Extracto
adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una enfermedad altamente letal que se caracteriza por un diagnóstico tardío y la resistencia al tratamiento. alteraciones genéticas recurrentes en los genes definidos en asociación con perturbaciones de vías de señalización celular en el desarrollo se han asociado con el desarrollo y la progresión PDAC. Aquí, se muestra que GATA6 contribuye a la carcinogénesis pancreática durante la progresión temporal de la neoplasia intraepitelial de páncreas en virtud de activación de la vía Wnt.
GATA6
se forma recurrente amplificada por tanto cuantitativa-PCR y la hibridación fluorescente in situ en la neoplasia intraepitelial de páncreas humano y en los tejidos PDAC, y
GATA6
número de copias se correlaciona significativamente con la supervivencia global del paciente. la sobreexpresión forzada de GATA6 en líneas celulares de cáncer mejora la proliferación celular y la formación de colonias en agar blando
in vitro y el crecimiento
in vivo
, así como el aumento de la señalización de Wnt. Por el contrario siRNA mediada desmontables de GATA6 dado lugar a disminuciones correspondientes en estos mismos parámetros. Se encontró que los efectos de GATA6 ser debido a su capacidad de unirse al ADN, ya que la sobreexpresión forzada de un mutante de unión a ADN de GATA6 no tuvo efectos sobre el crecimiento celular
in vitro
o
in vivo,
ni afectaron los niveles de señalización Wnt en estas mismas células. Un análisis de microarrays reveló la Wnt antagonista Dickopf-1 (DKK1) como un gen mal regulada en asociación con caída GATA6, y la unión directa de GATA6 al promotor DKK1 se confirmó por inmunoprecipitación de la cromatina y ensayos de movilidad electroforética. La transfección transitoria de GATA6, pero no GATA6 mutante, en líneas celulares de cáncer condujo a una disminución de expresión DKK1 mRNA y la secreción de la proteína DKK1 en medios de cultivo. sobreexpresión forzada de DKK1 antagoniza los efectos de GATA6 en la señalización Wnt en las células de cáncer de páncreas. Estos resultados ilustran que un mecanismo por el cual
GATA6
promueve la carcinogénesis pancreática es en virtud de su activación de la señalización de Wnt canónica través de la regulación de DKK1
Visto:. Zhong Y, Wang Z, Fu B, Pan F, Yachida S, Dhara M, et al. (2011) GATA6 Activa señalización Wnt en cáncer de páncreas por Negativamente La regulación de la Wnt antagonista Dickkopf-1. PLoS ONE 6 (7): e22129. doi: 10.1371 /journal.pone.0022129
Editor: Irene Oi Lin Ng, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 31 Enero, 2011; Aceptado: June 16, 2011; Publicado: July 19, 2011
Derechos de Autor © 2011 Zhong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de NIH subvenciones CA106610, CA62924 y CA140599, The George Rubis Fundación para la Investigación del cáncer de páncreas, la Fundación Michael Rolfe cáncer pancreático, Sigma Beta Sorority, La Fundación José C. Monastra, Alfredo Scatena El Memorial, La Fundación Patty Boshell páncreas cáncer y Subvenciones SAF2007 -60860 y ONCOBIO Consolíder del Ministerio de Ciencia e Innovación, Madrid, España (FR). Los autores no tienen ningún conflicto de interés económico alguno en relación con este trabajo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
GATA6 es un miembro de la familia de factores de transcripción GATA que juega un papel regulador crítico en el desarrollo del tejido [1]. proteínas GATA comparten una secuencia de dedos de cinc conservado que se une al motivo de ADN canónica (G /A) GATA (A /T) [2] y se dividen en dos subgrupos sobre la base de los patrones de expresión espacial y temporal. GATA1 /2/3 se expresan en linajes de células hematopoyéticas, y GATA4 /5/6 en mesodermo y endodermo órganos derivados de [1], [3]. GATA6 en particular es esencial para el desarrollo del corazón, tracto gastrointestinal, páncreas y otros tejidos [4], [5]. La importancia de GATA6 es subrayada por la observación de que dirige la inactivación de la
GATA6
gen en ratones provoca letalidad embrionaria temprana como resultado de una falta de diferenciación endodermo [5] - [7].
