Extracto
GAGE son proteínas, moléculas altamente específicas primates similares con estructura primaria única y funciones celulares no definidos. Ellos están restringidos a las células de la línea germinal en individuos sanos adultos, pero se expresan ampliamente en una amplia gama de tipos de cáncer. En una levadura de dos híbridos pantalla identificamos el regulador transcripcional de los metazoos, células germinales menos (GCL), como un compañero de interacción de GAGE12I. GCL se une directamente las proteínas LEM-dominio (LAP2β, emerina, Hombre 1) en la envoltura nuclear, y encontramos que las proteínas GAGE fueron reclutados a la envoltura nuclear membrana interna por GCL. Sobre la base de experimentos de levadura de dos híbridos análisis y pull-down de polipéptidos GCL GCL, residuos 209-320 (que incluye el dominio ATRÁS) se dedujeron suficiente para la asociación con proteínas GAGE. GAGE mRNAs y mRNA GCL se demostraron en testículo humano y la mayoría de tipos de cánceres, y en los miembros GAGE nivel de proteína y GCL se co-expresan en líneas celulares de cáncer. Estudios estructurales de GAGE proteínas no reveló ninguna estructura secundaria o terciaria diferente, lo que sugiere que son intrínsecamente desordenados. Curiosamente proteínas GAGE forman complejos estables con ADN de doble cadena
in vitro
a concentraciones fisiológicas, y GAGE12I obligados varios fragmentos de ADN de doble cadena diferentes, lo que sugiere secuencia-unión no específica. asociación dual de miembros de la familia GAGE con GCL en la membrana interna de la envoltura nuclear en las células, y con el ADN de doble cadena
in vitro
, implicar a las proteínas GAGE en la regulación de la cromatina en las células germinales y las células cancerosas
Cita.: Gjerstorff MF, Rösner HI, Pedersen CB, Greve KBV, Schmidt S, Wilson KL, et al. (2012) GAGE-cáncer de la línea germinal Los antígenos son reclutados a la envoltura nuclear de células germinales-Less (GCL). PLoS ONE 7 (9): e45819. doi: 10.1371 /journal.pone.0045819
Editor: Eugene A. Permyakov, Academia Rusa de Ciencias, Instituto de Instrumentación Biológica, Federación de Rusia
Recibido: 13 Abril, 2012; Aceptado: August 22, 2012; De publicación: septiembre 20, 2012
Copyright: © Gjerstorff et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Consejo danés de Investigación, la Sociedad danesa del cáncer, los Institutos nacionales de la Salud (RO1 GM48646), la Fundación de Investigación del cáncer de Dinamarca, la Fundación Lundbeck, la Fundación de Investigación LEO Pharma, y la Fundación Hørslev. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la familia GAGE de pequeñas proteínas altamente idénticos, oligómeros se expresa a partir de un locus que contiene 13-39 copias de genes casi idénticos en el cromosoma X [1], [2]. genes GAGE sólo están presentes en los primates superiores y han experimentado una expansión rápida, posiblemente debido a la fuerte selección positiva [3]. En individuos sanos Gage expresión se limita a las células germinales [4], pero la transcripción de genes GAGE se activa al desregulación epigenética en células de cáncer [5]. proteínas GAGE se expresan en una amplia gama de tipos de cáncer, y su expresión se correlaciona con mal pronóstico en cáncer de estómago, carcinoma de esófago y neuroblastoma, que indica un papel en la tumorigénesis [6]. GAGE proteínas son conocidos por aumentar la resistencia celular a diversos agentes citotóxicos asociando directamente con, y que afectan el nivel de los reguladores de apoptosis IRF1 y NPM1 [7], [8], pero se sabe poco acerca de sus funciones moleculares o celulares.
Aquí mostramos que las proteínas interactúan con GAGE GCL, una proteína importante para la integridad de los metazoos envoltura nuclear y el desarrollo de células germinales en
Drosophila Opiniones y ratones [9], [10]. En ambas especies, GCL se localiza en la membrana nuclear interna, y varias líneas de evidencia sugieren que GCL inhibe la transcripción: GCL se requiere para silenciar la transcripción in
Drosophila
células germinales [11], y en células de mamífero, se une GCL el factor de transcripción heterodimérico DP y por lo tanto inhibe los genes E2F-DP-dependientes, que son necesarios para la entrada en la fase S. GCL también se une directamente al menos tres proteínas LEM-dominio (emerin, man1 y LAP2β [12] - [14]) situado en la membrana interna nuclear, y parece requerir proteínas LEM-dominio como co-represores
in vivo
[13], [15]. LEM-proteínas de dominio se unen las laminas (filamentos intermedios y nucleares) son componentes clave de la estructura nuclear 'lamina'.
