Extracto
Hemos demostrado previamente que las células de cáncer de próstata humano son capaces de adquirir los atributos malignos mediante la interacción con las células del estroma en el microambiente tumoral, mientras que las células del estroma que interactúan también pueden llegar a ser afectada con tanto fenotípicas y genotípicas alteraciones. En este estudio se utilizó un modelo de co-cultivo para investigar el mecanismo subyacente a la co-evolución de las células cancerosas y del estroma. células de cáncer rojas fluorescentes dependientes de andrógenos de próstata LNCaP fueron cultivadas con un par emparejado de las células normales y asociadas con el cáncer de próstata miofibroblastos para simular la interacción con el cáncer del estroma, y los cambios celulares en el co-cultivo se documentaron mediante el seguimiento de la fluorescencia roja. Encontramos fusiones espontáneas frecuentes entre el cáncer y las células del estroma durante todo el co-cultivo. En los ensayos de formación de colonias que evalúan el destino de las células híbridas, la mayoría de los híbridos de fusión con el cáncer estromal permanecieron de detención del crecimiento y, finalmente perecido. Sin embargo, algunos de los híbridos sobrevivieron para formar colonias de la co-cultivo con células del estroma asociadas con el cáncer. Estos clones derivados mostraron alteraciones genómicas, junto con fenotipo independiente de andrógenos. Los resultados de este estudio revelan que las células de cáncer de próstata son fusogénica, y la interacción con el cáncer del estroma pueden conducir a la fusión espontánea entre los dos tipos de células. Mientras que una estrategia de fusión con el cáncer estromal puede permitir que el compartimiento del estroma de aniquilar a la invasión de las células cancerosas, ciertos híbridos cáncer estromal con una mayor capacidad de supervivencia pueden escapar a la aniquilación para formar una población de células cancerosas derivada con un genotipo alterado y el aumento de la malignidad. por tanto, la fusión con el cáncer estromal establece una base para un incesante coevolución entre el cáncer y las células del estroma asociadas al cáncer en el microambiente tumoral
Visto:. Wang R, X Sun, Wang CY, Hu P, Chu CY , Liu S, et al. (2012) Fusión espontánea Cancer Cell-estromal como un mecanismo de progresión del cáncer de próstata independiente de andrógenos. PLoS ONE 7 (8): e42653. doi: 10.1371 /journal.pone.0042653
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 29 de mayo de 2012; Aceptado: 9 Julio 2012; Publicado: 3 Agosto 2012
Copyright: © Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por becas de investigación R21CA112330 y CA132388 del NCI /NIH (Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de Salud de los Estados Unidos.), y PC040578 del Departamento de Defensa de Ruoxiang Wang; y NCI /NIH subvención CA98912-02 a Leland W. K. Chung. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
tratamiento del cáncer de próstata es a menudo un retroceso de la progresión independiente de andrógenos y la metástasis ósea. Considerando cáncer primario es inicialmente dependiente de andrógenos y puede ser curable por la privación de andrógenos, la independencia androgénica es común a cáncer recurrente y la metástasis, que a menudo son incurables. Junto con la progresión de la primaria al estado metastásico, las células cancerosas han adquirido ciertas características favorables para la supervivencia en ausencia de andrógenos [1], [2].
La causa de la independencia de andrógenos quedan por esclarecer. receptor de andrógenos elevada actividad (AR) y la supervivencia mejorada en las células de cáncer pueden estar contribuyendo factores [3], [4], pero las células del estroma en el microambiente tumoral también juegan un papel importante [5]. En la próstata normal, la capa epitelial glandular está separada estructuralmente de la estroma circundante por una membrana laminar sótano. En el cáncer de próstata, la infiltración de células de cáncer formaría contactos directos con las células del estroma, colocando el proceso de la progresión del cáncer en el contexto de un microambiente estromal. Delinear el mecanismo de interacción con el cáncer estromal es una prioridad para la mejora del tratamiento del cáncer de próstata.
