Extracto
Antecedentes
La muerte celular programada 4 (PDCD4), originalmente identificado como la transformación neoplásica inhibidor, se atenuó en diversos tipos de cáncer. Nuestro estudio anterior demostró una baja regulación de la expresión continua PDCD4 en la secuencia de muestras de tejido ovárico normal-frontera-malignas y una correlación significativa de la expresión PDCD4 con la supervivencia libre de enfermedad. El objetivo del presente estudio fue investigar más la función y la modulación de PDCD4 en las células de cáncer de ovario.
Principales conclusiones
Hemos demostrado que la expresión ectópica PDCD4 proliferación celular significativamente inhibido mediante la inducción de la detención del ciclo celular en G
1 etapa y sobre regulación de los inhibidores del ciclo celular de p27 y p21. La migración celular y la invasión también fueron inhibidos por PDCD4. PDCD4 sobre-expresión de las células expuestas elevada de la fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN) e inhibido la proteína quinasa B (p-Akt). Además, la expresión de PDCD4 fue hasta reguladas y se exporta al citoplasma tras el tratamiento retirada de suero, pero se agota rápidamente a través de la degradación proteasomal en suero de la readministración. El tratamiento de un inhibidor de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) impidió la degradación de PDCD4, lo que indica la implicación de vía PI3K-Akt en la modulación de PDCD4.
Conclusión
PDCD4 puede desempeñar una función crítica en la detención de la progresión del ciclo celular en el punto de control clave, lo que inhibe la proliferación celular, así como la supresión de la metástasis tumoral. La vía PI3K-Akt se implicaba estar implicado en la regulación de la degradación PDCD4 en las células de cáncer de ovario. En respuesta a la situación de estrés, PDCD4 endógena fue capaz de transporte entre compartimentos celulares para llevar a cabo sus funciones desviados
Visto:. Wei N, Liu SS, Chan KKL, Ngan HYS (2012) Función de supresión tumoral y la modulación de La muerte celular programada 4 (PDCD4) en el cáncer de ovario. PLoS ONE 7 (1): e30311. doi: 10.1371 /journal.pone.0030311
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 12 de mayo de 2011; Aceptado: 13 de diciembre de 2011; Publicado: 17 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Wei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca interna de la Universidad de Hong Kong de la semilla Financiación del Programa de Investigación básica [a KKLC], y por una donación de la Wong Compruebe Ella Fundación de Caridad [a HYSN]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
PDCD4 se identificó originalmente como el inhibidor de la transformación neoplásico en el modelo de línea celular epidérmica JB6 ratón [1]. PDCD4 ratones transgénicos mostró menor incidencia de tumores y la frecuencia de conversión de papiloma-a carcinoma [2]. Los informes posteriores han implicado papel inhibitorio de PDCD4 en la traducción de proteínas a través de la inhibición de la eucariótica factor de iniciación 4A helicasa (eIF4A), así como interferir con la asociación de eIF4A con eIF4G, dando como resultado el fracaso de la formación de complejo de iniciación de la traducción [3], [4 ], [5]. Desde entonces, se han realizado varios estudios para investigar el papel de PDCD4 durante la génesis tumoral. PDCD4 se encontró que era capaz de regular la transcripción. La sobreexpresión de la PDCD4 dado lugar a la proliferación celular carcinoide suprimida a través de la represión de la transcripción del factor de quinasa dependiente de ciclina mitosis promotoras (CDK) 1 /cdc2 vía hasta la regulación de p21
Waf1 /Cip1 [6], [7]. PDCD4 inhibe la invasión de células de cáncer de colon a través de la supresión de MAP quinasa quinasa quinasa quinasa 1 (MAP4K1), conduce a la transcripción dependiente suprimida AP-1 [8]. El papel de PDCD4 en apoptosis de las células también se ha investigado en diferentes estudios. PDCD4 se sugirió a ser una molécula proapoptótico involucrado en factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF beta-1) inducida por la apoptosis en el carcinoma hepatocelular (HCC) [9]. expresión disminuida PDCD4 desregulado la respuesta normal daño de ADN, evitando así células con el ADN dañado de la apoptosis [10].