El componente nuclear 'lamina' de la nucleoesqueleto consiste en redes de filamentos intermedios nucleares formadas por A-tipo o laminas de tipo B [16], en relación con el factor de barrera a la autointegration (BAF) [17], [18] y las proteínas LEM-dominio como emerina [19], [20]. Laminas interactúan con la cromatina y una variedad de proteínas estructurales, reguladoras y de señalización en el núcleo [21], y la estructura nuclear de influencia y muchos caminos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación, la proliferación celular y la apoptosis [22], [23]. Los cambios en la composición o la integridad de la nucleoesqueleto podrían contribuir, por mecanismos que siguen siendo poco conocidos, a la transformación maligna o la progresión del tumor [24]. Por ejemplo, la proteína A /T-ricos-ADN vinculante SATB1 normalmente se forma una estructura de la cromatina-nucleoskeletal silenciar especializada sólo en timocitos; las células de cáncer de mama con alta expresión SATB1 muestran una expresión extremadamente misregulated de genes [25], [26]. Las células que sobreexpresan GCL tienen la estructura nuclear defectuosa, lo que implica GCL como un componente estructural del núcleo [9], [10].
Se presenta proteínas GAGE son reclutados a través de la lámina nuclear GCL en las células, y se unen dsDNA
in vitro
. Estos resultados sugieren que las proteínas GAGE podrían contribuir a la tumorigénesis mediante un mecanismo que implica GCL y la cromatina y la organización lámina también potencialmente nuclear.
Resultados
GAGE proteínas interactúan con el regulador transcripcional de células germinales-menos (GCL)
para comprender mejor las funciones celulares de las proteínas GAGE, se utilizó una levadura de dos híbridos pantalla para identificar socios potenciales. TetR basada en el cribado de una biblioteca de ADNc de testículo longitud completa usando como cebo GAGE12I dio un clon (D2) que presenta crecimiento en medio Ura y la coloración azul en medio X-Gal, lo que indica la interacción entre el cebo y presa (fig. 1A). El plásmido presa de D2 contenía un marco de lectura abierto que codifica los residuos 84-320 de germinal humana homólogo de células menos 1 (GCL, alias GMCL1; NM178439.3). GCL asociación con GAGE12I comprobó de forma independiente basado en la luciferasa (mapeo interactoma basada en la luminiscencia de los mamíferos; 'Lumier'; [27]) ensayos de pull-down. Luciferase-etiquetados GCL y Proteína A-etiquetados GAGE12I (o constructos recíprocas) se expresaron transitoriamente en células HEK293. A continuación, aislados de proteína A fusiones usando perlas recubiertas con IgG y la actividad luciferasa medida (fig. 1B). señales normalizadas (luciferasa unido /entrada) se convirtieron a puntuaciones Z, que representa el número de desviaciones estándar de la media de un conjunto grande de derivados interactúan de forma independiente los no pares, Lumier proteína [27]. pares GAGE12I-GCL mostraron puntuaciones Z en el intervalo de 03/04 a 05/03 (Fig. 1B), lo que indica claramente una interacción entre estas proteínas. En este ensayo también GCL asociado con GAGE2B (puntuaciones Z:. 1.8 a 5.3; Fig 1B), que representa el tipo GAGE2 (GAGE2A-E) de la familia, todos los cuales carecen de una tirosina en la posición 11 que puede ser fosforilada en otros GAGE proteínas [28]. Esto sugirió asociados GCL directa o indirectamente con todos los miembros caracterizados de la familia GAGE. Dado que la levadura de dos híbridos análisis y pull-down ensayos son ambos sistemas complejos, también a prueba el potencial de unión directa entre las proteínas Gage y GCL utilizando recombinante marcada con His GAGE12I producido en la levadura y una proteína de fusión GCL-GST expresada por bacterias disponible en el mercado (Fig. 1C). Sin embargo, la unión directa de GAGE12I y GCL no se detectó en estas condiciones. Especulamos que la unión directa de Gage y GCL podría: (a) requerir un cofactor o modificación posterior a la traducción no previsto durante la expresión bacteriana; (B) ser estéricamente impedido por la cola de His en GAGE12I o la etiqueta de GST en GCL. Alternativamente GAGE y GCL pueden asociar indirectamente.