Hemos definido una función obligatoria del estroma mesenquimal en la progresión del cáncer de próstata a la independencia de andrógenos mediante el modelado de la interacción entre las células cancerosas y del estroma [6], [7], [8], [9]. células de cáncer de próstata humano LNCaP, por ejemplo, son dependientes de andrógenos cuando se ensaya para la formación de tumores en ratones atímicos machos castrados. Estas células, sin embargo, podían formar tumores frecuentes cuando se co-inoculados con células de la médula ósea linaje mesenquimal del estroma [9], [10]. Curiosamente, las células cancerosas se recuperaron de los tumores resultantes eran independiente de los andrógenos, que produce constitutivamente altos niveles de antígeno prostático específico (PSA), que forma reproducible tumores de xenoinjertos andrógeno-independientes, y que muestra con frecuencia la capacidad metastásica de hueso [9], [10]. Para simular el
in vivo
cáncer del estroma interacción, que co-cultivadas del cáncer y las células del estroma en condiciones convencionales y 3 dimensiones. Al entrar en contacto directo, las células de miofibroblastos del estroma podrían rescatar las células LNCaP de la muerte inanición inducida por andrógenos [11], mientras que 3-dimensional de co-cultivo resultó en cambios expressional constitutivas, tanto en el cáncer y las células del estroma [12], [13], refleja la co-evolución entre las células cancerosas y estromales mesenquimales observados en la progresión del cáncer de próstata y metástasis ósea. Curiosamente, las células cancerosas recuperados de la co-cultivo llevaban alteraciones genómicas permanentes, detectados por la aparición de cromosomas marcadores. alteración genómica puede ser la base para la aneuploidía, la anomalía más visible en los cánceres metastásicos [14], [15]. Investigación sobre el contacto directo entre las células cancerosas y del estroma puede desvelar el mecanismo por el cual la interacción con el cáncer estromal promueve la progresión del cáncer de próstata y metástasis óseas.
En este informe, se emplearon métodos de co-cultivo de seguir investigando la causa de la independencia de andrógenos. células LNCaP etiquetadas con una proteína fluorescente de color rojo se superpone sobre una monocapa de células de próstata miofibroblastos para facilitar el contacto directo entre los dos tipos de células. Mediante el seguimiento de la fluorescencia roja, se encontró que las células cancerosas podrían fusionar espontáneamente con las células del estroma. Al seguir el destino de los híbridos con el cáncer estromal, se encontró que la mayoría de las células fusionadas murieron, mientras que unos pocos podían sobrevivir para formar clones. Los clones derivados exhiben pérdida cromosómica, con un crecimiento acelerado y la producción elevada de PSA de una manera independiente de los andrógenos. la fusión de células del estroma del cáncer es, pues, un mecanismo que contribuye a la progresión del cáncer de próstata independiente de andrógenos.
Métodos
Células y condiciones de cultivo celular
El origen del cáncer de próstata humano LNCaP línea celular utilizada en este estudio se informó anteriormente [16]. El establecimiento de RL-1, un clon LNCaP que expresan una proteína de fluorescencia AsRed2, junto con el aislamiento y caracterización de un par emparejado de HPS-14 normal y HPS-15 de la próstata humana clones miofibroblastos del estroma asociadas con el cáncer se informó anteriormente [11]. La las líneas de células MRC-9 fetales humanos estromales de pulmón MRC-5 y se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). CALP, una línea celular primaria humana normal del estroma de la próstata, se adquirió de Lonza Walkersville, Inc. (Walkersville, MD). Todas estas células se mantuvieron a 37 ° C en T-medio (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), ampicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 mg /ml), con aire humidificado complementan con un 5% de CO
2. las células del estroma de médula ósea normal humana multipotentes mesenquimales transducidas con una proteína de fluorescencia verde lentiviral (hMSC-GFP) se adquirieron del Centro de Tulane para la terapia génica (Universidad de Tulane, Nueva Orleans, LA) y se cultivaron en α medio esencial mínimo (Invitrogen) que contiene 16,5 % de SFB y 2 mM de L-glutamina [17].
co-cultivo
directo co-cultivo de las células cancerosas y estromales se informó anteriormente [11]. Para formar una monocapa de células estromales, 5 × 10
5 células del estroma en 2 ml de medio se sembraron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, y se dejaron crecer en plena confluencia. El medio se retiró y 5 × 10
5 células del LNCaP fluorescente roja RL-1 clon en 4 ml de medio fresco se superpone sobre la monocapa. El medio de co-cultivo se cambió cada tres días.