A pesar de las propiedades supresores de tumores mencionados anteriormente, el papel de PDCD4 en la progresión tumoral ha sido sugerido para ser tipo específico de célula [11]. La sobreexpresión de la PDCD4 tuvo ningún efecto sobre cualquiera de la proliferación o la apoptosis en células HEK293 [12], así como en células de cáncer de colon RKO [8]. Anteriores estudios informaron la expresión PDCD4 empobrecido en cáncer, en comparación con los tejidos normales [13], [14], [15], y PDCD4 fue destinada a la degradación durante la promoción de tumores [16], sin embargo, los mecanismos para la modulación de PDCD4 no era clara sin embargo.
las investigaciones sobre el papel de PDCD4 en la carcinogénesis del cáncer de ovario eran bastante limitado. De acuerdo con nuestros resultados anteriores, se encontró que la pérdida de expresión PDCD4 en las muestras de tejido de ovario borderline y malignos, y se asocia con un resultado adverso de la enfermedad [17]. Para investigar más a fondo el papel de PDCD4 en cáncer de ovario, en el presente estudio, se examinaron las posibles funciones supresoras de tumores de PDCD4 en las células de cáncer de ovario, y el mecanismo plausible que regula PDCD4.
Resultados
PDCD4 inhibe la proliferación de células de cáncer de ovario y la progresión del ciclo celular
Para investigar la función de PDCD4 en cáncer de ovario, sobre-expresión de los clones estables PDCD4c1 433-y-433 PDCD4c2, se establecieron en OVCA433 de células de cáncer de ovario dos PDCD4. Una PDCD4 sobre-expresión de clon estable SKOV3-PDCD4, se estableció en células de cáncer de ovario SKOV3 (Figura 1A). El establecimiento de PDCD4 sobre-expresión de los clones estables se indica por la banda extra en comparación con las células parentales. pEGFP sobre-expresión de los clones estables (433-EV y SKOV3-EV) también se establecieron como el control de vector vacío y se utilizan en los siguientes experimentos. La cuantificación de las bandas de Western Blot se presenta en datos S1.
(A) PDCD4 sobre-expresión de clones estables 433-PDCD4c1, 433-pdcd4c2, y SKOV3-PDCD4, se establecieron en células de cáncer de ovario OVCA433 y SKOV3 . 433-EV y SKOV3-EV: GFP sobre-expresión de los clones de vectores vacíos estables para el control. (B) 433 PDCD4c1 y 433 PDCD4c2 exhibió tasa significativa proliferación más lenta en comparación con el control (* p & lt; 0,01 y ** p & lt; 0,05, respectivamente) de acuerdo con XTT (panel izquierdo) y ensayo clonogénico (p & lt; 0,05) (panel derecho). (C) PDCD4 induce la detención del ciclo celular en la fase G1. Los datos representativos son de uno de los tres experimentos independientes. Los porcentajes de células que se encontraban en fase G1 para OVCA433 c1 y c2 fueron 84,6% (± 2,1%) y 80,9% (± 2,2%), respectivamente. Ambos eran significativamente mayor en comparación con el control (69,9% ± 3,1%) (p = 0,004 y P = 0,01, respectivamente). El porcentaje de células que estaban en fase G1 para SKOV3-PDCD4 era 66,7% (± 1,8%), que fue significativamente mayor en comparación con el control (37,5% ± 2%) (p = 0,008). (D) PDCD4 sobre-expresión de clones estables, así como de control del vector vacío clones estables se mantuvieron en MEM con 10% de FBS, y luego cosechadas para la extracción de proteínas. expresiones de proteína de un panel de reguladores del ciclo celular, incluyendo p53, p21, p27, Cdc25A, se analizaron ciclina A y ciclina. La intensidad de la banda se determinó mediante barrido densitométrico. La cuantificación de las bandas se presenta en datos S1. GAPDH se incluyó como control de carga interno. Se realizaron tres experimentos independientes.