recurrente número de copias ganancia de
GATA6
ha sido recientemente identificado en el conducto pancreático (PDAC) de adenocarcinoma de líneas celulares y xenoinjertos [8], [9]. Mientras que su papel en la carcinogénesis PDAC es desconocida, la creciente evidencia indica que GATA6 está asociada con la tumorigénesis en una variedad de tipos de tejidos [10] - [14]. En los tumores de ovario, la expresión GATA6 ectópico se correlaciona con desdiferenciación celular [15], mientras que en el cáncer colorrectal, la proliferación celular influencias GATA6 y apoptosis al afectar a la expresión de 15-lipoxigenasa-1 que desempeña un papel en la detención celular dependiente de p53 [16]. GATA6 expresión aberrante de también se ha implicado en tumores adrenales humanos, así como en un alfa /SV40 modelo de ratón transgénico T-antígeno que se desarrolla tumores adrenocorticales de una manera dependiente de la gonadotropina [17], [18]. Por el contrario,
GATA6
ha sido implicado como un gen supresor de tumores en los astrocitomas [14].
Este estudio tenía por objeto aclarar los mecanismos por los cuales GATA6 contribuye a la carcinogénesis pancreática. Vamos a demostrar que
se produce GATA6
amplificación durante las últimas etapas de la neoplasia intraepitelial pancreática, se correlacionó significativamente con la evolución del paciente, y promueve la carcinogénesis pancreática mediante la activación de la vía de señalización Wnt canónica debido a su represión de la transcripción directa de la Wnt secretada antagonista Dickkopf-1.
Métodos
Declaración de Ética
Todas las muestras de tejido humano se recogieron con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del hospital Johns Hopkins (protocolos IRB#NA_00036610 y NA_00001584) después de un consentimiento informado y por escrito. Para los experimentos con animales, los estudios se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Minnesota (protocolo ACUC#MO09M84). Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Líneas celulares y tejidos
El A6L, A13a, se establecieron líneas celulares A10.7 y IMIM-PC2 en nuestros propios laboratorios. PK8 y PK9 eran del Dr. Akira Horii (Universidad Tohoko, Sendai, Japón), y HCG-25 del Dr. Tony Hollingsworth (Universidad de Nebraska Medical Center, Omaha NE). Todas las líneas celulares de cáncer de páncreas restantes utilizados se obtuvieron de la ATCC (Manassas VA). Las líneas del conducto pancreático de células epiteliales normales HPNE y HPDE se prepararon como se describe anteriormente [19]. El cáncer de colon líneas celulares HCT116 (
CTNNB1
mutante), SW480 (
APC
mutante) y RKO (
APC
y
CTNNB1
tipo salvaje) eran proporcionado por el Dr. James Eshleman (Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore MD EE.UU.). Todas las células se cultivaron en DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 2 mmol /L de L-glutamina en 37 ° C y 5% de CO
2.
muestras de tejido pancreático humano se obtuvieron del Departamento de Patología quirúrgica de la Universidad Johns Hopkins y xenoinjertos fueron generosamente proporcionado por el Dr. Scott Kern (Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore MD EE.UU.). Todas las muestras se recogieron con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Hospital Johns Hopkins.
Lentiviral Construye
lentivirus recombinantes que expresan GFP aguas abajo de una maqueta o un ARNhc shRNA específico para GATA6 fueron creados usando un período de tres sistema de virus como se describió anteriormente en detalle [20], [21]. Las secuencias de oligonucleótidos para knockdown GATA6 eran sentido, 5'-gatccgctgtcacaccacaactaccttcaagagaggtagttgtggtgtgacagctttttta-3 '; y anti-sentido, 5'-cgataaaaaagctgtcacaccacaactacctctcttgaaggtagttgtggtgtgacagcg-3 '. infección después de una alícuota de cada línea celular (1 × 10
5), se analizó por FACS en el Centro de Citometría de Flujo Core para confirmar la eficacia de la transducción (& gt; 95% en todas las líneas celulares ensayadas) por la expresión de GFP monitoreo 60 h después de la transducción.
Construcciones de plásmidos
El GATA6 vector pcDNA3.1-GATA6 humana fue un regalo del Dr. Clemente Ho (Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA) y se utiliza para crear pcDNA3.1 -mGATA6 por mutagénesis dirigida al sitio (Invitrogen) en el que se han suprimido los ocho bases más altamente conservadas del motivo dedo de zinc [22], [23]. vector de expresión DKK1 humano pCMV-DKK1 y el promotor DKK1 indicador de luciferasa pGL3-DKK1 eran generosamente proporcionado por el Dr. Hirotaka Osada (Aichi cáncer Instititue, Nagoya, Japón). Las líneas celulares estables fueron creados como consecuencia de nuestros métodos reportados previamente en detalle [8].