A. GAGE12I se utilizó como cebo en una levadura de dos híbridos pantalla de una biblioteca de ADNc de testículo. Los plásmidos que codifican putativo presas identificadas en la pantalla primaria fueron rescatados y retransformaron en EGY42 con el vector de cebo GAGE12I (B) o vector de control (C). Clon D2 exhibió crecimiento en medio Ura y la coloración azul en medio X-Gal, lo que indica una interacción entre el cebo y presa. El polipéptido codificado presa de residuos D2 compuesta GCL humanos 84-320, que incluye los dominios de CEL /POZ y BACK propuestas. B. Interacción entre GCL y GAGE12I fue verificada por Lumier desplegables a partir de células HEK293 transfectadas con co-GAGE-fundido y una proteína fusionada-luciferasa GCL. señales luciferasa normalizada (con destino /entrada) se presentan como puntuaciones Z, que representa el número de desviaciones estándar de la media de un conjunto grande de derivados de forma independiente, que no interactúan pares de proteínas Lumier (ver Materiales y Métodos para más detalles). C. desplegable de ensayo con recombinante con cola de histidina GAGE12I y GST-GCL.
Nuestra pantalla de dos híbridos se recuperó específicamente los residuos 84-320 de GCL, que incluye predijeron CEL /POZ y dominios espalda (residuos 109-200 y 214-282, respectivamente). En otras proteínas, dominios de CEL /POZ están implicados en la unión a ADN o actina [29], [30], mientras que ATRÁS-dominios son principalmente alfa-helicoidal, pero han de función [31] hay generalmente atribuido. Para determinar qué dominios GCL eran suficientes para la asociación GAGE12I, se repitió el ensayo con Lumier etiquetada con una proteína GAGE12I y los fragmentos de luciferasa GCL-etiquetados que se muestran en la Figura 2. A partir de estos experimentos, hemos deducido residuos 209-320 GCL fueron tanto necesaria y suficiente asociar con GAGE12I en las células. Esta región incluye los dominios ATRÁS (residuos 214-282), además de 38 restos adyacentes (residuos 283-320). Nuestra Jpred 3 (Universidad de Dundee, Escocia, Reino Unido) el análisis predice que los residuos 209-320 GCL tienen varios motivos helicoidales y segmentos de espiral al azar (Fig. S1). Cabe destacar que los residuos de GCL 232-285 son esenciales para obligar a la subunidad DP del factor de transcripción heterodimérico E2F-DP [29]. Esto es interesante porque los genes E2F-DP-dependientes promueven la proliferación (entrada en la fase S) y son los principales blancos de la represión por el supresor de tumores del retinoblastoma (pRb), que se une a la subunidad E2F [32] - [34]. GCL residuos 232-285, que son esenciales para unirse DP, se incluyen dentro de la región GAGE-asociación deducida (GCL residuos 209-320) (Fig. 2 y Fig. S1). Esta superposición sugirió al menos dos escenarios. En primer lugar, GAGE y DP pueden competir por la unión a GCL, y segundo, las proteínas GAGE podrían influir en la expresión del gen E2F-DP-dependiente.
La unión de diferentes mutantes de deleción GCL a GAGE12I fue probado por ensayo Lumier (como en Figura 1). La región deducido como esenciales para GCL (residuos 209-320) GAGE vinculante incluye los residuos 232-285, que son suficientes para unirse activador transcripcional DP (*) [29].