La proliferación celular se evaluó mediante XTT y ensayo clonogénico. Según los resultados XTT, tanto de las dos células OVCA433-PDCD4 expuestas significativamente más lenta velocidad de proliferación en comparación con el control (p & lt; 0,05 para OVCA433-PDCD4c1 y p & lt; panel de 0,01 para OVCA433-PDCD4c2, respectivamente, la figura 1B, a la izquierda). ensayo clonogénico también indicó resultados similares: el número de colonias formadas para OVCA433-PDCD4c1 y c2 eran 33% y 58% menor en comparación con el control (GFP solamente el control del vector vacío), respectivamente (p & lt; 0,05, Figura 1B, panel derecho).
para explorar los mecanismos subyacentes a los efectos inhibitorios de PDCD4 sobre la proliferación celular de cáncer de ovario, se evaluó el efecto de PDCD4 en la progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo. En el control de OVCA433, el porcentaje de células en fase G1 era 69,9% (± 3,1%). Comparativamente, los porcentajes de células en fase G1 eran 84,6% (± 2,1%) y 80,9% (± 2,2%) para OVCA433-PDCD4c1 y C2 respectivamente, ambos de los cuales fueron significativamente más altos que el control (p = 0,004 y P = 0,01, respectivamente). Hubo una disminución correspondiente del porcentaje de células en la fase S en el OVCA433-PDCD4c1 (10,3% ± 2,4%) y c2 (15,7% ± 2%)) en comparación con el control (25,9% ± 2,1%, la Figura 1C).
la sobreexpresión de la PDCD4 en SKOV3 también afectó a su progresión del ciclo celular. En las células SKOV3 de control, el porcentaje de las células en fase G1 era 37,5% (± 2%). Comparativamente, en las células SKOV3-PDCD4, el porcentaje de células en fase G1 era 66,7% (± 1,8%), que fue significativamente mayor que el control (p = 0,008). Hubo una disminución correspondiente del porcentaje de células en la fase S en las células SKOV3-PDCD4 (20,9% ± 2,5%) en comparación con el control (46,2% ± 1,9%).
La citometría de flujo análisis indicó que más del -expresión de detención del ciclo celular inducida PDCD4 principalmente en la fase G1; 1,2 (p & lt; = 0,01) y 1,8 (p & lt; 0,01) aumento en el porcentaje de las células en la fase G1 en OVCA433-PDCD4 y SKOV3-PDCD4 células de cáncer de ovario, respectivamente veces (p & lt; = 0,01).
Para identificar posibles moléculas implicadas en los efectos inhibitorios por encima de PDCD4 sobre la progresión del ciclo celular, se evaluó la expresión de varios reguladores del ciclo celular, incluyendo p21, p27, p53, ciclina a, ciclina, Cdc25A. En OVCA433-PDCD4c1 y c2, la expresión de p53 fue apenas cambió y p21 fue significativamente hasta regulado, mientras que en las células SKOV3-pdcd4 p53 nulo, no se detectó p21. expresión de p27 fue hasta regulada tanto en las células OVCA433-PDCD4 y Skov-PDCD4. Además, se observó un aumento de la expresión en el Cdc25A dos 433 PDCD4 sobre-expresión de clones estables, y un aumento de la expresión de ciclina A en 433 PDCD4 c2 pero no en c1 (Figura 1D). Sin embargo, disminuir sólo ligeramente de Cdc25A se observó en células SKOV-PDCD4, y el nivel de ciclina A se mantuvo la misma tanto en el clon y el vector estable de control de las células SKOV3. La cuantificación de las bandas de Western Blot se presenta en datos S1.
PDCD4 inhibe la migración de células de cáncer de ovario y la invasión
Para estudiar los posibles efectos de PDCD4 sobre la migración de células de cáncer de ovario, dos enfoques diferentes eran aplicado. En primer lugar, se utilizó el ensayo la curación de heridas para controlar el tiempo requerido para el cierre de la herida en el control y PDCD4 sobre-expresión de células de cáncer de ovario. Antes del ensayo, las células se pre-trataron con mitomicina C, una síntesis de ADN y el inhibidor de la división nuclear, para asegurar el cierre de la herida era exclusivamente debido a la migración celular, pero no la proliferación celular. Los resultados mostraron que PDCD4 que sobre-expresan células exhibieron tasa de migración más lenta. La herida rayado tanto en las células de control se cerró en 23 horas después de la introducción de la herida, mientras que una brecha todavía se observó en el PDCD4 sobre-expresión de las células (Figura 2A).