Los ensayos in vitro del crecimiento celular
Ensayos de proliferación celular se realizaron utilizando Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies) siguiendo el protocolo sugerido. se realizaron ensayos de formación de colonias como [8] se describe anteriormente. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Análisis de Ciclo Celular
La citometría de flujo se realizó en un banco de trabajo Dickenson LSR citómetro de flujo Becton (BD Biosciences, San Jose, CA). Los porcentajes de células en G0-G1, S y G2 fase se determinaron utilizando CellQuest (BD Biosciences).
análisis de inmunoabsorción enzimática
ELISA se realizaron con el mAb de ratón anti-humano DKK-1 anticuerpo (clon 141119) siguiendo el protocolo del fabricante (R & amp; D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Western Blotting
cantidades iguales de proteína fueron separadas en 15% de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de PVDF (DuPont NEN, Boston, MA). Las membranas se hibridaron con una dilución 1: 100 de anticuerpo primario (ß-catenina clon mAb de ratón E-5 o GATA6 clon pAb de conejo H-92, Santa Cruz Biotechnology, CA) seguido de peroxidasa de rábano (HRP) -vinculada de cabra anti-conejo IgG y se visualizaron por el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Amersham). La expresión de ß-actina se utilizó como control interno.
Inmunohistoquímica
Immunolabeling se realizó siguiendo los métodos previamente reportados métodos estándar [8] utilizando una dilución 1:100 de cada anticuerpo primario durante 2 horas a temperatura ambiente. La especificidad de los anticuerpos para GATA6 y DKK1 se presenta por pantalla completa Western Blot en la Figura S1.
microarrays de expresión génica
El ARN total se aisló con un kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) . Las muestras se hibridan con Agilent Humanos 4 × 44K matrices (Santa Clara, CA) y los datos en bruto se analizaron siguiendo protocolos estándar en la Microarray Core Facility de la Universidad Johns Hopkins. Todos los datos son MIAME compatible y los archivos de datos brutos se han depositado en la base de datos MIAME compatible GEO (
número de acceso
GSE27173).
cuantitativa en tiempo real PCR para la expresión de ARNm
Un microgramo de RNA por muestra se transcribe de forma inversa en ADNc usando SuperScriptTMIII Platinum® Two-Step Kit qRT-PCR (Invitrogen). análisis de RT-qPCR se realizó con un sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) para la monitorización de la fluorescencia del colorante verde (SYBR®Green, Invitrogen Inc, CA, EE.UU.). Relativos factores de cambio de la expresión génica en comparación con la b-actina de limpieza de genes se determinaron mediante el cálculo de la 2
ΔΔCt. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. (Primer secuencias se proporcionan en S1 Archivo).
GATA6 se determinó el número de copias Ensayos
genómica número de copias de ADN de GATA6 como se ha descrito anteriormente en detalle [8]. número de copias de & gt; 2,3 se consideraron el aumento de número de copias para dar cuenta de polysomy 18q del cromosoma, y porque hasta 20 veces la sobreexpresión GATA6 pueden ocurrir en PDAC, incluso con bajo número de copias nivel de ganancia número [8]
luciferasa. ensayos y TOPFLASH
Para los ensayos de TOPFLASH, pGL3-AT y pGL3-dE plásmidos fueron utilizados (amablemente proporcionados por el Dr. Bert Vogelstein). actividad Wnt relativa se determina por la relación de la expresión de luciferasa a partir del vector pGL3-OT dividido por el de la pGL3-DE vector como se describe anteriormente. Para todos los demás ensayos de luciferasa, el vector pRL-TK (Promega) que expresa luciferasa de Renilla reniformis se utilizó como control. El vector pcDNA3.1 vacío se utiliza para ajustar la cantidad total de ADN transfectado. Los ensayos de luciferasa se llevaron a cabo 40 horas después de la transfección usando el sistema de ensayo de luciferasa-Dual-Reporter (Promega), y se determinó la actividad de luciferasa con el modelo 1420 contador de etiqueta múltiple (PerkinElmer la vida y la ciencia de análisis, CT, EE.UU.). Firefly luciferase actividades se normalizaron las actividades de luciferasa Renilla reniformis. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Inmunoprecipitación de cromatina de ensayo (ensayo CHIP)
ensayos de chip se realizaron utilizando reactivos y protocolos de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) utilizando los métodos descritos anteriormente [24 ]. Todos los cebadores utilizados fueron diseñados para dirigirse específicamente a motivos de unión a GATA en el
DKK1
promotor. (Secuencias de sonda se proporcionan en S1 File).
movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA)
ensayos EMSA se realizaron mediante los métodos descritos anteriormente [24]. Los extractos de proteína se normalizaron para la proteína total, y 5-10 mg de proteína se incubaron con las sondas GATA6 de alta afinidad
32P-marcados específicos para cada uno de los cuatro motivos de unión a GATA putativos dentro de la
DKK1
promotor . también se utilizaron sondas de mutante en el que se mutó la secuencia de motivo de unión. Una sonda GATA6-P (5'-GCCAGCAGATAGCATGGAAAAG-3 ') derivado de
TFF2
promotor que contiene un sitio de unión GATA6 [25] se utilizó como control positivo. proteínas de ADN se resolvieron en geles de poliacrilamida al 5% nondenaturating y se analizaron por autorradiografía usando película Kodak. (Probe secuencias se proporcionan en S1 Archivo).
shRNA mediada por derribo
Las células cultivadas en fase logarítmica de crecimiento (50% de confluencia) se transfectaron con DKK1 shRNA (Dharmacon), CTNNB1 shRNA (CTNNB1- VHS50819, Invitrogen Inc, CA) o simulacro de shRNA (# 4611, Ambion) usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Inc, CA) siguiendo el protocolo recomendado. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se recogieron y se sometieron a análisis, la proliferación celular y la formación de colonias ensayos de RT-qPCR.
fluorescente hibridación in situ (FISH)
FISH se realizó como se describió previamente [8] utilizando clones de cromosomas artificiales bacterianos CTD-2376C8 que contienen las secuencias genómicas de la amplificación 18q11.2 en 0,11 Mb (Invitrogen, Carlsbad, CA).
PCR específica de metilación
metilación del promotor se evaluada usando cebadores y condiciones previamente reportadas por Suzuki et al [26].
el análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con un desapareado
t-test para
distribuciones paramétricas, o una prueba de Chi-cuadrado para la comparación de las frecuencias. P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
GATA6 Copia número de ganancia se produce durante la neoplasia intraepitelial pancreática
Normal epitelio ductal pancreático se cree que progresar a cáncer infiltrante través de una serie. de precursores morfológicamente definido denominado neoplasia intraepitelial pancreáticas (PanIN-1, 2, 3) [27]. Para entender la correlación entre el aumento de genética de
GATA6
y desarrollo PDAC, se evaluó
GATA6
número de copias en microdissected muestras de epitelio normal del conducto, PanIN, y PDAC humana mediante PCR cuantitativa. En relación con el genoma haploide, no hubo un aumento de
GATA6
en el epitelio normal del conducto (0 de 4), PanIN-1 (0 de 13) o PanIN-2 (0 de 10) lesiones. Por el contrario, el aumento de
GATA6
número de copias (copias ≥2.3) fue identificado en 6/17 muestras (35%) de PanIN-3 y en 18/55 muestras (33%) de PDAC (Figura 1A).
GATA6
copia número ganancia fue confirmado por fluorescencia
In situ
hibridación (FISH) en las secciones en parafina de un 10 muestras PDAC (Figura 1B) PanIN-3 y.
(a)
GATA6
número de copias (media ± dE) en los conductos normales microdissected (N = 4), PanIN-1 (N = 13), PanIN-2 (10), PanIN-3 (N = 17) lesiones y cáncer de páncreas (N = 55). (B) FISH Representante del núcleo de una célula neoplásica dentro de una lesión PanIN3 con & gt; 11 veces
GATA6
amplificación (derecha) en comparación con el núcleo de una célula neoplásica de una lesión PanIN3 diferente sin aumento de número de copias de
GATA6 gratis (izquierda). GATA6 sonda se marcó con la sonda 18 centrómero del cromosoma rojo y (18 Cent) fue marcado con verde. Las secciones se contratiñeron con DAPI para resaltar los núcleos. (C) La correlación de la expresión de ARNm GATA6 y el número de copias en las microdisecciones de lo normal, PanIN y el tejido canceroso. immunolabeling (D) GATA6 de dos tejidos de cáncer de páncreas con el aumento de número de copias GATA6 en comparación con dos cánceres sin aumento de número de copias. El aumento del número de copias está muy asociada con el etiquetado nuclear de la proteína GATA6. curva de supervivencia (E) de Kaplan-Meier que ilustra la relación de
GATA6
ejemplar número ganancia (≥2.3 copias por genoma haploide) para la supervivencia global en pacientes con cáncer de páncreas resecado quirúrgicamente.
