGCGAGCT 3'. Para el ensayo lucifease, células T24 y J82 se cotransfectaron con hsa-miR-23b y los vectores de expresión diana pmirGLO Dual-Luciferase miARN con de tipo salvaje o secuencia diana mutante usando Lipofectamine 2000. las actividades de luciferasa de luciérnaga se midió utilizando el ensayo de luciferasa Dual (Promega, Madison, WI) 18 h después de la transfección y los resultados se normalizaron con la luciferasa de Renilla. Cada plásmido reportero se transfectó al menos tres veces (en días diferentes) y cada muestra se ensayó por triplicado.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 5 y MedCalc versión 10.3.2 . Todos los datos cuantificados representa un promedio de muestras por lo menos por triplicado o como se indica. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Todas las pruebas se llevaron a cabo dos de cola y
p-
valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Se calcularon las curvas de funcionamiento del receptor (ROC) para determinar el potencial de miR-23b para discriminar entre muestras malignas y no malignas. Para el análisis de supervivencia Kaplan-Meier (log-rank test) se realizó el análisis.
Resultados
miR-23b Expresión se agota en la vejiga tumores y cáncer líneas celulares
Preliminar microARN datos de microarrays revelaron que el miR-23b fue altamente regulado por disminución en las líneas celulares de cáncer de vejiga en comparación con la línea celular SV-HUC1 no maligno. Hemos validado los datos de microarrays de genes miARN-RT-PCR cuantitativa (MIR QRT-PCR) análisis y los resultados confirmaron que el miR-23b se downregulated en líneas celulares de cáncer de vejiga J82, T24 en comparación con la línea de células no malignas SV-HUC1 (Figura 1A) . Para examinar la relevancia biológica de miR-23b, su expresión se analizó en láser capturado microdissected (LCM) los tejidos tumorales de vejiga humano y en comparación con los tejidos normales de control emparejados. Se encontró que la expresión de miR-23b ser significativamente las reguladas en todas las muestras tumorales en comparación con sus muestras normales emparejados (Figura 1A). Aún más la expresión de miR-23b en los tejidos normales se correlacionaron con la de la línea de células no malignas y la de tumor correlacionada con la líneas celulares de cáncer (Figura 1A), indicando que estas líneas celulares de cáncer representan un sistema modelo para analizar la función de miR-23b en el cáncer de vejiga. Estos resultados también sugieren un papel supresor tumoral putativo de miR-23b en el cáncer de vejiga.
A) Análisis cuantitativo de RT-PCR de miR-23b en líneas celulares y en muestras de tejido microdisecado láser capturado emparejados. B) La proliferación de las células T24 J82 y después de la transfección de miR-23b se redujo significativamente en comparación con cont-MIR. C) miR-23b sobreexpresión inhibe significativamente la formación de colonias capacidad de las células de cáncer de vejiga.
microARN-23b regula la proliferación celular del cáncer de vejiga y de la formación de colonias
Para determinar la importancia funcional de miR-23b más de expresión en el cáncer de vejiga, transfectadas líneas celulares de cáncer de vejiga J82 y T24 con precursores de miR-23b. La expresión ectópica de miR-23b disminuyó significativamente la proliferación celular en comparación con las células que expresan cont-MIR (Figura 1B). células transfectadas miR-23b tenían baja capacidad de formación de colonias como el número de focos en células que expresan miR-23b se redujo en comparación con cont-MIR células (Figura 1C) transfectadas. Estos resultados indican un efecto anti-proliferativo de miR-23b en el cáncer de vejiga.