GAGE y GCL son CO -expresada en los testículos y los cánceres
miembros de la familia GAGE se expresan de forma detectable sólo en las células de la línea germinal y brevemente en tipos específicos de células durante el desarrollo fetal de los primates (es decir, células del ectodermo temprana, las células del estroma del cordón sexual y la corteza suprarrenal fetal células), como se determina por inmunohistoquímica [4], [35] y el análisis de RT-PCR (Fig. 3A) utilizando anticuerpos y cebadores de la PCR esperados de reconocer todos los miembros conocidos de la familia GAGE. Sin embargo, las proteínas GAGE se expresan en el 10-40% de la amplia gama de cánceres humanos [4]. GCL mRNA se detecta de forma ubicua en Drosophila y células de ratón [10], [36] - [38], pero su expresión en las células humanas normales y malignas no se había examinado sistemáticamente. Para determinar qué tejidos humanos podrían expresar tanto GAGE y GCL, se utilizó RT-PCR cuantitativa para medir los niveles de ARNm y GAGE GCL en 48 tejidos diferentes (Fig. 3A y 3B, respectivamente). GAGE mRNA se detectó a niveles bajos en epididymous y el bazo, con altos niveles en testículo (Fig. 3A), como se esperaba. En consonancia con el ratón y Drosophila, GCL mRNA se detectó en todos menos en un tejido humano normal probado; Se detectaron los niveles más altos en la pituitaria, y la excepción fue el músculo, donde GCL ARNm no se detectó (Fig. 3B). Desde GCL se expresa específicamente y requiere en Drosophila y células germinales de ratón, se especula que la expresión GCL en testículo humano también es probable localiza en las células germinales, en los que las proteínas GAGE son abundantes [4]. GCL mRNA también se detectó en todos los tipos de cáncer de mama examinados, entre ellos, el hígado, el pulmón y el cáncer de tiroides que se mostró previamente para expresar proteínas también GAGE [4], y no había ninguna tendencia clara hacia arriba o hacia abajo-regulación de GCL ARNm expresión en cualquier tipo de cáncer en particular (Fig. 3C). A continuación se investigó la expresión de proteínas de GCL y GAGE en un panel de líneas de células cancerosas humanas de diferentes orígenes mediante transferencia Western (Fig. 4). GCL se detectó en 8 de los 9 líneas celulares, incluyendo melanomas, cáncer de mama, cáncer de pulmón y el carcinoma embrionario, y fue co-expresada con proteínas GAGE en 6 de las 8 líneas celulares de estos.
A-C. Quantitative análisis RT-PCR de la expresión relativa de ARNm que codifican todos los miembros conocidos de la familia GAGE (A) o GCL (B) en los tejidos normales, revela co-expresión en testículo. GCL mRNA también se expresó ampliamente en diferentes tipos de cáncer humano (C), como el de mama, hígado, pulmón y cáncer de tiroides que se mostró previamente para expresar proteínas también GAGE [4].
GCL y GAGE expresión de la proteína fue examinado en 9 líneas de células cancerosas humanas derivadas de cuello uterino (HeLa), colon (HCT116), el melanoma (MZ2-MEL), mama (BRCA-MZ01, SK-BR3, T47D, M4A4, MCF7) y cáncer embrionario (NTERA2 ) utilizando transferencia Western. las células de melanoma A375 con la expresión exógena de GCL se incluyeron como control positivo. Anticuerpos: GCL PAB1, Sigma Aldrich; GCL pAb2, A14 clon, Santa Cruz Biotech; GAGE mAb, clon M3 [4], mAb beta-actina, Ab6276; Abcam.
Potencial co-localización de GCL y proteínas GAGE en secciones de tejidos humanos normales y cánceres no podía examinarse debido a la falta de anticuerpos GCL adecuados. Desde GCL ARNm es casi omnipresente en los tejidos humanos, se podría esperar lo mismo para la proteína GCL. Sin embargo, esto no se puede suponer, ya que GCL ARNm se reprime a nivel de traducción en embriones como un mecanismo para limitar la expresión de la proteína GCL con la línea germinal [39]. El apoyo a la hipótesis de que la expresión de la proteína GCL está restringido, se detectaron fenotipos ratones GCL nulos en solo tres tipos de células (hígado, páncreas y testículos) [10]. Aunque la expresión de proteínas GCL puede estar restringido en tejidos humanos normales nuestro análisis de las líneas celulares de cáncer humano sugieren que la proteína GCL se expresa en varios tipos de cáncer.
Estos resultados fueron consistentes con potencial asociación de GAGE humana y GCL en masculino las células germinales y diferentes tipos de células cancerosas.
