Extracto
GAIP interacción proteína C terminal (GIPC) se sabe que juega un papel importante en una variedad de fisiológica y estados de enfermedad. En el presente estudio, hemos identificado un nuevo papel para GIPC como un regulador maestro de la autofagia y las vías exocitóticos en el cáncer. Se demuestra que el agotamiento de la autofagia inducida por GIPC en las células de cáncer de páncreas, como se desprende de la regulación al alza de la LC3II marcador de autofagia. Se presenta, además, que GIPC regula las vías de tráfico celular mediante la modulación de la secreción, la biogénesis y la composición molecular de los exosomas. También se identificó la participación de GIPC en vías de estrés metabólicos que regulan la autofagia y derramamiento microvesicular, y observamos que el estado GIPC determina el embarque de la carga celular en el exosoma. Además, hemos demostrado la sobreexpresión de la ABCG2 gen de resistencia a fármaco en exosomas de células de cáncer pancreático-agotado GIPC. Se demostró además que el agotamiento de las células del cáncer de GIPC ellos sensibilizados al tratamiento con gemcitabina, una vía que puede ser explorado como una estrategia terapéutica potencial para superar la resistencia a fármacos en el cáncer
Visto:. Bhattacharya S, Pal K, AK Sharma , Dutta SK, Lau JS, Yan IK, et al. (2014) Protein GAIP Interactuando C-terminal controlan la autofagia y exosome Biogénesis de cáncer pancreático a través de vías metabólicas. PLoS ONE 9 (12): e114409. doi: 10.1371 /journal.pone.0114409
Editor: Ramani Ramchandran, Colegio Médico de Wisconsin, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de abril, 2014; Aceptado: 7 de noviembre de 2014; Publicado: Diciembre 3, 2014
Derechos de Autor © 2014 Bhattacharya et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones CA78383 y CA150190 (DM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
macroautofagia, comúnmente denominado como la autofagia, es un proceso catabólico esencial que las células implementan en diversas actividades biológicas y fisiológicas [1], [2]. En condiciones celulares normales, este proceso mantiene la homeostasis celular y tisular de una manera protectora mediante el reciclaje y componentes celulares degradantes durante la muerte celular [2] - [5]. Anteriormente, se creía que la autophagosome, una vesícula de doble membraned, envuelve orgánulos azar [1], [2], [5]; sin embargo, estudios recientes han demostrado que la selección de los orgánulos está dirigida por factores específicos de carga [6]. Además, la autofagia juega un papel importante en muchos procesos de enfermedades, incluyendo el cáncer [7]. En varios tipos de cáncer, la autofagia puede influir en la iniciación y progresión de la enfermedad [8], [9] y promover el desarrollo del tumor bajo el estrés metabólico de la hipoxia. Debido a que las mutaciones de los genes relacionados con la autofagia se han reportado en los cánceres humanos [10], [11], los estudios se han centrado en la inhibición genética y química de la autofagia como una estrategia terapéutica [12].
GAIP interacción proteína C- terminal (GIPC) se identificó inicialmente como una pareja de interacción de la proteína GTPasa de la activación RGS-GAIP para G-receptor acoplado a proteína de la subunidad alfa GI [13]. El dominio PDZ de GIPC estabiliza muchas proteínas transmembrana, incluyendo el transportador Glut1, semaforina-F, neuropilina-1, proteína viral de impuestos, la dopamina D2 y D3, y IGF1R [14] - [19]. Mientras que la mayoría de los ligandos de unión de dominio PDZ de GIPC son proteínas transmembrana, varios de ellos son proteínas citosólicas, como APPL1 y RGS19 [13], [20]. Funcionalmente, la región N-terminal de GIPC está involucrado en la dimerización y la región C-terminal de GIPC interactúa con la miosina VI (MYO6) [21], [22], destacando su papel como una molécula adaptadora para cargas de dominio orientado carga PDZ en el motor de la proteína MYO6 para el transporte. GIPC también está involucrado en el tráfico de diversas proteínas transmembrana de las vesículas de endocitosis y esencial para el tráfico de las integrinas internalizadas durante la migración celular, la angiogénesis y la citocinesis [23] - [25]. Los niveles elevados de expresión GIPC se presentan en varios tipos de cáncer, incluyendo pancreático y cáncer de mama, la promoción de su proliferación celular y la supervivencia [19], [26] - [30]. A la inversa, el agotamiento de GIPC en células de cáncer inhibe la proliferación y promueve la apoptosis. Desmontables de resultados GIPC en arresto G
2-ciclo celular y disminuye la mortalidad en las células MDA-MB231, lo que sugiere el papel de GIPC en la citocinesis y la migración celular [23], [31].