miR-23b Se dispara la detención del ciclo celular e induce la apoptosis en células de cáncer de vejiga
análisis
FACS (celular activada por fluorescencia) reveló que re-expresión de miR-23b dio lugar a un aumento significativo en el número de células en la fase G0 /G1 del ciclo celular (59% a 67%) mientras que la población de la fase S se redujo de 18% a 9% en J82 células (Figura 2A). Se observaron resultados similares en células T24 con un aumento en la población de células G0 /G1 (70% a 84%) y una disminución de la población de la fase S (15% a 5%) (Figura 2B). Por lo tanto lo que sugiere que el miR-23b desencadena la detención G0 /G1 en las células de miR-23b transfectadas en comparación con cont-MIR. análisis FACS para la apoptosis se realizó utilizando colorante anexina-V-FITC-7-AAD. El porcentaje de células apoptóticas totales (temprano de apoptosis + apoptótica) fue significativamente mayor (4% a 19%) en respuesta a miR-23b sobre-expresión en comparación con cont-MIR con una correspondiente disminución de 14% en la población de células viables en células J82 (Figura 2C). En las células T24, se observó un aumento (4% a 9%) en las células apoptóticas con miR-23b sobre-expresión en comparación con cont-MIR (Figura 2D). Estos resultados indican un papel supresor de tumores para miR-23b en el cáncer de vejiga.
A-B) imágenes representativas de análisis FACS que muestran miR-23b sobreexpresión induce la detención del ciclo celular G0 /G1 en J82 y las células T24 con una disminución correspondiente de células en fase S. C-D) miR-23b sobreexpresión induce la apoptosis en las células J82 y T24 con una disminución concomitante en el número viable de células. Se muestran los datos de los experimentos por triplicado ± SD.
miR-23b Suprime la migración de células del cáncer de vejiga y la invasión
La sobreexpresión de miR-23b había efectos anti-migratorias y anti-invasivos en líneas celulares de cáncer de vejiga. se observó menos la absorbancia a 560 nm con miR-23b transfectaron células de cáncer de vejiga en comparación a cont-MIR en el ensayo de migración (Figura 3A) y miR-23b sobre-expresión también redujo significativamente la invasión de células de cáncer de vejiga (Figura 3B).
A) Los ensayos de migración de células J82 y T24 transfectadas con miR-23b. B) imágenes representativas de ensayo de migración. C) Invasión ensayos muestran una disminución significativa en el número de células invasoras J82 y T24 transfectadas con miR-23b. D) imágenes representativas de ensayo de invasión.
Oncogene ZEB1 es un objetivo directo de miR-23b
ZEB1 ha sido informado de que una molécula importante que impulsa la motilidad de las células del cáncer de vejiga. El uso de una base de datos destino microARN en línea nos encontramos oncogén ZEB1 a ser un objetivo potencial de miR-23b con un sitio de unión 3'UTR complementaria para la secuencia de semillas de miR-23b (Figura 4A). Se realizó el análisis Western con células transfectadas miR-23b y encontramos que miR-23b atenuada expresión de la proteína en comparación con ZEB1 cont-MIR tanto en las células de cáncer de vejiga J82 y T24 (Figura 4B). Para comprobar si una interacción directa entre participa miR-23b y su objetivo oncogén ZEB1, hemos realizado ensayos de reportero de luciferasa. Se encontró que el co-transfección de miR-23b junto con el tipo salvaje 3'UTR de ZEB1 causó una disminución significativa en la actividad de luciferasa en comparación con los controles (Figura 4C). Estos resultados sugieren que el miR-23b se dirige directamente a oncogén ZEB1.
A) cortesía de miR-23b secuencias en el 3'UTR ZEB1 vinculante. B) Análisis de transferencia Western muestra que el miR-23b reprime la traducción de la proteína ZEB1 en células de cáncer de vejiga J82 y T24. ensayos de C) de luciferasa que muestran disminución de la actividad reportero después de co-transfección de o bien el tipo salvaje o mutante Zeb1-3'UTR con miR-23b en las células J82 y T24. Silenciamiento mutado ZEB1 3'UTR secuencia.