GCL reclutas GAGE proteínas al interior del sobre nuclear
GCL localiza de forma difusa dentro del núcleo y también cerca de la envoltura nuclear en
Drosophila
[38] y células de ratón [13], en consonancia con su unión directa
in vitro
a las proteínas de la membrana nuclear LAP2β, emerin y Hombre 1 [12] - [14]. Para determinar si GCL influyó en la localización de las proteínas Gage, overexpressed Myc-etiquetados GCL en células HeLa y se utiliza la tinción de inmunofluorescencia indirecta para verificar tanto la localización nuclear de GCL-Myc y su co-localización con laminas endógeno de tipo A cerca de la envoltura nuclear (Fig. 5A). Cuando se sobreexpresa por sí mismo en células HeLa, GAGE12I localizado difusamente con las señales más brillantes en el interior del núcleo (Fig. 5B), en consonancia con la localización de GAGE endógeno en muchas otras líneas de células y tejidos [4]. También como se esperaba, sobreexpresa GCL-Myc localizada tanto en la envoltura nuclear (Fig. 5C) y de forma difusa en el nucleoplasma [10], [13]. Curiosamente, en las células HeLa que expresa transitoriamente tanto GAGE y GCL-Myc, la mayoría de las proteínas GAGE co-localizados cerca de la envoltura nuclear con GCL-Myc, como se muestra para GAGE12I (Fig. 5D) y GAGE1 (Fig. 5E). Los mismos resultados se obtuvieron en las células HCT116 transfectadas (datos no presentados). Del mismo modo en dos líneas celulares de melanoma (MZ2-MEL y SK-MEL-31), la expresión transitoria de GCL-Myc desplazado la distribución de las proteínas endógenas GAGE hacia la envoltura nuclear (Fig. 5F, G). Llegamos a la conclusión exógeno GCL puede reclutar proteínas exógenas y endógenas GAGE a la envoltura nuclear.
A. Inmunohistoquímica doble tinción de Myc-etiquetados GCL humana y laminas de tipo A endógenos (laminas A /C) en las células HeLa transfectadas; GCL co-localizada con las laminas A /C en la envoltura nuclear. SER. células HeLa fueron transfectadas transitoriamente con GAGE12I (B), GCL-Myc (C), o GCL-Myc más o bien GAGE12I (D) o GAGE1 (E). GCL localiza en la envoltura nuclear y reclutó proteínas GAGE desde el nucleoplasma. F-G. líneas celulares de melanoma MZ2-MEL (F) y SK-MEL-31 (G), que expresan altos niveles de GAGE endógeno, se transfectaron para expresar GCL-Myc; inmunotinción reveló translocación mediada por GCL de GAGE del nucleoplasma a la envoltura nuclear. H-K. El análisis inmunohistoquímico de las proteínas GAGE endógenas en tejidos normales humanos y tumores reveló una densa señales GAGE cerca de la envoltura nuclear en las células de la corteza suprarrenal fetal (H), la migración de células germinales primordiales (I), células de carcinoma de mama (J) y de células de melanoma maligno (K) especímenes. (GAGE = DAB /marrón; Núcleos = Mayers con hematoxilina /azul). Bares, 5 micras (A) y 10 m (BK).
A pesar de que la asociación entre las proteínas y GCL GAGE endógenos en las células y tejidos humanos no podía ser investigada debido a la falta de anticuerpos adecuados para GCL immunocyto - e inmunohistoquímica, se podría haber esperado proteínas GAGE se localice en la membrana nuclear de células líneas de cáncer demostrado para expresar GCL endógena por Western Blot (por ejemplo, HeLa, HCT116, MZ2-MEL; Fig. 4). Sin embargo, en estas células se observaron proteínas GAGE en todo el compartimento nuclear. Esto podría ser debido a una necesidad de altos niveles celulares de GCL, solamente alcanzables por la sobreexpresión, para reclutar suficiente de las proteínas nucleares GAGE para exponer su localización en la membrana nuclear. Así, las proteínas GAGE pueden localizar tanto a la membrana nuclear y nucleoplasma en células con niveles normales de GCL. En particular, la tinción inmunohistoquímica de muestras clínicas humanas con anticuerpos GAGE reveló no difusa, señales GAGE densas que parecían concentrarse cerca de la periferia nuclear en las células de la corteza adrenal fetal (Fig. 5H), las células germinales primordiales de los mesonefros (Fig. 5I), células de melanoma maligno (Fig. 5J) y de la mama de carcinoma de células (Fig. 5 K), mayor fundamentación de que las proteínas GAGE asocian con la membrana interna de la envoltura nuclear.