Los exosomas son vesículas intracelulares (40-100 nm) necesarios para la comunicación intercelular en los organismos multicelulares [23]. La maquinaria molecular implicada en la biogénesis de exosomas incluye cuatro complejos multiproteicos conocida como la clasificación endosomal complejo responsable del transporte (ESCRT) -0, -I, II, y III, y las proteínas accesorias como Alix y VPS4. El ESCRT-0, -I, y complejos -II reconocen y secuestran proteínas de membrana ubiquitinadas en la membrana endosomal restricción, mientras que el complejo ESCRT-III es responsable de membrana en ciernes y la eliminación real de vesículas intraluminales (ILV) [32]. Recientemente, Alix (también conocido como PDCD6IP) fue funcionalmente ligada a la biogénesis exosome a través de su interacción con los Tsg101 y CHMP4 proteínas [33] - [35]. Un estudio reciente sugiere que la formación y liberación de microvesículas arrestina dominio que contienen proteínas mediada por 1 (ARMMs) en la membrana plasmática depende del reclutamiento de proteínas TSG101 [36].
No está acumulando evidencia de que las obras GIPC un papel importante en el tráfico celular. En particular, GIPC actúa como un andamio para controlar el tráfico de receptor mediada por [20], [22], [37] y después de la internalización del receptor, GIPC transitoriamente se asocia con un grupo de vesículas endocítica cerca de la membrana plasmática [15]. biogénesis exosoma, así como formación de la autophagosome implica vesículas endocytotic. Sin embargo, no hay evidencia clara de que estos dos mecanismos de formación de vesículas diafonía entre sí [38]. En el presente estudio, revelamos un papel único de regulación de la autofagia en GIPC través de las vías metabólicas y la modulación de la secreción de exosomas. También demostramos que el agotamiento de las células del cáncer de GIPC los sensibiliza a los fármacos quimioterapéuticos, tales como gemcitabina, una vía que puede ser más explorada como una potencial estrategia terapéutica contra la resistencia a los medicamentos.
Materiales y Métodos
cultura & amp celular; líneas celulares knockdown GIPC
líneas celulares de cáncer pancreático ASPC-1 y PANC-1 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 (por AsPC-1) o alta DMEM glucosa (por PANC-1) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 5% de L-glutamina, y 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera que contiene 95% de aire 5% de CO (v /v).
2 líneas celulares estables desmontables GIPC se generaron utilizando lentivirus shRNA. Las partículas de lentivirus se prepararon usando células 293T co-transfectadas con el plásmido de expresión gag-pol pCMVΔ8.91, la expresión de la envuelta VSVG plásmido PMD-G, y el plásmido que codifica ADNc pLKO.1 vector para la expresión de GIPC /Synectin shRNA (5 '-CCGGGCAAATGCAATAATGCCCTCACTCGAGTGAG-GGCAT-TATTGCATTTGCTTTTTG-3'). GIPC /Synectin shRNA en pLKO.1 fue adquirido de Applied abiertas. El sobrenadante se recogió 48 horas después de la transfección y se congeló a -80 ° C. células PANC-1 o AsPC-1 fueron infectadas durante la noche a 37 ° C y se aislaron colonias estables después de la selección de puromicina (1 mg /ml). Para asegurar la eficacia de la caída GIPC /Synectin, proteína lisados fueron analizados por inmunotransferencia para GIPC /Synectin. Control de las células fueron transducidas con un vector de la proteína vacía. Retroviral pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B plásmido de Addgene (Addgene plásmido 22418) se utilizó para preparar partículas de retrovirus utilizando células 293T siguiente procedimiento estándar. células AsPC-1 o PANC-1 se infectaron con partículas de retrovirus y se aislaron colonias estables después de la selección de puromicina (1 mg /ml). Los experimentos se realizaron a una confluencia del 70-80% de células y se confirmó en al menos tres experimentos independientes.