Colonia ensayo de formación de
Las células se estudiaron fueron recogidos después del tratamiento con tripsina-EDTA y se diluyó a una suspensión de una sola célula de baja densidad (4 células /ml). A cada pocillo en una placa de 96 pocillos, se aplicaron 100 l de la suspensión. Después de 24 horas de incubación, las placas fueron examinadas bajo microscopio y pocillos que contienen una sola célula se marcaron. Después de 8 semanas de cultivo, las colonias formadas en los pozos fueron amplificados marcados para su posterior caracterización.
tratamiento con andrógenos
El protocolo para el tratamiento de las células cultivadas con andrógenos se informó anteriormente [18]. En pocas palabras, el mismo número de células (5 × 10
5 /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos. Después de la unión, la privación de andrógenos se hizo cultivando las células con rojo fenol libre de RPMI 1640 (Invitrogen) durante 48 horas. El medio se cambió a rojo fenol libre de RPMI 1640 que contiene 1% de dextrano-carbón despojado FBS. metiltrienolona andrógeno sintético (R1881, Perkin Elmer, Waltham, MA) se añadió al grupo de tratamiento con 5 nM. Después de 24 horas de tratamiento, se recogió el medio de cultivo para la medición de PSA y se recogieron las células para la preparación de lisado de células enteras.
PSA ELISA
Medio de cultivo celular se usó para detectar la producción de PSA utilizando nuestro protocolo previamente informado [11]. Se utilizó un kit de ELISA comercial PSA (Estados Biotech Inc., Mountain View, CA) y ensayos por triplicado se realizaron en cada muestra.
La proliferación celular ensayo
El protocolo utilizado para el ensayo de proliferación celular con conversión de MTT se informó anteriormente [11]. En pocas palabras, el mismo número de células (5 × 10
5 /ml) se sembraron en una placa de 96 pocillos. Después del tratamiento de andrógenos como se describió anteriormente, las células se sometieron a un ensayo de proliferación. ensayos por triplicado se realizaron en cada grupo.
Western Blot
El protocolo de transferencia de Western se informó anteriormente [18]. En este estudio, 20 g de proteína de lisado celular total se fraccionó y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se detectó con anticuerpos específicos a AR (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA). El nivel de la β-actina se utilizó como control de carga.
análisis de PCR
se informó anteriormente Las condiciones para la amplificación de ADN genómico [18]. En este estudio, se detectaron cromosomas sexuales con el método de determinación del sexo forense [19]. El par de cebadores utilizado para la detección de genes amelogenin era 5'-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3 'y 5'-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3' [20]. Este par detecta tanto el ligada al cromosoma X y los genes amelogenin Y-ligado, produciendo un producto de 977 pares de bases (pb) de intrón 3 del gen ligado al cromosoma X y un producto de 788 pb del gen relacionado-Y en un solo análisis PCR. Un par de cebadores de 5 'ATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGC-3' y 5'-CTACAGCTTTGTCCAGTGGCTGTAGCGGTC-3 'se utilizó para detectar la región de codificación (615 pb) del gen SRY Y-específico. El producto de la reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio.
clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) análisis
El protocolo para el ensayo de FACS se ha descrito anteriormente [11]. En este estudio, las células cultivadas se despegaron con tripsina-EDTA. Después de ser lavado en solución salina tamponada con fosfato y se fijaron en alcohol etílico 75%, las células se tiñeron con yoduro de propidio en presencia de RNasa A durante 30 minutos y se sometieron a análisis FACS para el perfil del ciclo celular. células mononucleares de sangre periférica de dos varones sanos se utilizaron como control normal para el contenido genómico. El uso de muestras de donantes fue aprobado por un Consejo de la Escuela Universitaria de Medicina de Emory (número IRB 278 a 2006) Revisión Institucional, con el consentimiento informado por escrito de los participantes.