El agotamiento de ZEB1 por la interferencia de ARN imita Reconstitución de miR-23b en el cáncer de vejiga
phenocopy experimentos se llevaron a cabo también por la inhibición de siRNA ZEB1 (Figura 5). Hemos validado dos conjuntos de siRNA (Si-1 y Si-2) que resultó en la precipitación significativa de ZEB1 a nivel de proteínas (figura 5A) en células de cáncer de vejiga T24 y se utiliza un dúplex siARN para experimentos adicionales en una concentración de 50 nM. Nuestros resultados muestran que la inhibición de siRNA ZEB1 provocó disminución de la viabilidad celular (Figura 5B), la capacidad migratoria e invasiva (Figura 5C-D) de células de cáncer de T24. También se observó que la inhibición de siRNA ZEB1 aumentó aproximadamente 7% de la fracción apoptótica de las células en las células transfectadas ZEB1 siRNA en comparación con & lt; 1% en el control no específico (Figura 5E). Estos resultados sugieren que la depleción de siRNA de imita ZEB1 el efecto de miR-23b sobre-expresión en el cáncer de vejiga.
A) los niveles de proteína ZEB1 fueron significativamente atenuada con 50 nM de ARNsi dúplex (Si) en comparación con un no-silenciamiento dúplex de siRNA (Con) en células T24. B) Efecto sobre la proliferación celular. C-D) Efecto sobre la migración y la invasión de células de cáncer de vejiga T24. Ensayo E) La apoptosis que muestra la inducción de apoptosis después ZEB1 desmontables de siRNA en células T24. * P & lt;. 0,05
Diagnóstico y Significado pronóstico de miR-23b en el cáncer de vejiga
Para determinar si la expresión de miR-23b puede discriminar entre tumores de vejiga y tejidos normales, y predecir paciente supervivencia, se realizó un análisis ROC y el análisis de Kaplan-Meier. La demografía clínicas de la cohorte de pacientes se resumen en la Figura 6A. El área bajo la curva ROC (AUC) de 0,885 (P & lt; 0,0001; IC del 95% = 0,75-0,97) (Figura 6B) sugirió que la expresión de miR-23b puede discriminar entre los tejidos malignos y no malignos y, potencialmente, ser utilizado como un diagnóstico marcador para el cáncer de vejiga. Para determinar si el miR-23b tiene ninguna importancia pronóstica, dividimos los tejidos del paciente en bajo (/N & lt expresión T; 1,2 veces) y alta (la expresión de T /N & gt; 1,2 veces) grupos de miR-23b y se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Kaplan-Meier mostró que el grupo-23b MIR alta tuvieron significativamente mayor probabilidad de supervivencia global en comparación con el grupo de bajo miR-23b (Logrank Prueba de p & lt; 0,03, Hazard Ratio (HR) = 4,3; IC del 95% = 2-14) ( Figura 6C). Estos hallazgos sugieren que el miR-23b es potencialmente un marcador diagnóstico y pronóstico para el cáncer de vejiga, aunque se necesitan estudios sobre muestras adicionales para reforzar estos resultados.
A) características clinicopatológicas de cohorte de pacientes. B) análisis de la curva ROC que muestra la capacidad de expresión de miR-23b para discriminar entre muestras de tejidos malignos y no malignos. análisis C) de Kaplan-Meier para la supervivencia global basado en la expresión de miR-23b.
Discusión
Los microARNs pueden tener efectos a gran escala mediante la regulación de la expresión de una variedad de genes durante el desarrollo de los mamíferos y la carcinogénesis. Como resultado de ello, la comprensión de los mecanismos y la función de miRNAs individuales ha generado un gran interés. A pesar de la evidencia acumulada en relación con el papel de varios miRNAs en el cáncer, muy escasa la información disponible sobre la función de miRNAs en el cáncer de vejiga, y sólo unos pocos genes miARN objetivos han sido identificados.
Aquí mostramos que el miR-23b para se ha reducido regulado en tejidos de cáncer de vejiga en comparación a los tejidos adyacentes normales y esto también se observó en el cáncer de vejiga y líneas de células no malignas. Nuestros datos sugieren un papel potencial de diagnóstico /pronóstico de miR-23b en la predicción de la supervivencia global y exigente malignos de los tejidos normales e indica que el miR-23b es un supresor tumoral en el cáncer de vejiga.