interferencia de ARN, transfección
Después de una incubación de 24 horas con medio libre de antibiótico, se transfectaron células con anti-GIPC pequeños ARN de interferencia (siRNA) usando el reactivo de transfección DharmaFECT 2 (Dharmacon, Lafayette, CO). Setenta y dos a 96 h después de la transfección, GIPC desmontables se confirmó por análisis de transferencia Western. Un siRNA enfoque similar se adoptó en anti-ATG7 y anti-Beclin1 caída. Para los experimentos de hambre de glucosa, tanto en las células AsPC-1 tratados de control de siRNA y GIPC siRNA se mantuvieron en glucosa libre RPMI suplementado con 10% de FBS durante 16 h finales del experimento 96 h. Para los experimentos de flujo autofágicas, tanto el control de siRNA y GIPC siRNA tratada AsPC-1 y PANC-1 células fueron tratadas con concentraciones indicadas de pepstatina-A y E-64d para la final de 24 h del experimento 96 h.
Anticuerpos y análisis de inmunotransferencia
enteras lisados celulares se prepararon en NP-40 tampón de lisis suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, St. Louis, MO) y detener cóctel inhibidor de fosfatasa (Thermo Scientific, Waltham, MA). El sobrenadante se recogió después de la centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min a 4 ° C y se separó por SDS-PAGE. Anti-GIPC, anti-PLCγ, y los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante se compraron desde Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos contra ABCG2, mTOR, fosfo-mTOR, p70S6K, fosfo-p70S6K, ATG7, Beclin1, la AMPK-α, y fosfo-AMPK-α fueron adquiridos de Tecnologías de Señalización Celular. Anti-CHMP4b y anti-TSG101 fue adquirido de Abcam; anti-β-actina se adquirió de Sigma; y el anticuerpo Alix se adquirió de Thermo Scientific. Western blots fueron desarrolladas utilizando el sustrato SuperSignal West Pico (Thermo Scientific) y se realizaron inmunoprecipitaciones como se describe anteriormente [19].
inmunofluorescencia
Las células (2 × 10
4) se sembraron en un cubreobjetos en medio libre de antibiótico durante 24 h. Las células fueron transfectadas con siRNA GIPC o revueltos siRNA (Dharmacon) y el medio se cambió de 48 h de transfección posterior. Después de 96 h, las células se lavaron y se fijaron con 4% de paraformaldehído. Después de bloquear con suero de cabra al 10% durante 15 min, las células se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 5 min. Las diapositivas fueron teñidas con anticuerpos primarios contra LC3 durante 2 h en suero de cabra al 1%. Después de incubar los portaobjetos con anticuerpos secundarios conjugados con AlexaFluor 488 (1:200; Life Technologies, Grand Island, NY) durante 1 h, los portaobjetos se montaron con Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) que contiene 4 ', 6-diamidino-2 se realizó -phenylindole (DAPI) y microscopía confocal. En otro conjunto de experimentos, las células que expresan mCherry-EGFP-LC3B se sembraron en cubreobjetos y se transfectaron con ARNsi GIPC o revueltos siRNA. Después de 96 h, las células se lavaron y se fijaron con 4% de paraformaldehído. Los portaobjetos se montaron con Vectashield que contiene DAPI como se ha descrito anteriormente.