La microscopia de fluorescencia
El protocolo para obtener imágenes de fluorescencia roja se informó anteriormente [11]. En este estudio, a efectos de comparación se tomaron todas las imágenes fluorescentes de color rojo con un ajuste fijo: 4,15 segundos para la formación de imágenes a 40 aumentos aproximadamente, 2.075 segundos para la formación de imágenes en un aumento de 100x, y 1.0375 segundos para la formación de imágenes a 200 × magnificación
resultados
1. Características del cáncer de próstata y las células del estroma en el sistema de co-cultivo
Se utilizó una proteína fluorescente roja para rastrear las células LNCaP en co-cultivo [11]. Un clon representativo rojo fluorescente LNCaP, RL-1, se utilizó en este estudio. células RL-1 se muestran las tasas de crecimiento (Figura 1A), la producción de PSA (Figura 1B) y el nivel AR (Figura 1C) similar a las células LNCaP parentales. A nivel genómico, las células RL-1 contenían el cromosoma Y (Figura 1D), una característica genómica que se perdió en la progresión independiente de andrógenos [21]. Tanto las células LNCaP parentales RL-1 y se muestran un idéntico contenido genómico casi tetraploide (Figura 1E), lo que indica un cariotipo XXYY [21]. Cuando se ensayó la formación de tumores de xenoinjertos, células RL-1 no formaron tumores subcutáneos en ratones sin timo, por lo que conserva la propiedad de no-tumorigénico de las células LNCaP parentales.
A, respuesta de crecimiento diferencial a los andrógenos. Las células originales LNCaP y el fluorescente de color rojo RL-1 clon, junto con un par emparejado de las células del estroma de la próstata, HPS-14 (normal) y HPS-15 (cáncer asociado-), se compararon para la proliferación por la conversión de MTT. Después de la privación de suero de 48 horas, las células se trataron en un medio normal de cultivo (control), medio de privación de andrógenos (privación), y medio de privación de andrógenos que contiene 5 nM andrógeno sintético R1881 (R1881). ensayos de MTT se realizaron 48 horas después. Los datos representan la media ± desviación estándar de un ensayo por triplicado. B, la producción diferencial de PSA. se detectó medio de cultivo de las células tratadas para la concentración de PSA con ELISA. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de ensayos por triplicado. C, la expresión diferencial AR. Las células se sometieron a transferencia de Western para la expresión AR. El estroma humano línea celular PRSC normal se utiliza en la comparación. El nivel de expresión β-actina se utilizó como control de carga. El resultado fue representativos de dos experimentos separados. D, cariotipo diferencial. ADN genómico se utilizó PCR para detectar cromosomas sexuales con un método de determinación del sexo forense [20]. células MRC-5 y MRC-9 fueron para preparar macho y hembra de ADN genómico, respectivamente. En el panel superior (Amelogenina), el cromosoma X se detectó como la banda superior, mientras que el cromosoma Y se detectó como la banda inferior. En el panel inferior (SRY), se utilizó locus SRY del cromosoma específico para confirmar la presencia del cromosoma. E, diferenciales contenidos genómicos. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un varón sano para mostrar el contenido genómico diploide normal medido por FACS. células RL-1 tenían un contenido genómico casi tetraploide, similar a las células LNCaP parentales [21]. HPS-14 y células HPS-15 mostraron contenidos genómicos similares a las PBMC normal.
Hemos caracterizado previamente parejas de HPS-14 normales y 15 HPS-clones del estroma de próstata asociados con el cáncer humano [11] , que eran grandes y de crecimiento lento miofibroblastos (Figura 1A) que no expresan PSA (Figura 1B). Curiosamente, ninguno de los clones del estroma expresaron niveles detectables de AR por transferencia Western (Figura 1C) o mediante RT-PCR (datos no mostrados). HPS-14 células contenían el cromosoma Y, que se había perdido en la contraparte asociado al cáncer (Figura 1D). La citometría de flujo reveló que tanto HPS-14 y HPS-15 mantiene un contenido genómico cerca de la de las células mononucleares de sangre periférica humanos normales (Figura 1E).