GAGE las proteínas son intrínsecamente desordenados
Los análisis previos de las proteínas GAGE nativa y recombinante por SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño demostró una masa aparente de 26 kDa, que era más grande que su masa predicha y confirmado-MS MALDI de ~13 kDa [2], [4]. Esta migración anómala podría reflejar la composición de aminoácidos inusual de proteínas GAGE, que tienen pocos residuos hidrófobos (15 de 117) y muchos residuos cargados (36 de 117). Sin embargo, estas características también son característicos de las proteínas intrínsecamente desordenadas (PDI) [40], [41]. Para tener en cuenta esta posibilidad hemos aplicado dos algoritmos diferentes para la predicción de estructura de proteínas, FoldIndex y metaPrDOS, a GAGE12I, un miembro representativo de la familia GAGE. Ambos algoritmos predijeron una alta probabilidad de trastorno a lo largo de la proteína (Fig 6A;. Paneles izquierdo y derecho, respectivamente). Desde GAGE12I es & gt; 98% idéntica a casi todos los otros miembros conocidos de la familia GAGE [6], esto sugiere que las proteínas GAGE generalmente carecen de estructura secundaria. La única excepción fue GAGE1; nuestra predicción estructural para GAGE1, que tiene un único dominio C-terminal [6], sugirió esta región C-terminal es alfa-helicoidal (Fig. S1).
A. estructura secundaria y el trastorno de GAGE-12I predichas por dos algoritmos: FoldIndex (panel izquierdo) y metaPrDOS (panel derecho). B. CD espectro UV lejano de GAGE-12I registró a partir de 195-250 nm de 4,5 M GAGE-12I en NaCl 100 mM y fosfato de sodio 50 mM, pH 5,5 a 25 ° C. El mínimo de alrededor de 200 nm, más la falta de otras mínimas distinta, indican claramente que la proteína es predominantemente desplegada. C. 1D
espectro 1H-NMR de 4 mg /ml GAGE-12I en NaCl 100 mM, 50 mM fosfato de sodio pH 5,5, DSS mM 0,15 y 10% D
2O. La muy baja dispersión de las señales de RMN, se nota especialmente en la región alifática, ofrece una clara huella digital de una proteína desplegada.
El trastorno potencial de GAGE12I fue probado por dicroísmo circular (DC) y
Resonancia magnética 1H Nuclear (RMN). Un espectro de CD UV lejano registrado para GAGE-12I mostró sólo una mínima alrededor de 200 nm (Fig. 6B). Este mínimo, y la falta de cualquier elipticidad negativa distinto en la región de 210 a 225 nm (Fig. 6B), mostró que GAGE-12I no tiene tipo extendido de la estructura secundaria. Confirmando esta observación, la 1D
espectro de 1H-RMN reveló una dispersión estrecha de señales (Fig. 6C). En la región del espectro que muestra señales de cadenas laterales alifáticas, no se observaron cambios químicos negativos. La dispersión estrecha de nuevo se ve claramente para las señales de protones de amida en la región de aproximadamente 7-9 ppm. Llegamos a la conclusión GAGE12I no tiene una estructura secundaria o terciaria diferente.
GAGE proteínas se unen a ADN de doble cadena fisiológicos concentraciones
proteínas GAGE localizan en el núcleo de células normales (es decir, las células germinales y las células de la corteza adrenal fetal) y células de cáncer [4]. Por lo tanto, la hipótesis de proteínas GAGE podrían asociarse con el ADN. Esta hipótesis fue apoyada por experimentos desplegables que muestran que GAGE12I recombinante (expresada en la levadura y altamente purificada) [2]), y las proteínas GAGE endógeno presente en MZ2-MEL lisado de células de melanoma, con destino a los nativos de ADN de timo de ternera (Fig. 7, A y B, respectivamente).
A-B. Western blot de experimentos desplegables prueba la unión de GAGE12I recombinante (A) o proteínas GAGE endógenos a partir de lisados MZ2-MEL (B) a la celulosa solo, o de timo de ternero nativo de celulosa-ADN de doble cadena inmovilizada. C. electroforética ensayos de movilidad. Cada concentración indicada de GAGE12I purificado se incubó con el fragmento de ADN EcoRI-PvuII
32P marcado con 90-pb de pUC19 en 1 pg /l; muestras se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa. D. mismo experimento que en (C), pero con la adición de NaCl. E. La predicción de ADN putativo aminoácidos en GAGE12I utilizando el programa de BindN vinculante. +/- = Vinculante /no vinculante; 0-9 = confianza de la predicción de unión.
ensayos de cambio de movilidad electroforética se utilizaron para analizar más a fondo la asociación directa entre proteínas y ADN de doble cadena GAGE utilizando diferentes fragmentos de restricción del plásmido pUC10 o pUC19 (Fig. 7C y figura . S2). A una concentración de ~ 10 ng /l (730 nM), GAGE12I causó un subconjunto de moléculas de ADN de doble cadena para migrar lentamente (Fig. 7C). En presencia de 100 ng /l GAGE12I (7,3 M) más del 50% del ADN de doble cadena migra lentamente (nucleoproteína "complejo 1 ') y también se detectó una aún más lento de la migración compleja (Fig. 7C," complejo 2'), el potencial de lo que sugiere oligomerización. GAGE12I obligado varios fragmentos de ADN bicatenario de secuencia no relacionada, lo que sugiere de ADN independiente de la secuencia de unión (datos no mostrados). Ambos complejos eran estables en NaCl 75 mM, y una pequeña fracción de complejo 1 se mantuvieron estables en NaCl 250 mM (Fig. 7D).