Para seis pacientes el emparejado PanIN-3 y PDAC se microdissected de la misma sección de tejido y se analizó el
GATA6
número de copias,
KRAS
y
TP53
estado del gen (Tabla 1) . En dos pacientes (pacientes 7 y 53)
GATA6
copia fue conocer el aumento de número en las muestras PanIN-3 y PDAC indicando que surgió antes de la aparición del carcinoma infiltrante, mientras que en un tercer paciente (paciente 53)
GATA6
ejemplar número ganancia sólo estaba presente en la muestra PDAC lo que sugiere que surgió durante la progresión temporal de PDAC. Sin embargo, como se analizó una sola PanIN-3 en este paciente, no podemos descartar que PanIN-3 lesiones adicionales y no probados en el páncreas de esta paciente también contenían el aumento del número de copias. Para confirmar que el aumento de
GATA6
copiar resultado número en aumento de la expresión de genes, cuantificamos los niveles de ARNm de GATA6 en estas mismas muestras microdissected (Figura 1C), lo que indica que los niveles relativos de mRNA GATA6 fueron significativamente mayores en las muestras con
GATA6
número de copias ≥2.3 comparación con aquellos con números de copias & lt; 2,3 (461,9 ± 126,2 y 194,1 ± 69,7, p & lt; 0,0004). Del mismo modo, immunolabeling para GATA6 en cinco cánceres de páncreas con el aumento de número de copias mostraron fuertes etiquetado positiva nuclear mientras que no se observó marcaje en cinco cánceres de páncreas con el número de copias. & Lt; 2.3 (Figura 1D) guía empresas
carcinogénesis pancreática es acompañado por la acumulación de alteraciones genéticas en el
KRAS, CDKN2A, TP53
y
SMAD4
genes [27]. Por lo tanto, se determinó la relación de
GATA6
ejemplar número ganancia para el estado genético de estos cuatro genes en PDAC enriquecidas 56 de xenoinjertos. Diecisiete xenoinjertos (30%) tenían un
GATA6
número de copias ≥2.3 en relación con el genoma haploide, de los cuales seis (11%) tenía un número de copias & gt; 5,0. Sin embargo, no hubo correlación de
KRAS, CDKN2A, TP53
o
SMAD4
estado con
GATA6
número de copias. Debido a
GATA6
está también situada en el mismo brazo del cromosoma como
SMAD4 Windows que es con frecuencia blanco de los homocigotos supresión [28], nos preguntamos si la próxima
GATA6
copiar el número de ganancia es específicamente relacionados con eventos de reordenamiento genómico que pueden conducir a la eliminación homocigótica del
SMAD4 Hoteles en el mismo ADN de xenoinjertos. Sin embargo, esta vez no reveló una asociación, con seis de ocho
SMAD4
mutantes que se producen debido a la eliminación homocigótica en xenoinjertos con un aumento de
GATA6
número de copias del frente 13 de las 21 con una deleción homocigótica en el xenoinjertos sin
GATA6
copiar el número de ganancia (p = 0,2844). Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que
GATA6
copia ganancia numbe≥r se produce durante las últimas etapas de la neoplasia intraepitelial de páncreas, pero no se enriquece específicamente para dentro de los carcinomas con alteraciones de estos cuatro genes.
A continuación se determinó el grado en que
GATA6
copiar el número de ganancia se asocia con las características clínico-patológicas de PDAC resecado. No se encontraron relaciones de
GATA6
y la edad, el sexo, el tamaño del tumor, la diferenciación del tumor, localización del tumor o el estado de los ganglios linfáticos. Sin embargo, los pacientes con el número de copias ≥2.3 tenían una supervivencia global más larga que los pacientes sin aumento de número de copias de estimación de supervivencia de Kaplan-Meier (p = 0,0096, Figura 1E).