captación de glucosa intracelular y la medición de glucosa ensayo
células estables, ya sea transfectadas con shRNA GIPC o el vector de control, se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 48 h. La captación de glucosa se midió usando el kit de la captación de glucosa ensayo basado en células (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) utilizando un análogo de desoxiglucosa marcada con fluorescencia. Para una medición de la concentración de glucosa intracelular, la Red de glucosa Kit de ensayo Amplex (Life Technologies) se utilizó con una ligera modificación con el protocolo del fabricante tal como se describe anteriormente [39]. Las células se recogieron por centrifugación y el sedimento celular resultante se lavó dos veces en PBS y se dispersaron en tampón de reacción 1X del kit. Las células se lisaron mediante sonicación con sonda con tres ciclos de 10 segundos sobre, 30 segundos fuera a potencia 20%, mientras que mantiene continuamente en hielo. Se añadió cincuenta l de solución de reacción (10 mM Amplex Red, 10 U /ml de HRP, 100 U /ml de glucosa oxidasa, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4) a 50 l de lisado de células en una placa de 96 pocillos y se incubó en la oscuridad a 37 ° C durante 30 min. La fluorescencia (excitación: 544, emisión: 590). A continuación se midió usando un lector de placas SpectraMax y los valores se expresaron como unidades relativas de fluorescencia (RFU) /mg de proteína
exosoma aislamiento
exosomas eran aislado de medio acondicionado de las células PANC-1 y AsPC-1 por centrifugación diferencial. Las células fueron cultivadas a 70-80% de confluencia y medio se reemplazó con medio que contiene 10% de suero bovino fetal privado de micropartículas a través de la centrifugación (60 min a 100.000 x
g
). Después de 72 h de incubación, se recogieron los sobrenadantes y limpiadas de desechos celulares y las células muertas con dos vueltas secuenciales a 4 ° C, 3.000 ×
g
para 10 min. sobrenadantes aclarados después se centrifuga a 4 ° C, 60.000 ×
g
durante 70 minutos. Los pellets de exosoma resultantes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y después se centrifugaron de nuevo a 4 ° C, 100,000 ×
g
para 70 min. Los pellets exosome finales se resuspendieron en PBS o agua dependiendo del experimento.
La microscopía electrónica
exosomas recién preparados re-suspendidas en agua se dispersaron aún más en la solución de fijación de Trump, compuesto por 4 % (v) de formaldehído y 1% (v) de glutaraldehido en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,2. A continuación, los exosomas se lavaron con tampón fosfato 0,1 M, 1% de tetróxido de osmio en tampón fosfato 0,1 M, agua destilada, 2% (v) de acetato de uranilo, agua destilada, etanol, y acetona absoluta en secuencia. Por último, los exosomas se colocaron en una rejilla de TEM para el examen usando un
Philips technai
T12.
Proteómica análisis
Identificación de proteínas se realizó a través de la digestión con tripsina en gel usando nanoLC- MS /MS con Orbitrap híbrido /lineal espectrometría de masas de trampa de iones. Brevemente, la proteína de los exosomas de líneas celulares estables GIPC deficientes se resolvió en un gel NuPage al 4-12% (tampón MOPS) con 20 l de tampón de muestra de SDS-PAGE que contenía DTT 50 mM. Los geles se tiñeron con colorante azul de BioSafe coloidal (BioRad) y las bandas deseadas se escindieron del gel para el análisis de espectrometría de masas utilizando los siguientes procedimientos. azules bandas de gel teñido coloidales se destiñeron en 50% de acetonitrilo /50 mM Tris pH 8,1 hasta que se aclare. Las bandas se reducen entonces con 50 mM mM Tris TCEP /50, pH 8,1 a 55 ° C durante 40 min y se alquiló con 20 mM yodoacetamida /50 mM Tris pH 8,1 a temperatura ambiente durante 60 min en la oscuridad. Las proteínas se digieren
In situ