A. transferencias de puntos para estimar el contenido de proteína en GAGE SK-MEL-31 lisados de células enteras MZ2-MEL y por comparación con GAGE12I recombinante. Las transferencias se sondearon con anticuerpos esperados para reconocer todos los miembros de la familia GAGE; el número debajo de cada punto indica la intensidad relativa de la señal. B. Cuantificación relativa de las proteínas GAGE en los núcleos y el citoplasma de MZ2-MEL y las células SK-MEL-31 sobre la base de la inmunotinción intensidades de imágenes confocal midieron utilizando el software ImageJ64.
Se utilizó la predicción de ácido nucleico BindN programa [42] ajustado a una especificidad del 95% para predecir residuos de unión en GAGE12I DNA potencial. Este programa identificado residuos GAGE12I 4-17 como un dominio de unión a ADN putativo (Fig. 7E), pero esto debe ser verificado experimentalmente.
Los resultados anteriores mostraron una concentración GAGE de al menos 10 ng /l (730 nM) se requiere para unirse al ADN a una concentración de 1 pg /l (17 pM), correspondiente a una relación molar de 43:1 (GAGE12I: ADN). Para determinar si estas concentraciones fisiológicamente relevantes fueron GAGE, que mide el contenido GAGE en SK-MEL-31 lisados celulares de melanoma MZ2-MEL y en contra de cantidades conocidas de GAGE12I recombinante usando transferencia de puntos. MZ2-MEL y las células SK-MEL-31 se encontró que contenían 0,53 pg y 0,29 pg de proteína GAGE por célula, respectivamente (Fig. 8A). Sobre la base de un diámetro de células de melanoma estimado de ~ 15 m (asumiendo una forma esférica), las concentraciones se calcularon conservadoramente en 299 ng /l (23 mM) en las células MZ2-MEL y 164 ng /l (12 mM) en SK- MEL-31 células. En ambas líneas celulares, la microscopía confocal sugirió la señal GAGE era 2-3 veces más intensa en el núcleo que en el citoplasma (Fig. 8B). Llegamos a la conclusión de que la concentración de las proteínas nucleares GAGE en estas células es muy superior (7,3 M) requerida para ~ 50% de unión a ADN
in vitro
.
Discusión
caracterización funcional de las proteínas GAGE es importante entender sus papeles en la biología de las células cancerosas y las células germinales y para evaluar su potencial terapéutico como dianas de cáncer. Este estudio reveló que las proteínas GAGE interactúan directa o indirectamente con GCL, y que GCL recluta proteínas GAGE a la envoltura nuclear en las células. Además, demostró que los miembros de GCL y GAGE co-expresa en células de testículos y cáncer humano. GCL es importante para la integridad de la envoltura nuclear y el desarrollo de células germinales tanto en
Drosophila Opiniones y ratones [9], [10]. GCL se concentra cerca de la membrana nuclear interna, posiblemente reflejando su unión directa a las proteínas LEM-dominio [12] - [14]. En
Drosophila
, GCL se requiere para silenciar la transcripción en células germinales [11]. En células de mamíferos, GCL se une directamente DP y reduce la expresión de genes activados-DP E2F [29]. Estos hallazgos implican GCL como un regulador negativo de la actividad de DP. Nuestra evidencia sugiere GCL también recluta proteínas GAGE a la envoltura nuclear. Ya sea que secuestra esta contratación y agota GAGE de otros sitios de acción (como se propone para determinados factores de transcripción [43]), o se requiere para GAGE para funcionar, o si GCL se regula por sí GAGE, sigue sin conocerse