(A) Tanto el control y PDCD4 sobre-expresión de las células se trataron con mitomicina C (10 ug /ml) durante tres horas antes de la introducción de la herida. Fotos fueron tomadas en puntos de tiempo indicados (0, 5, 8 y 23 h). PDCD4 sobre-expresión de clones estables expuestas más lento proceso de cicatrización de la herida en comparación con el control. Se permitió (B) células de cáncer de ovario a migrar a través de la membrana microporosa durante 9 horas en transwell ensayo de migración. El número de células que migraron a través de PDCD4 sobre-expresión de clones estables fueron significativamente menos en comparación con el control (* p & lt; 0,01 y ** p & lt; 0,05, respectivamente). Se permitió que las células del cáncer ovárico (C) para invadir a través de la ECMatrix durante 72 horas en transwell ensayo de invasión. El número de células invadidas a través de PDCD4 sobre-expresión de clones estables fueron significativamente menos en comparación con el control (* p & lt; 0,05). Los experimentos se realizaron por triplicado.
Para evaluar cuantitativamente la tasa de migración de las células, se aplicó transwell ensayo de migración. OVCA433-PDCD4c1 y c2 mostraron 35% y 63% menos de la migración, respectivamente, que la de las células de control (P & lt; 0,01 Figura 2B). células SKOV3-PDCD4 mostraron 22% menos de la migración que la de las células de control (p & lt; 0,05, Figura 2B)
PDCD4 también tiene efecto sobre la invasión de células de cáncer de ovario demostrado por transwell ensayo de invasión.. OVCA433-PDCD4c1 y c2 mostraron 27% y 30% menos de invasión en comparación con el control (p & lt; 0,05 Figura 2 C). SKOV3-PDCD4 mostró 19% menos de invasión en comparación con el control (p & lt; 0,05, Figura 2C).
Modulación de PDCD4
PDCD4 se informó como un inhibidor de la traducción. Como la traducción de proteínas podría ser estimulada por suero y se inhibe cuando las células se mueren de inanición en ausencia de factores de crecimiento, examinamos así los efectos de suero de la abundancia de PDCD4. Tanto OVCA433 y SKOV3 se mueren de inanición en medio libre de suero durante 48 horas antes de suero fue readmitido en intervalos de tiempo indicados, incluyendo 1 h, 2 h, 6 h y 24 h. En ambas células, PDCD4 fue elevado al hambre. Sin embargo, tras la re-administración de suero, PDCD4 disminuyó gradualmente de una manera dependiente del tiempo en SKOV3 y rápidamente desapareció dentro de 1 h en OVCA433 (Figura 3A). La cuantificación de las bandas de Western Blot se presenta en datos S2.
(A) OVCA433 y SKOV3 fueron privados de suero (SD) durante 48 horas antes de que se re-administrado suero durante 1 h, 2 h, 6 h y 24 h. Hubo un aumento dramático de la expresión de la proteína tras el tratamiento PDCD4 privación de suero. PDCD4 desapareció rápidamente después se volvió a administrar el suero. P-Akt y ERK-P se redujeron regulado cuando el suero se retiró y se reanudó gradualmente después de suero se vuelve a añadir. Total de Akt y ERK no se vieron afectadas durante el tratamiento. (B) PDCD4 fue elevado en las células privadas de suero (SD) y agota cuando el suero se añadió de nuevo (SA, la adición de suero) para 2 y 4 horas. La administración de cualquiera de inhibidor del proteasoma MG132 (S + MG132), o el inhibidor de PI3K LY294002 (S + LY294002) previno el agotamiento de PDCD4. DMSO también se incluyó como control (S + DMSO). Control negativo (-ve) indicado para las células cultivadas con medio que contenía suero. (C) La expresión de PTEN, p-Akt y ERK-P se vio alterada en todos los clones estables PDCD4 sobre-expresión, mientras que las expresiones de Akt total y ERK se mantuvo sin cambios. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. La cuantificación de las bandas de Western Blot se presenta en los de S2.
Para explorar las posibles vías implicadas en la modulación de PDCD4 en el tratamiento anterior, las expresiones de PTEN, p-Akt y ERK-P ( quinasa extracelular regulada por señal) fueron examinados. PTEN se elevó después se separó el suero, y no hubo más cambios después de volver a la adición del suero hasta hasta 24 h. Hubo una disminución significativa de p-Akt cuando el suero se eliminó tanto en las células OVCA433 y SKOV3, seguido por la reanudación a 6 h después de suero re-adición en OVCA433. En SKOV3, la recuperación de p-Akt fue más rápido y 1 h. Se observó una ligera disminución de p-ERK en las células en ausencia de suero, y una reducción adicional también se observó tanto en las células cuando el suero fue readmitido durante 1 h. La expresión de p-ERK se reanudó después de 2 h de la administración de suero y poco a poco llegó a su nivel original a las 24 h. No se observó ningún cambio profundo en cualquiera de Akt, total o ERK (Figura 3A).