con 30 l (0,005 g /l) tripsina (Promega Corporation, Madison, WI) en 20 mM Tris pH 8,1 /0,0002% Zwittergent 3-16, a 55 ° C durante 2 h, seguido de la extracción de péptidos con 10 l de ácido trifluoroacético 2% y después 60 l de acetonitrilo. Los extractos combinados se concentraron a menos de 5 l en un concentrador Speed-Vac (Instrumentos Savant, Holbrook, NY) y después se lleva en ácido trifluoroacético 0,2% para la identificación de proteínas por cromatografía líquida de flujo nano electrospray espectrometría de masas tándem (nanoLC-ESI -MS /MS) utilizando un híbrido ThermoFinnigan Orbitrap Elite espectrómetro de masas (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) acoplado a un sistema de Eksigent nanoLC-2D HPLC (Eksigent, Dublin, CA). La mezcla de péptido digerido se cargó en una trampa nl OPTI-PAK 250 (Optimize Technologies, Oregon City, OR), a medida lleno de fase sólida Michrom magia C8 (Michrom Recursos Biológicos, Auburn, CA). La cromatografía se realizó usando ácido fórmico 0,2% tanto en la un disolvente (98% de agua /2% de acetonitrilo) y disolvente B (80% de acetonitrilo /10% de isopropanol /10% de agua), y un 2% de B a 45% de gradiente de B durante 70 min a 300 nl /min a través de un PicoFrit empaquetadas a mano (Nuevo Objetivo, Woburn, MA) mm de columna de 75 m × 200 (Michrom mágica C18, 3 micras). El experimento de espectrómetro de masas Orbitrap Elite se lleve a cabo un análisis completo para FT 340-1500 m /z con la resolución fijada en 120.000 (a 400 m /z), seguido de trampa de iones lineal exploraciones CID MS /MS en los quince primeros iones. dinámica de exclusión se establece en 1 y los iones seleccionados se colocaron en una lista de exclusión durante 30 segundos
base de datos en busca
espectros de masas
Tandem fueron extraídos por msconvert (versión 3.0.4019; ProteoWizard). y todos muestras de MS /MS se analizaron utilizando la mascota (Ciencia Matrix, Londres, Reino Unido; versión 2.4.0), Sequest (Thermo Fisher Scientific, versión 27, 12 rev.) y X1 tándem (El GPM, thegpm.org; versión CICLON (2010.12 .01.1)). Mascota, Sequest, y X1 tándem se establecieron para buscar en la base de datos SwissProt Febrero de 2012, restringido a los humanos con una base de datos inversa señuelo, y suponiendo que la enzima tripsina digestión. La mascota y X1 tándem se realizaron búsquedas con una tolerancia de masas de iones fragmento de 0,60 Da y una tolerancia ion primario de 10,0 PPM. Sequest fue buscado con una tolerancia de masas de iones fragmento de 0,60 y una tolerancia ion primario de 0,01 Da. La oxidación de la metionina y la cisteína derivado de yodoacetamida de se especifica en la mascota, Sequest, y X1 tándem como variable modificaciones.
El aislamiento de ARN y análisis de PCR cuantitativa
El ARN total se aisló a partir de líneas celulares y el uso de exosomas el kit de aislamiento de ARN miRCURY - Móvil & amp; Planta (Exiqon, Woburn, MA) siguió con espectrofotometría (NanoDrop, Thermo Scientific) para la cuantificación y el análisis cualitativo. Igual cantidad de ARN total fue transcrito de forma inversa por oligo (dT) cebado utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema ABI 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) y la mezcla SYBR Green PCR Master (Applied Biosystems) como se ha descrito anteriormente [40]. GLUT1 y β-actina primers fueron adquiridos de SABiosciences (Frederick, MD).
sensibilidad a los fármacos de ensayo
En resumen, 5 × 10
3 células fueron sembradas por pocillo por triplicado, en el 96 -Bueno placas de fondo plano con 100 l de medio. Después de 24 h, se añadieron concentraciones variables de gemcitabina (g /ml) y se incubaron las células durante una 72 h adicionales. Al final del período de tratamiento, 20 l de solución de MTS que contienen PMS: se añadieron a cada pocillo y se incubaron las células a 37 ° C durante 1 a 2 h (MTS PMS = 20:01 vol relación.). La absorbancia a 490 nm se registró usando una los valores mitad de la máxima concentración inhibidora (IC50) SpectraFluor PLUS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se calcularon las concentraciones correspondientes a una reducción del 50% del crecimiento celular. Antes de la prueba de sensibilidad a los fármacos, la viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTS (Promega, Madison, WI).