Hemos encontrado que las proteínas GAGE son proteínas intrínsecamente desordenadas-ADN de doble cadena que se pueden unir directamente. Otras proteínas de unión a ADN de doble cadena trastornos intrínseca incluyen High Mobility Group (HMG) dominio de las proteínas y metil-CpG vinculante proteína 2 (MeCP2) [44], [45]. El antígeno de cáncer-línea germinal PAGE4, que es a la vez evolutivamente y estructuralmente relacionada con proteínas de galga (32% de identidad con GAGE12I), también es intrínsecamente desordenados y presentan propiedades de unión al ADN [46]. polipéptidos no estructurados a menudo adoptan estructuras plegadas tras la unión de sus objetivos biológicos [41], [47]. Tanto la región de unión a ADN de GAGE, y la base estructural de GAGE unión a ADN o cromatina, son temas importantes para la investigación futura. Nuestros resultados actuales sugieren proteínas GAGE se unen ADN de doble cadena en una secuencia de manera independiente, similar al dominio de las proteínas HMG. Sin embargo potencial de unión preferencial (por ejemplo, las secuencias de ADN de A /T-ricos, como se ve por el regulador de la cromatina SATB1; [25]) no se descarta. Nuestros experimentos gel del turno revelaron una unión detectable a los fragmentos de 90 pb dsDNA (17 pM) a una concentración GAGE12I de 0,73 m, y aproximadamente el 50% de unión a una concentración GAGE12I de 7,3 uM. Estas concentraciones fueron muy inferiores a las concentraciones de proteína GAGE estimados en núcleos de células de melanoma, y sugirieron un
in vitro
estequiometría de unión 43-a-1 (ADN GAGE12I a) a 50% de unión. Dado que las proteínas forman dímeros estables GAGE y oligómeros de orden superior [2], que postula esta relación molar alta refleja oligomerización dependiente de la concentración de proteínas GAGE.
Aún no entiendo el significado de GAGE unión a ADN
in vivo, o si esto está influenciado por GCL. Sin embargo especulamos proteínas GAGE pueden tender un puente sobre la cromatina de los complejos de proteínas asociadas a GCL en la envoltura nuclear y por lo tanto regular la organización de la cromatina y la función [22], [48]. En el linaje de células germinales humanas, proteínas GAGE están presentes en las células germinales primordiales (PGC) y desaparecen justo antes de la primera división meiótica [35], [49]. PGC proliferan y emigran desde el saco vitelino dorsal a través del mesenterio dorsal de invadir y colonizar las crestas gonadales [50]. Este proceso implica una secuencia de eventos epigenéticos que reorganizan y reprogramar la cromatina, y en última instancia desplazan la célula de un somática a un estado de células germinales [51]. Estos cambios epigenéticos son aún mal caracterizado, pero incluyen la pérdida de todo el genoma de la metilación del ADN, la pérdida gradual de H3K9me2 y la ganancia global del H3K27me3 [52]. En particular, los cambios epigenéticos también son centrales a la tumorigénesis, y semejanzas fenotípicas entre las células germinales y las células de cáncer sugieren la activación potencial de un programa de diferenciación relacionado gametos en las células cancerosas [5]. Por lo tanto, especular que miembros de la familia GAGE tienen nuevos papeles en orden superior reorganización de la cromatina y la reprogramación de las células germinales y las células cancerosas.
Materiales y Métodos
Inmunoensayos
Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron: Mouse anti-GAGE (M3 [4]; inmunocitoquímica [CIC], dilución 1/100; western blot [BM], 1/5000 de dilución), de conejo anti-Myc (A14; Santa Cruz Biotech, Heidelberg, Alemania ; CPI, 1/100), de conejo anti-GCL (Santa Cruz Biotech; WB, 1/1000), de conejo anti-GCL (Sigma Aldrich, Brondby, Dinamarca; WB, 1/1000), de ratón anti-beta-actina ( Ab6276; Abcam, Cambridge, Reino Unido; WB, 1 /200.000); de cabra conjugado con FITC anti-ratón IgG (Dako, Glostrup, Dinamarca; CPI, 1/400), conjugado con Cy3 IgG de cabra anti-conejo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EE.UU., CPI, 1/400).
Las transferencias Western y tinción de las células fueron descritas anteriormente [4]. Para transferencias de puntos, vimos GAGE12I recombinante o lisados celulares (hecho en PBS usando homogeneización molino de bolas) en la membrana PVDF activado; membranas secadas al aire se procesaron tal como se describe para transferencias de Western y se cuantificó usando un generador de imágenes Fusión fx7 (Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell, Deutschland).
levadura de dos híbridos de pantalla
La levadura de dos híbridos de pantalla hecho por ProteinLinks (Pasadena, CA, EE.UU.).