Para confirmar la posible participación de PI3K-Akt y ERK-MEK vías en la regulación de PDCD4, inhibidor específico de PI3K LY294002, y inhibidor de MEK U0126 se introdujeron a las células de hambre junto con suero y se incubaron durante 2 h y 4 h después del tratamiento inanición 48 horas. Cuando p-Akt fue específicamente regulada hacia abajo sobre el tratamiento de LY294002, se previno el agotamiento de PDCD4 (Figura 3B). Sin embargo, la administración de U0126 no mostró ningún efecto en la prevención de la degradación PDCD4 (Figura S1). Además, cuando inhibidor del proteasoma MG132 se introdujo en las células de hambre, el agotamiento de PDCD4 fue también impidió (Figura 3B). Ningún efecto fue observado en las células de control DMSO. Nuestros resultados indican que el agotamiento de PDCD4 después de la re-adición de suero en las células de cáncer de ovario fue debido a la degradación mediada por proteasoma. La cuantificación de las bandas de Western Blot se presenta en los de S2.
En el PDCD4 sobre-expresión de células de ovario, PTEN fue hasta regulado, y p-Akt y ERK-P fue significativamente las reguladas, mientras que Akt total y ERK no se vieron afectados (Figura 3C). La cuantificación de las bandas de Western Blot se presenta en datos S2.
translocación intracelular de PDCD4
Nuestro estudio inmunohistoquímica anterior mostró un patrón diferencial de localización celular de PDCD4 entre las células normales y malignas de ovario [17] , lo que sugiere que PDCD4 podría trasladar desde el núcleo hasta el citoplasma durante el desarrollo del cáncer de ovario. Otro estudio también demostró la translocación intracelular de PDCD4 bajo algunas condiciones de estrés [18]. Luego investigó la localización PDCD4 endógena en células de cáncer de ovario. Dos líneas celulares de cáncer de ovario, OV2008 y C13, tienen alto nivel de expresión de la PDCD4 endógena, que se encontró exclusivamente localizada en el núcleo en condiciones de cultivo normal (Figura 4). Después del tratamiento de privación de suero durante 48 horas, se encontró el PDCD4 endógeno para ser translocado desde el núcleo al citoplasma (Figura 4).
endógena PDCD4 tanto en las células de cáncer de ovario OV2008 y C13 se localizó exclusivamente en el núcleo cuando se cultivan en medio con suero. se observó con mayor localización citoplasmática de PDCD4 bajo tratamiento privación de suero. PDCD4 endógena se detectó mediante tinción de inmunofluorescencia usando PDCD4 anticuerpo primario y cabra marcado con FITC anti-conejo secundaria de anticuerpos. Tinción con DAPI se indica la localización nuclear. Representante translocación se indica mediante flechas.
Discusión
Una serie de estudios han informado de los efectos inhibitorios de PDCD4 sobre la traducción de proteínas [19], [20], y AP-1 dependiente transactivación [12], [21]. Los estudios sobre la función de PDCD4 el ciclo celular han generado resultados inconsistentes. En las células de cáncer de mama, PDCD4 provocó un aumento de la población en G0 a G1 fase sin afectar a otras fases del ciclo celular que sugiere un posible papel en la apoptosis [22]. En las células cancerosas de glioma, PDCD4 retrasó transición del ciclo celular de la fase G1-S-a [23]. Otro grupo informó de que PDCD4 células en ambos sub-G1 y la fase G2-S inducida, lo que indica sus efectos tanto en la apoptosis y la detención del ciclo celular [24]. Sin embargo, en las células de cáncer de colon, PDCD4 no alteró la progresión del ciclo celular o inducir apoptosis [8]. En el estudio actual, la expresión ectópica PDCD4 induce la detención del ciclo celular en la fase G1 y por lo tanto suprime la proliferación de células de cáncer de ovario.