El análisis estadístico
Los datos de los gráficos de barras representan la media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes, cada uno realizaron con muestras por triplicado. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student, con un valor de dos colas de P & lt; 0,05 para ser considerado significativo
Resultados
GIPC agotamiento induce la autofagia en las células del cáncer pancreático
. p> Uso de las líneas de células pancreáticas-agotado GIPC ASPC-1 y PANC-1, se investigó si GIPC modula la autofagia mediante la evaluación de la cadena ligera de la proteína asociada a los microtúbulos relacionados con la autofagia-3 conversiones (LC3) (LC3-I a LC3-II) a través de análisis de transferencia de Western. Es bien sabido que la conversión de la cadena ligera 3-I (LC3-I), en la conjugación con fosfatidiletanolamina (PE), forma la cadena ligera conjugado 3-II (LC3-II) que luego es reclutado a las membranas de autofagosomas [13], [20]. expresión LC3 ha sido ampliamente utilizado para controlar y establecer el estado de la autofagia como la cantidad de LC3II se correlaciona con el número de autofagosomas [41]. Después de una investigación exhaustiva del nivel de LC3-II en las líneas celulares estables pancreáticas, se observó un nivel elevado LC3-II en células deficientes de GIPC, lo que indica la activación de la autofagia (Figura 1A). También se observó un aumento en la formación de LC3-II (verde) en los puntos lagrimales-agotadas las células GIPC por estudio de inmunofluorescencia (Figura 1B). GIPC caída en presencia de inhibidores lisosomales de la proteasa, pepstatina-A y E-64d, se incrementó aún más los niveles LC3-II de una manera dependiente de la dosis en comparación con GIPC desmontables solo, lo que indica aumento de flujo autophagic (Figura S1A). Además, se utilizó una proteína de fusión en tándem mCherry-EGFP-LC3B que contiene ácido insensible mCherry y sensible a los ácidos EGFP como un sistema reportero flujo autophagic [42], [43]. Durante la formación autofagosoma, tanto EGFP y mCherry se detectan en autofagosomas que aparecen como puntos lagrimales amarilla. Sin embargo, una vez autofagosomas fusible con los lisosomas, la fluorescencia verde se pierde a causa de la degradación de la EGFP por proteasas lisosomales ácido resultante sólo puntos lagrimales rojo. Por lo tanto, la presencia de ambos puntos lagrimales amarillo y rojo indica un proceso de autofagia flujo funcional. Aquí hemos utilizado dos líneas AsPC-1 y PANC-1 de células que expresan de forma estable mCherry-EGFP-LC3B para mostrar el aumento tanto de los puntos lagrimales amarillo y rojo sobre GIPC desmontables que también indica un aumento en el flujo de autofagia (Figura S1B). Estos resultados sugirieron que GIPC caída induce la formación de autofagosomas en células de cáncer de páncreas.
A) células AsPC-1 y PANC-1 fueron infectadas con lentivirus que expresan shRNAs a GIPC revuelto y el control. Una cantidad igual de lisados de células enteras de AsPC-1 y PANC-1 GIPC agota las células se analizaron por inmunotransferencia (IB) con los anticuerpos para GIPC y LC3II. β-actina se usa como control de carga. B) Un análisis de inmunofluorescencia representativas de células PANC-1 para la expresión de LC3 II (verde) en GIPC agota PANC-1 en las células en comparación con las células de control. Las células fueron counterstained con DAPI (azul).
Además, investigó el efecto de dos genes relacionados con la autofagia, ATG7 y Beclin1, sobre la regulación de la autofagia mediada por GIPC. Para evaluar la interacción de ATG7 y Beclin1, hemos reducido el nivel de ATG7 y Beclin1 por la interferencia de ARN (ARNi) tanto en las células PANC-1 y AsPC-1. Como se muestra en las figuras 2A y 2B, no se observó ningún cambio significativo en ATG7 o Beclin1 expresión después de la depleción GIPC tanto en las células de cáncer de páncreas. Como ATG7 y Beclin1 son dos componentes clave para la biogénesis autofagosoma, también se observó una disminución en la conversión LC3 LC3 II de I tras desmontables de ATG7 y Beclin1 tanto en las células de cáncer de páncreas. En las células ASPC-1, nos dimos cuenta de que la inducción de la autofagia con el agotamiento de GIPC fue impedida significativamente por reducción de ATG7 y Beclin1. Por el contrario, en las células PANC-1, ATG7 y Beclin1 podrían no afectar la conversión LC3II sujeta a agotamiento GIPC. Además, exploramos la asociación de GIPC con ATG7 y Beclin1 por experimentos de co-inmunoprecipitación y encontramos Beclin1 para estar en el mismo complejo con GIPC (Figuras 2C) pero no obtuvo resultados concluyentes para ATG7 (datos no mostrados).
análisis a) por inmunotransferencia de la expresión ATG7 en lisados AsPC-1 y PANC-1 de células transfectadas con siRNA para GIPC, ATG7 y revueltos control. β-actina se usa como control de carga. B) El análisis por inmunotransferencia de la expresión Beclin1 en PANC-1 lisados de células AsPC-1 y transfectadas con siRNA a GIPC, Beclin1, y revueltos control. β-actina se usa como control de carga. C) Co-inmunoprecipitación (IP) de los PANC-1 lisados de células transfectadas con ARNsi de GIPC, y revueltos de control utilizando anticuerpo GIPC. Los inmunocomplejos se analizaron por inmunotransferencia (IB) con anticuerpos frente a Beclin1 y GIPC.