2. fusión espontánea de las células cancerosas y estroma
Para investigar la interacción con el cáncer estromal en co-cultivo, las células se cubrieron RL-1 sobre una monocapa confluente de HPS-14 o HPS-15 células, por lo que el cáncer de las células estaban en contacto directo con las células del estroma. células RL-1 mostraron un tamaño de aproximadamente 15 micras x 50 micras (Figura 2A), mientras que las células del estroma fueron en mucho más grande y más formas expandido pero sin ninguna fluorescencia roja (Figura 2B).
RL-1 células (a) y HPS-15 células (B) se muestran en la cultura separada. Después de 7 días de co-cultivo, fusión espontánea podría ser visto (C). A mayor aumento, la célula fusionada contenía dos núcleos, una fluorescencia de color rojo y el otro pálido con fluorescencia (D). fusión Cáncer-estromal se observa con frecuencia en las zonas donde RL-1 y HPS-15 formados contacto cercano (E). En algunos casos, las células en el medio de una fusión podría ser visto (F). Los dos núcleos se podían ver cerca uno del otro (G) o separado (H). Para cada punto de vista, se muestran una imagen de contraste de fase (arriba) y la imagen de fluorescencia roja (abajo). Las flechas se usan para indicar núcleos.
Inspección diaria reveló que las células en la monocapa estromal podrían ponerse roja fluorescente durante el co-cultivo (Figuras 2C y 2D). Que las células del estroma fluorescentes rojas resultado de la fusión con las células de cáncer de RL-1 se determinó sobre la base de las siguientes observaciones. En primer lugar, se encontró que las células del estroma de color rojo fluorescente principalmente adyacente a las células cancerosas (Figura 2E). En segundo lugar, aunque la tecnología en tiempo real no se había utilizado para registrar el proceso dinámico de la fusión, no fue difícil encontrar casos en los que una célula cancerosa se fusionan con una mitad de células del estroma (Figura 2F). En tercer lugar, muchas de estas células estromales contenía dos núcleos, uno rojo fluorescente que indica su derivación de una célula de cáncer, y el otro pálido con fluorescencia que implica su origen estromal (figuras 2C a 2H). Los glóbulos rojos en la monocapa estromal con un aspecto del estroma fueron híbridos citoplasmáticos de fusión entre el cáncer y las células del estroma.
células del estroma, además, co-cultivadas para observar la fusión cáncer-estromal. Uno de los estudios fue un co-cultivo de células RL-1 con hMSC-GFP, las células mesenquimales de la médula ósea humana normales del estroma que expresan una proteína de fluorescencia verde [17]. El co-cultivo se observó a las 4 semanas con una población 25% calculados como dualmente células fluorescentes, las células fluorescentes verdes con la morfología del estroma distinta emisor de fluorescencia de color rojo, la mayoría con un núcleo rojo fluorescente adicional (figuras 3). Todos estos estudios confirmaron que la que las células cancerosas de próstata LNCaP fluorescentes rojos eran fusogénico. Una vez en contacto directo, las células RL-1 podrían fusionarse a las células del estroma.
eventos de fusión de células de cáncer estromal representante de la co-cultivo de células RL-1 con células hMSC-GFP se muestran. A, Un evento único de fusión en el día 7 se muestra en campo claro, fluorescencia verde y la fluorescencia roja. Las imágenes de fluorescencia verde y rojo se fusionan (fluorescencia resultante de la fusión) para mostrar los dos núcleos de diferente fluorescencia. B, las imágenes de fluorescencia combinadas para 4 eventos de fusión adicionales se muestran, con eventos 1 y 2 registrados a día 7, y 3 y 4 en el día 14. Las flechas se usan para indicar núcleos. Todas las imágenes se muestran a 200 × magnificación.
3. Características del cáncer estromal fusión celular
Desde el par de células del estroma fue de crecimiento lento y estaba inhibiendo el crecimiento de células RL-1 [11], un co-cultivo puede mantenerse durante 8 semanas para la documentación periódica en 4 experimentos repetidos. la fusión de células poco se vio en las primeras 48 horas de co-cultivo. Las células teñidas de rojo fluorescente en la capa estromal comenzaron a aparecer después con el aumento diario de números a una meseta alrededor de 4 semanas, momento en el que un máximo del 20% de la población del estroma estaba involucrado en la fusión (Figura 4). La fusión con el cáncer estromal, pues, una crónica de un proceso espontáneo y.