Se evaluó la expresión de un panel de reguladores del ciclo celular que desempeñan papeles importantes en la transición G1-S en PDCD4 sobre-expresión de células. PDCD4 indujo la expresión de p27 y p21, pero no las expresiones de ciclina E. Estos resultados fueron consistentes con los hallazgos que desmontables de PDCD4 en células de AML resultó en la regulación negativa de p27 [25]; y la inducción de p21 y p27 por PDCD4 [26]. Se sugirieron Los efectos celulares de la PDCD4 a ser diferentes en modelos de células con o sin expresión de p53 [10], [27]. Dos líneas de células de ovario seleccionados en este estudio tienen la condición de p53 diferencial, teniendo OVCA433 p53 de tipo salvaje, y SKOV3 siendo p53 nulo. Ambas líneas celulares tuvieron niveles elevados de expresión de p27 a la sobreexpresión de PDCD4, y la sobre regulación de p21 no fue mediada por p53 en células OVCA433. Resultados similares han sido reportados que la inducción de p21 en las células por PDCD4 carcinoides fue independiente de p53 [7]. Nuestros resultados implican que uno de los posibles mecanismos para la inducción de la detención del ciclo celular en la fase G1 por PDCD4 era debido a la regulación de p21 y p27. Nos dimos cuenta de que no hubo diferencias en las expresiones de ciclina A o Cdc25A entre un clon estable y control de vector vacío en líneas celulares SKOV3. Sin embargo, para OVCA433 células, se observó un aumento de la expresión de Cdc25A en los dos PDCD4 sobre-expresión de clones estables, y un aumento de la ciclina A expresión en 433 PDCD4 c2 pero no en C1. La expresión diferencial de la ciclina A puede ser debido a las diferentes actividades proliferativas y clonogénicos de PDCD4-expresión de c1 y c2 clon. Sin embargo, los efectos de PDCD4 en ciclina A y Cdc25A necesitarían más investigación.
Además de la proliferación, también hemos demostrado los efectos inhibidores de PDCD4 sobre la migración de células de cáncer de ovario y la invasión. Efectos similares también han sido reportados en estudios llevados a cabo en el colon y células de HCC [8], [20], [28]. PDCD4 se encontró que ser inducido en el tratamiento de sustancias pro-apoptóticos [29], [30]. Las investigaciones sobre su papel en la apoptosis han generado resultados inconsistentes. PDCD4 se ha demostrado para inducir la apoptosis en células de cáncer de mama y de pulmón [22], [26] En contraste, no se observó efecto apoptótico de PDCD4 en otros estudios [8], [12]. Además, se informó de expresiones PDCD4 más altos que se correlaciona con un aumento de la sensibilidad a la geldanamicina y tamoxifeno [31]. Además, un estudio reciente llevado a cabo en células de cáncer de próstata sugiere un aumento de cisplatino y la sensibilidad paclitacel por la sobre expresión de PDCD4 [32]. En el presente estudio, la sobreexpresión de PDCD4 no indujo la apoptosis de acuerdo con la citometría de flujo y ensayo de western blot través de la expresión de PARP (Figura S2). También se evaluó el papel potencial de PDCD4 sobre la sensibilidad a cisplatino. Sin embargo, no se observó diferencia significativa entre PDCD4 sobre-expresión de las células y las células de control en respuesta al tratamiento con cisplatino (Figura S2), que era consistente con nuestros datos publicada anterior que no se observó correlación entre la expresión PDCD4 con el estado de la quimiosensibilidad de los pacientes con cáncer de ovario [17]. Dado que el mecanismo de cisplatino para destruir células cancerosas es para iniciar la apoptosis celular, y PDCD4 no mostró ningún efecto de apoptosis en células de cáncer de ovario, esto podría ser una de las razones que contribuyen a la observación mencionada
.
Como se señaló de nuestros resultados, la magnitud de supresión de la proliferación de células de cáncer de ovario, la migración y la invasión no estaba en proporción a los niveles de sobre-expresión de la proteína PDCD4 en esos clones estables. También se informó de resultados similares en el estudio realizado por Yang et al. en la epidermis del ratón las células JB6 RT101 [21]. Hemos propuesto que podría haber un umbral de concentración, cuando se excede, se produciría la función inhibidora de PDCD4 sobre la progresión tumoral. Según nuestra evaluación de citometría de flujo, la sobre expresión de PDCD4 tanto en las células OVCA433 y SKOV3 inducidas detención del ciclo celular en la fase G1. Sin embargo, aunque se observó un efecto supresor sobre la formación de la proliferación celular y la colonia en PDCD4 sobre-expresión de las células SKOV3, el efecto no fue estadísticamente significativa cuando se compara con las células de control parentales (Figura S3). Si era debido a los antecedentes genéticos de las células SKOV3 o la participación de otros mecanismos y factores que actualmente no estaban claros y se requiere una mayor investigación
.