GIPC media la autofagia través estrés metabólico vías
Glut1 se asocia con la captación de glucosa en las células cancerosas y es conocida GIPC para estabilizar Glut1 en la membrana celular como una pareja de interacción que contiene el dominio PDZ [14]. En este sentido, hemos examinado si derribando GIPC en las células de cáncer de páncreas desestabilizaría Glut1 e interrumpir la captación de glucosa en estas células. Como era de esperar, se encontró una disminución significativa en la expresión Glut1 tanto en ARNm y proteínas sobre GIPC caída en células PANC-1 AsPC-1 y (Figura 3A & amp; 3B). Además, hemos encontrado que la absorción de glucosa relativa para AsPC-1 y las células PANC-1 se redujo significativamente en la ausencia de GIPC, en comparación con la de las células control (Figura 3C). Para determinar si los niveles intracelulares de la glucosa también dependían del estado de GIPC, que supervisó el nivel de glucosa intracelular después de GIPC caída en las mismas líneas celulares de cáncer de páncreas y encontramos niveles que se reduzcan significativamente en comparación con las células de tipo salvaje (Figura 3D). Es importante destacar que, en condiciones de estrés, AMP celular normalmente regula el nivel de glucosa intracelular. los niveles de AMP fueron elevados en el hambre de glucosa, que, a su vez, activa aún más la actividad de la quinasa de AMPK-α través de la fosforilación [44], [45]. Para investigar este mecanismo en líneas celulares de cáncer de páncreas, se analizó el estado de la AMPK-α por inmunoblot en desmontables células estables GIPC. Nuestros resultados revelaron un alto nivel de fosforilados AMPK-α en GIPC agotamiento (Figura 4A), lo que sugiere que GIPC puede modular las vías de AMPK.
A) PCR cuantitativa y B) análisis de transferencia de Western de Glut1 para analizar el efecto de GIPC-agotamiento en la expresión Glut1. β-actina se usa como control de carga. Tanto Glut1 mRNA y los niveles de proteína disminuyeron significativamente en el agotamiento del GIPC en las células PANC-1 AsPC-1 y. C) La captación de glucosa se redujo significativamente en las células GIPC empobrecido en comparación con las células de control en las células PANC-1 AsPC-1 y (** indica p & lt; 0,01). D) los niveles de glucosa intracelular también se redujo significativamente en el GIPC agota PANC-1 líneas celulares que confirman el papel GIPC en el metabolismo de la glucosa (** indica p & lt AsPC-1 y; 0,01) guía empresas
A) por inmunotransferencia. de los lisados celulares de GIPC agotan y controlan AsPC-1 y PANC-1 células están siendo sondado con p-AMPK-α, el total de AMPK-α. β-actina se usa como control de carga. B) Por otra parte, inmunotransferencia de lisados celulares desde arriba condición estaban siendo sondeó con p-mTOR, mTOR total, el p-p70S6K y p70S6K total. β-actina se utilizó como control de carga.
Además, investigó el mecanismo molecular de la autofagia mediante el examen de las moléculas de abajo de la vía de la AMPK-α. Se observó disminución de los niveles de fosforilación de mTOR después GIPC caída en células AsPC-1 y PANC-1; Sin embargo, la expresión total de mTOR no cambió. Además, se observó una disminución de un efector aguas abajo de mTOR conocido, la fosfo-p70S6K a p70S6K ratio, en lisados de células-agotado GIPC en comparación con las células parentales de control (Figura 4B). La eliminación de la glucosa extracelular mejora aún más la fosforilación de AMPK-α y la reducción de la fosforilación de mTOR, así como la fosforilación p70S6K (Figura S2). Sin embargo, los niveles de LC3 se redujeron tras la eliminación de la glucosa extracelular que corrobora con los informes anteriores [46] lo que sugiere la eliminación de glucosa extracelular mata a las células ya sea por apoptosis o necrosis en lugar de inducir la autofagia como un efecto prosupervivencia. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la autofagia GIPC controla a través de la regulación de las vías metabólicas en células de adenocarcinoma de páncreas.