No se observaron co-cultivos de RL-1 y HPS-15 células semanal de frecuencia de la fusión celular. Para cada punto de vista, se muestran una imagen de contraste de fase (arriba) y la imagen de fluorescencia roja (abajo). Las flechas se usan para indicar eventos de fusión de células de cáncer-estromal. Todas las imágenes se muestran a 40 aumentos.
El cáncer de fusión-estromal se llevó a cabo sólo cuando se utilizaron células cancerosas viables. Co-cultivo con células muertas RL-1, muerto por la privación de andrógenos, la radiación ultravioleta germicida, broche de congelación, o la desecación al vacío, era incapaz de hacer que las células del estroma con fluorescencia roja en 8 semanas. Además, la incubación con ADN purificado genómico a partir de células RL-1 (10 g /ml) o el ADN plásmido pAsRed2 (10 g /ml) no causó fluorescencia roja en las células del estroma. La fusión espontánea del cáncer del estroma parecía un proceso activo, que requiere la participación tanto del cáncer y las células del estroma.
En los 4 experimentos de co-cultivo separadas, no hemos encontrado una diferencia entre el HPS-14 normales y el HPS-15 células estromales asociadas con el cáncer en términos de su frecuencia de fusión con células cancerosas. RL-1 también podría fusionarse con otras parejas de células del estroma de próstata humanos establecidos en nuestro laboratorio [11] y con las células del estroma derivadas de otros tejidos, incluyendo la médula ósea células mesenquimales del estroma (Figura 3). Las células cancerosas fusogénicas parecía tener el potencial de fusionar con una amplia variedad de otras células.
En la pelea co-cultivo con células estromales de próstata, nos dimos cuenta de que las células híbridas progenie que retuvieron la morfología del estroma rara vez se produjeron. Siguiendo 32 células híbridas desde el día 7 hasta el día 28 en un co-cultivo, por ejemplo, no hemos encontrado ninguno de los híbridos que se dividen en grupos clonales con la morfología del estroma, ni de la co-cultivo con las células hMSC-GFP (Figura 3). Los híbridos parecía tener un destino interesante: o tenían dificultad para iniciar la división celular, o sus descendientes habían adquirido la morfología divergente
4.. El destino de los híbridos
La fusión de células del estroma cáncer es un proceso biológico que sirve funciones esenciales [22], [23], [24], [25]. Mientras que la fusión citoplasmática
per se
es un mecanismo de sinergismo, sino que también proporciona una oportunidad para la fusión nuclear, lo que lleva a la producción de células hijas heterogéneos de ambos padres. Tenemos un seguimiento del destino de las células híbridas cáncer estromal para evaluar la significación patológica. células RL-1 se co-cultivaron con HPS-14 y HPS-15 células durante 4 semanas, y luego fueron tratados con G418 (200 mg /ml) durante 7 días para eliminar las células del estroma que no participan en la fusión. células RL-1 correspondientes a estas células del estroma se eliminaron simultáneamente. Se recogieron las células híbridas enriquecidas en suspensión de una sola célula, chapado por dilución limitante, y se someten a la formación de colonias durante otras 8 semanas.
El híbridos morfológica compartida y características de comportamiento a lo largo del ensayo de formación de colonias. Al principio, los híbridos singulares exhibidos tamaños expandido de manera espectacular, más que contiene dos núcleos, ambos mostrando similares fluorescencia roja (Figura 5A). Un híbrido podría sobrevivir durante más de 4 semanas bajo las condiciones de ensayo, de acuerdo con el potencial de supervivencia marcada de las células del estroma de los padres [11]. Sorprendentemente, las células híbridas aparecieron en reposo, ya que no la división celular se observó durante las primeras 4 semanas de formación de colonias. En comparación, los padres RL-1 y células del estroma de este tiempo se formó colonias sustanciales en tamaños sustanciales en ensayos de control en paralelo. Después de 4 semanas de la formación de colonias, muchas de las células híbridas adoptadas morfologías atípicas y núcleos adicionales acumulados (Figura 5B). La incapacidad de dividir parecía ser debido a deficiencias en la citocinesis en lugar de en la replicación del ADN.