Las observaciones de la baja regulación de p-Akt y p-ERK en PDCD4 sobre-expresión de las células sugiere una posible participación de p-Akt y p-ERK vías en la regulación de PDCD4. Para abordar la cuestión de que si estas dos vías están realmente involucrados, se procedió a estudiar las expresiones simultáneas de p-Akt, p-ERK y PDCD4 durante la retirada del suero y re-Además del tratamiento. Hubo un aumento dramático de PDCD4 a la retirada del suero, seguido de un rápido agotamiento de PDCD4 después se volvió a administrar suero. Durante el mismo proceso,,, se observó una tendencia inversa de la expresión tanto de p-Akt y p-ERK las dos moléculas reguladoras de proliferación de células importantes: una disminución de la expresión inicial seguido de una reanudación gradual. La alteración de p-Akt y p-ERK podría ser simplemente las consecuencias del tratamiento privación de suero. Y aún así, debido a los cambios concurrentes de las expresiones de PDCD4 y p-Akt y p-ERK, y el nivel de expresión alterado de ambas moléculas observadas en el PDCD4 sobre-expresión de las células, hay una posibilidad de que p-Akt y p-ERK vías estuvo involucrado en la regulación de PDCD4. Para confirmar aún más que, aplicamos inhibidor de PI3K LY294002 (que posteriormente se bloquea la fosforilación de Akt) junto con el suero, y encontramos la proteína PDCD4 ya no era degradada. Introducción del inhibidor de MEK no impidió que el agotamiento de PDCD4. Nuestros resultados indican que p-Akt pero no p-ERK se requiere para la degradación de PDCD4 a la estimulación de suero, y por lo tanto la vía PI3K-Akt podría desempeñar un papel directo en la modulación de la degradación PDCD4 en células de cáncer de ovario. Sin embargo, la participación de la vía p-ERK no está claro en el presente y se requiere más investigación. Se han realizado estudios que informan de la vía p-Akt en la regulación de PDCD4. El estudio de Dorrello implicado el papel de S6K1 en la regulación de la degradación PDCD4 en respuesta a mitógenos [23]. El tratamiento con el promotor tumoral 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) disminución de la expresión PDCD4, atribuible a la degradación proteasomal mediada por PI3K-Akt-mTOR-p70
S6K y facilitada por la vía de señalización de MEK-ERK [16] . Una correlación inversa de PDCD4 y expresión de P-Akt se ha informado en muestras de tejido de cáncer de colon [33]. shRNA PDCD4 activa Akt, lo que lleva al aumento de las expresiones de p-Akt, mTOR y p70S6K en los pulmones de los ratones [34]. Nuestros resultados están en concordancia con estos hallazgos e implicaban la participación de la vía de p-Akt en la regulación de PDCD4 en las células de cáncer de ovario.
La combinación del fenómeno que la baja regulación de la expresión de p-Akt se observó en más de PDCD4 las células, y el hecho de que el bloqueo de p-Akt por el inhibidor de PI3K impedido la degradación de PDCD4 durante el proceso de privación de suero y re-expresando Además, hemos propuesto un potencial de control de retroalimentación de PDCD4 través de la vía de p-Akt: establecimiento de PDCD4 exceso clones estables que expresan sólo podían ser alcanzadas cuando se inhibe la degradación de PDCD4, que requiere supresión de la expresión de p-Akt (Figura 5). Sin embargo, no se han identificado los mecanismos potenciales que median este control de retroalimentación y las moléculas implicadas y se requieren más investigaciones.
elevada PTEN y suprimido p-Akt se encontraron en la PDCD4 sobre-expresión de los clones estables. Cuando las células se mueren de inanición con medio libre de suero, PDCD4 era ONU-fosforilada debido a la expresión de p-Akt suprimida. fosforilada-Un PDCD4 no fue reconocido por proteasoma lo que conduce a la acumulación de PDCD4. Cuando el suero fue re-administrado a las células, hasta reguladas p-Akt fosforilada PDCD4, que después se agota a través de la degradación del proteasoma. La administración de cualquiera de inhibidor de PI3K LY294002, capaz de prevenir PDCD4 de ser fosforilada por p-Akt, o MG132 inhibidor del proteasoma, evitando el agotamiento de PDCD4, lo que lleva a la acumulación de PDCD4.