Para determinar la relevancia biológica de MIR -23b en el cáncer de vejiga, hemos realizado ensayos funcionales. La expresión ectópica de miR-23b resultó en una inhibición significativa de la proliferación celular, la formación de colonias, la migración /invasión y la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de cáncer de vejiga. La expresión de miR-23b en el cáncer es algo controvertido ya que se ha encontrado para ser o bien hasta reguladas y oncogénica en cáncer de riñón donde causó la represión de traducción de gen supresor PTEN tumor [13] o el regulado y un supresor de tumores en el cáncer de próstata donde se dirige directamente a Src quinasa y oncogenes Akt [14], mientras que nuestro estudio indica que es un supresor de tumores en el cáncer de vejiga. Estudios anteriores han demostrado que los microARNs son altamente específico de tejido y que pueden actuar como supresor de tumores o oncogenes [15], [16]. Los microARN poseen varias características que los hacen candidatos atractivos como nuevos biomarcadores pronósticos y herramientas poderosas para el diagnóstico precoz del cáncer [17]. En este estudio, encontramos que el miR-23b fue predictivo de la supervivencia global de tal manera que los pacientes con mayor expresión de miR-23b tuvieron una mayor supervivencia global en comparación con los pacientes con baja expresión de miR-23b. la expresión de microARN-23b también fue capaz de distinguir malignos de los tejidos normales que indican la importancia diagnóstica de miR-23b en el cáncer de vejiga aunque se requieren estudios adicionales con una cohorte más amplia de muestras de tejido.
Un obstáculo importante para la comprensión de la función de los genes miARN ha sido la relativa escasez de objetivos validada experimentalmente. Para determinar los efectores de miR-23b, algoritmos en silico y análisis funcionales identificados ZEB1 como su objetivo. Hemos demostrado que el miR-23b se dirige directamente a la 3'UTR de ZEB1, como su sobreexpresión se asocia con la supresión de la actividad de luciferasa. Además, se observó una significativa baja regulación en el nivel de proteína ZEB1 después de miR-23b sobre-expresión, lo que indica la regulación post-transcripcional de ZEB1 a través de la orientación de su 3'UTR. Los ensayos funcionales realizadas después de la depleción ZEB1 de siRNA transfección imitaban los resultados obtenidos con la sobreexpresión de miR-23b. Estos resultados indican que los efectos de miR-23b en el cáncer de vejiga son en parte por la orientación directa ZEB1, aunque otros objetivos también pueden estar involucrados desde microRNAs pueden dirigirse a miles de genes. ZEB1 es uno de los reguladores cruciales de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [18] y se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la invasión y la metástasis de tumores epiteliales [19]. La relevancia de las proteínas ZEB a la progresión del tumor se ha estudiado en varios cánceres humanos. Expresión de ZEB1 correlacionado con un fenotipo agresivo en varios tipos histológicos de carcinoma endometrial y se detectó en el compartimiento sarcomatoso de carcinosarcoma endometrial [20]. En el cáncer de colon, ZEB1 se expresó en el frente invasivo de tumores, en asociación con la pérdida transitoria de las membranas basales [21]. expresión recíproca de ZEB1 y E-cadherina también se ha observado en el carcinoma de pulmón de células no pequeñas [22]. Una correlación directa entre ZEB1 inmunorreactividad y grado de Gleason se ha informado en los tumores de próstata humanos [23] y en el cáncer de vejiga, ZEB1 ha informado que se expresa sobre-y responsable de la motilidad mejorada [18]. En el presente estudio, encontramos que la sobre expresión de miR-23b resultó en la supresión de oncogén ZEB1 en las células de cáncer de vejiga que sugieren que miR-23b puede mediar EMT, lo que representa de esta manera un posible mecanismo mediante el cual afecta a la migración del cáncer de vejiga y la invasión.
en conclusión, este estudio muestra que el miR-23b tiene un significado de diagnóstico /pronóstico y directamente se dirige a oncogénico ZEB1 en el cáncer de vejiga. miR-23b sobre-expresión dio lugar a la supresión de la proliferación del cáncer de vejiga celular y la invasión, inductor de la apoptosis, y la detención del ciclo celular. Por último, este estudio indica que el miR-23b sobre-expresión puede ser una estrategia terapéutica útil para el tratamiento de cáncer de vejiga.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Roger Erickson por su apoyo y asistencia con la preparación del manuscrito.