se muestran morfologías representativos de las células híbridas durante la formación de colonias. A las dos semanas de la cultura, la mayoría de los híbridos contenían dos núcleos de fluorescencia similar. No se observó la división celular. B, cuatro semanas después del co-cultivo, las células híbridas adoptó morfología atípica con múltiples núcleos. No se observó la división celular. C, Seis semanas en el cultivo, las células híbridas restantes se convirtió en delgado o estrecho, con múltiples núcleos en los segmentos de la célula. D, ocho semanas en la cultura, la división celular llegó a ser frecuente. La división celular anormal, ya que produce células hijas en formas variadas y con viabilidad reducida. Para cada punto de vista, se muestran una imagen de contraste de fase (arriba) y la imagen de fluorescencia roja (abajo). Cuando sea necesario, las flechas se usan para indicar núcleos. Todas las imágenes se muestran a 200 × magnificación.
Cerca de la mitad de los híbridos pereció 6 semanas después de la formación de colonias. Aunque la causa de la muerte celular aún no se ha definido, se sabe que la fusión entre las células con tasas diferenciales de la proliferación conduce a la catástrofe mitótica [26], [27]. Dentro de un híbrido de cáncer del estroma, el control de la mitosis en conflicto por los dos núcleos asíncrono podría dar como resultado, ya sea en un fallo en la iniciación de la división celular, o en una mitosis anormal y división asimétrica. Una célula en la catástrofe mitótica muere a través de mecanismos programados genéticamente [28]. La causa de la muerte de la célula híbrida era probable catástrofe mitótica.
Las células restantes en este momento se convirtieron encogido, presentan una forma alargada, que contiene múltiples núcleos en diferentes segmentos de la célula (Figura 5C). Ninguna de estas células sobrevivieron para crecer en colonias. En particular, la división celular parecía ser iniciado en menos del 5% de los híbridos restantes, ya que las células plurales comenzaron a aparecer en unos pocillos de cultivo.
La división celular sólo se hizo visible a las 8 semanas. Dado que sólo una pequeña fracción de los híbridos sobrevivido hasta este momento, la división celular era frecuente. La división, sin embargo, parecía anormal debido a que las células hijas mostraron morfologías mutuamente divergentes (Figura 5D), y la mayoría murió finalmente. Sobre la base de estas observaciones y mediante el seguimiento de 2.800 híbridos en 4 estudios repetidos (Tabla 1), llegamos a la conclusión de que el destino principal de los híbridos con el cáncer estromal era la muerte. las células del estroma de próstata, después de haber sido fundida por las células cancerosas, podrían funcionar como una barrera contra la supervivencia de las células cancerosas.
En comparación con contraparte normal, la función de barrera en HPS-15 células del estroma asociadas con el cáncer podría ser deficiente, debido a que algunos híbridos de la fusión con HPS-15 sobrevivieron y crecieron en colonias. A partir de 4 estudios de RL-1 y HPS-15 co-cultivo, hemos sido capaces de establecer 9, 6, 12, y 14 clones de cada estudio, respectivamente (Tabla 1). La morfología y el crecimiento de las células a lo largo de derivados cambiaron el proceso de clonación. En general, las células con núcleos plural desaparecerían, los que tienen morfología atípica perecerían, tamaños de celda disminuirían, y la tasa de crecimiento aumentarían. Por el momento los clones crecieron en un 1 × 10
6 población, que tomó cerca de 20 divisiones, las células de un clon derivado aparecerían en una morfología uniforme, que era casi indistinguibles de las células cancerosas parentales (Figura 6). Parecía que la descendencia inmediata de los híbridos con el cáncer estromal eran inestables. La inestabilidad, sin embargo, se perdió gradualmente durante el proceso de proliferación.
La morfología de una colonia derivado fue seguido durante el proceso de clonación, que crece de un solo pocillo de una placa de 96 pocillos a un solo pocillo de 24 así placa, a un solo pocillo de una placa de 6 pocillos, y a una placa de 10 cm. Para cada punto de vista, se muestran una imagen de contraste de fase (arriba) y la imagen de fluorescencia roja (abajo). Todas las imágenes se muestran en un aumento de 100x.