Nuestros resultados actuales demostrado una translocación de PDCD4 endógeno de núcleo al citoplasma a la inanición de suero. La hipótesis de que PDCD4 fuerza transportan al citoplasma para exhibir su función inhibidora de la traducción de proteínas cuando las células estaban en condiciones de crecimiento desfavorables. De acuerdo con nuestros hallazgos previos, se observó una localización diferencial de PDCD4 entre muestras de tejido de ovario normales y malignos: se observó más localización citoplasmática de PDCD4 en muestras de tejido de cáncer de ovario [17]. Cuando tumor crece, puede haber algunas regiones donde la concentración de oxígeno es significativamente menor que en los tejidos normales, y las células tumorales se encuentran bajo un estrés hipóxico. Una hipótesis es que en estas células, PDCD4 puede transporte al citoplasma para inhibir la traducción y, posteriormente, el crecimiento celular. En general, las funciones PDCD4 como supresor de tumores en el núcleo en las células normales, sin embargo, cuando las células estaban bajo cierta tensión ambiental o a una transformación potencial de normal a maligno, una de la respuesta celular podrían ser el transporte de PDCD4 al citoplasma. Esto hace que la localización de PDCD4 como un indicador de las células bajo ambiente de crecimiento anormal o transformación neoplásico. Sin embargo, el mecanismo de translocación de PDCD4 todavía no está claro y la hipótesis necesita ser evaluado más.
Materiales y Métodos
El cultivo celular, el tratamiento y la privación de suero fármaco de tratamiento
líneas celulares de cáncer de ovario y OVCA433 SKOV3 utilizados en este estudio fueron regalo del Prof. SW Tsao, Departamento de Anatomía de la Universidad de Hong Kong. líneas celulares de cáncer de ovario C13 y OV2008 eran regalo del Prof. BK Tsang, Departamento de Obstetricia y Ginecología, Universidad de Ottawa, Canadá. Estas líneas celulares se cultivaron en MEM, con 10% de suero bovino fetal (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).
células bajo tratamiento privación de suero se cultivaron en MEM sin FBS. Fosfoinositida 3-quinasa (PI3K) inhibidor LY294002 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), MEK U0126 inhibidor (Señalización Celular), inhibidor del proteasoma MG132 (señalización de la célula) se disolvieron en DMSO (Sigma Co., St. Louis, MO ) y se diluyó aún más antes de una presentación a las células. Medio con DMSO solo también se incluyó como control.
Los anticuerpos y el análisis de transferencia
La extracción de proteínas occidental y métodos de Western blot fueron los mismos que se describe anteriormente [17]. anticuerpo PDCD4 era de Rockland (Rockland, Gilbertsville inmunoquímicos, PA); anticuerpos de p21, ciclina A, ciclina y p53 eran de Santa Cruz; anticuerpos de PTEN, p-Akt, Akt, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, Cdc25A, mTOR eran de señalización celular; anticuerpo de p27 era de los laboratorios de transducción de BD.
Construcción de ADNc PDCD4 vector de expresión
PDCD4 ADNc de longitud completa se amplificó por PCR utilizando ADNc humano PDCD4 clon (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) (número de banco de genes de adhesión NM_014456.3) como el molde y los siguientes pares de cebadores 5 'gaattccATGGATGTAGAAAATGAGCAGA 3' (sentido) y 5 'gtcgacTCAGTAGCTCTCTGGTTTAAGA 3' (antisentido), que contenía sitios de enzimas de restricción EcoRI y SalI. a continuación, un producto PDCD4 PCR de 1,5 kb, de longitud completa se clonó en el marco, dentro de pEGFP-C1 (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Establecimiento de PDCD4 Øver- expresando clones estables
plásmido o vector PDCD4 GFP-C1 se transfectó en células de cáncer de ovario OVCA433 y SKOV3 utilizando reactivo de transfección FUGENE HD (molecular Biochemicals, Roche Manniheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.