GIPC influye en la secreción de exosomas y la biogénesis
Con los exosomas recogidos de los transfectantes estables, se realizó ensayos enzimáticos para la actividad de la acetilcolinesterasa como se describe anteriormente [14]. Este ensayo reveló una mayor abundancia de exosomas en los medios de comunicación de líneas de células deficientes en GIPC acondicionado. Se observó un aumento 3,5 o mayor veces en la producción exosoma en medios condicionados recogidos de GIPC-agotado AsPC-1 en las células en comparación con el control (Figura 5A). Se obtuvieron resultados similares con células PANC-1-agotado GIPC también (datos no mostrados). También se determinó la concentración de ARN total en estos exosomas como otra medida de la abundancia de exosomas y encontramos resultados similares (figuras 5B & amp; 5C). Nanopartícula análisis de seguimiento utilizando el NanoSight LM10 confirmó la distribución del tamaño de nuestras preparaciones de exosomas. Con un modo de aproximadamente 100 nm, su tamaño era coherente con la definición exosome actual (Figura 5D).
exosomas se aislaron a partir de medios de cultivo AsPC-1 y PANC-1 GIPC agotado y cultivo de células de control. Para la medición cualitativa misma cantidad de células se sembraron en placas de cultivo. A) Una comparación de la actividad de la acetilcolinesterasa es representado por exosomas recogidos de GIPC agotado y controlar AsPC-1 línea celular. se muestra C) Una comparación del contenido total de ARN de la preparación de exosoma AsPC-1 y PANC-1 de cultivo de células; B & amp. D) Un perfil de distribución de tamaño representativa de la preparación de exosoma se obtiene usando NanoSight. E) Una micrografía electrónica de transmisión representante (TEM) de los exosomas se presenta en esta figura. La barra de escala es de 500 nm. Una imagen de mayor magnificación de TEM exosomas F) se presenta. La barra de escala es de 200 nm. G) por inmunotransferencia llevado a cabo con células lisados recogidos de desmontables células GIPC, así como las células control estaban siendo sondeó con TSG 101, Alix, y CHMP 4B. PLC γ se utiliza como control de carga.
A continuación, lleva a cabo la caracterización morfológica de la preparación exosome con un análisis ultra-estructural de los gránulos de exosoma por microscopía negativa de tinción y la transmisión de electrones de metales pesados (TEM). El análisis de las imágenes de TEM confirmó las dimensiones de exosoma en nuestras muestras. Figura 5E representa la morfología típica de la población total de exosomas en una ampliación TEM inferior. Un análisis más detallado de las imágenes de TEM a mayor aumento confirmó la estructura en forma de copa forma típica de exosomas (Figura 5F). Estos análisis confirmaron que la presencia o ausencia de GIPC no afectaron a la morfología de exosomas.
Para confirmar si el aumento de los exosomas en-agotadas las células GIPC correlacionados con la activación de los mecanismos de biosíntesis de exosomas, se comprobó la expresión de genes clave ( Alix, TSG101, CHMP4B) que participan en la biogénesis de exosomas por inmunoblot. Se observó un incremento en la expresión de Alix, TSG101, y CHMP4B en GIPC desmontables células en comparación con las células control (Figura 5G).
GIPC influye en el contenido de exosomas y sensibiliza líneas celulares de cáncer pancreático a los fármacos quimioterapéuticos
Para comparar el contenido de exosoma en GIPC desmontables y células de tipo salvaje, se realizó la proteómica análisis sobre los exosomas recogidos de las líneas celulares estables PANC-1. Para el análisis del proteoma, la proteína fue extraída de los exosomas secretadas y se encontró que el contenido de los exosomas variaba mucho dependiendo del estado de GIPC. En apoyo de la robustez y la sensibilidad de nuestros métodos de análisis, los datos de la proteómica confirmaron la ausencia de la proteína GIPC en exosomas aisladas de las células deficientes GIPC pero no en las muestras de control. Esto también demostró por primera vez la presencia de GIPC en exosomas. Además, el análisis proteómico de los exosomas aisladas de las células estables PANC-1 reveló un enriquecimiento significativo de genes implicados en la resistencia a fármacos (datos no mostrados).