5. la independencia de andrógenos de los clones derivados de la fusión con el cáncer estromal
Nos caracteriza los primeros 9 clones derivados obtenidos a partir de RL-1 fusión con el HPS-15 células (Tabla 1), que fueron nombrados a partir de RLH15-1 RLH15 -9. A nivel genómico, todos los clones perdieron por completo el cromosomas Y (Figura 7A). En lugar del cariotipo XXYY sabe que las células parentales RL-1, estos clones llevaban un cariotipo XX similar a la de las células derivadas C4-2 independientes de andrógenos en el linaje LNCaP [21]. A pesar de estos clones expresaron niveles similares de proteína AR a las células parentales RL-1, unos pocos (
es decir
, los clones 1, 6, 8 y 9) los niveles de AR está representada sufridas durante la privación de andrógenos (Figura 7B), sugestivo de insensibilidad a los andrógenos. Es importante destacar que todos estos clones expresaron niveles marcadamente elevados de PSA, la mayoría de los cuales apenas se vio reducida a la privación de andrógenos (Figura 7C), lo que indica la independencia de andrógenos. En ensayos de proliferación celular, todos los clones mostraron un aumento significativamente las tasas de crecimiento en comparación con las células parentales RL-1, mientras que la privación de andrógenos inhibe sólo parcialmente el crecimiento de estos clones (Figura 7D). Aumento del nivel de AR, la producción de PSA y tasa de proliferación, así como la insensibilidad a la privación de andrógenos, se asocia generalmente con el estado maligno. Parecía que los clones derivados habían adquirido rasgos malignos adicionales.
genotípicas y fenotípicas de los parámetros de los 9 primeros clones de los híbridos de fusión RL-1 y HPS-15 se compararon con los de los 12 primeros clones de la clonación de control . En comparación con RL-1 clones, todos los clones derivados perdieron cromosomas Y (A frente a B). Detectado por Western Blot, algunos de los clones derivados mostraron expresión AR persistente incluso bajo andrógenos deprivaton (C frente a D). En estos estudios, las células se cultivaron durante 48 horas en medio de cultivo regular (C), medio de privación de andrógenos (-), y medio de privación de andrógenos que contiene 5 nM R1881 (+). Se detectaron los clones derivados de expresar mayores niveles de PSA, incluso durante la privación de andrógenos (E frente a F). Cuando la tasa de crecimiento fue ensayada por la conversión de MTT, los clones derivados de la fusión con el cáncer estromal visualizan un crecimiento acelerado de manera independiente de los andrógenos (G frente a H). Los datos representan la media de ensayos por triplicado. Para todos los puntos de datos, la desviación estándar fue de menos de 5% de la media y no se muestra.
Un estudio similar se llevó a cabo con la sola célula de RL-1 clones aislados de una colonia de control paralelo ensayo de formación (Tabla 1). Se examinaron los primeros 12 clones. Ninguno de estos clones perdió cromosomas Y (Figura 7E), y no se detectó ningún nivel AR sostenida sobre la privación de andrógenos (Figura 7F). Todos estos clones muestran la producción dependiente de andrógenos PSA (Figura 7G) y el crecimiento (Figura 7H). Los resultados de este estudio de control sugirieron que el desarrollo de la independencia de andrógenos en los clones derivados de híbridos de cáncer del estroma fue el resultado de la fusión con el cáncer del estroma, en lugar de la desviación clonal en las células RL-1
per se
.
discusiones
Este estudio expone fusión espontánea entre el cáncer de próstata y las células del estroma (Figuras 1, 2, y 3), y fusogenecity descubierto y su espontaneidad como características inherentes de las células cancerosas. Considerando que el presente informe se describe la fusión espontánea entre un único RL-1 clon y un par de células del estroma de la próstata, hemos observado la fusión con el cáncer estromal frecuentes del co-cultivo de 5 clones LNCaP fluorescentes rojos adicionales con 3 pares coincidentes de las células del estroma de próstata líneas que se establecieron y caracterizado previamente [11];