GATA6 promueve el crecimiento celular
in vitro
y
en Vivo
La amplificación y sobreexpresión de
GATA6 Hoteles en PanIN y PDAC sugiere que contribuye a la biología PDAC [8], [9]. por lo tanto, Hemos construido vectores lentivirales que expresan o bien un shRNA específica mock o GATA6 y los usaron para infectar de forma estable las líneas celulares PDAC AsPC1 y A13a con números de copias de 2,3 y 9,0 con respecto al genoma haploide, respectivamente [8], [9]. En ambas líneas celulares, GATA6 también se sobreexpresa por lo menos 10 veces en relación con células de los conductos normales [8], [9] (Figura S2). Desmontables de GATA6 en ambas líneas celulares (Figura 2A, 2B) dio lugar a disminuciones significativas en la proliferación celular y la formación de colonias (Figura 2C y D), una reducción en las células dentro de G2 /M fase (Figura 2E) y disminución del crecimiento in vivo (Figura 2F y 2G). Por el contrario, la sobreexpresión de GATA6 forzada en la línea celular PDAC Panc1 con bajos niveles de expresión GATA6 endógena [8] (Figura 3A y la Figura S2) condujeron a un aumento de la proliferación celular y la formación de colonias (Figura 3B y 3C) similar a la que también se indica anteriormente para la línea de células MiaPaca2 que no tiene expresión endógena de GATA6 [8].
(a) proteína total se extrajo de las células y los controles simulados shRNA AsPC1-GATA6sh y A13a-GATA6sh y se analizó por transferencia Western para los niveles relativos de proteína GATA6 relativa a la actina. (B) PCR en tiempo real para la expresión GATA6 en AsPC1-GATA6sh y células A13a-GATA6sh. También se analizaron (C) Estas células para la proliferación celular en diferentes puntos de tiempo, (D) se cultivaron en agar blando y el número de colonias a las 2 semanas contado, y (E) se analizaron por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células en G2 /M fase. (F) la formación de xenoinjertos Representante
in vivo gratis (arriba) y después de la explantación (inferior) de control de AsPC1 y células GATA6sh a las 8 semanas después de la inyección. (G) el volumen tumoral promedio (media ± DE) de estos mismos xenoinjertos a las 8 semanas después de la inyección. Se observaron resultados similares para células A13a-GATA6sh (datos no mostrados). Con excepción de citometría de flujo que se realizó por duplicado, todos los datos experimentales mostrados representa el resumen de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P. & Lt; 0,001
(A) PCR en tiempo real para la expresión GATA6 en Panc1 de forma simulada, Panc1-GATA6 y células Panc1-mGATA6. (B) Panc1-mock, Panc1-GATA6 y Panc1-mGATA6 células se analizaron para la proliferación celular, ya sea o (C) se cultivaron en agar blando y el número de colonias a las 2 semanas contados. (D) la formación de xenoinjertos Representante
in vivo gratis (arriba) y después de la explantación (inferior) del Panc1 de forma simulada, Panc1-GATA6 y células Panc1-mGATA6 a las 8 semanas después de la inyección. (E) el volumen tumoral promedio (media ± DE) de estos mismos xenoinjertos a las 8 semanas después de la inyección. Todos los datos experimentales mostrados representa el resumen de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt;. 0.001
GATA6 regula la transcripción de ADN mediante la unión a GATA motivos canónicos, o como un cofactor transcripcional [2], [29]. Para determinar si los efectos en las células Panc1 eran debido a la actividad de unión a ADN GATA6, se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para crear un ADNc mutante en el que se interrumpió el dominio de dedos de GATA6 Zn (llamado mGATA6), y de nuevo de forma estable células transfectadas Panc1 (Figura 3A ). No hubo diferencias en el crecimiento celular o la formación de colonias entre las células Panc1-mGATA6 y las células transfectadas de control de Panc1 (figura 3B y 3C) lo que sugiere que el promotor del crecimiento efectos de GATA6 observó
in vitro ¿Cuáles son debido a su función como un factor de transcripción. Para aclarar aún más el efecto promotor del crecimiento de GATA6, ratones desnudos fueron inoculados por vía subcutánea con células Panc1-mGATA6 Panc1-GATA6 o. Después de 8 semanas, el volumen medio del tumor fue significativamente mayor en los ratones inyectados con células Panc1-GATA6 que con las células Panc1-mGATA6 (Figura 3D y 3E), que nos lleva a la conclusión de que GATA6 promueve la carcinogénesis a través de su capacidad de unirse al ADN.
el Wnt antagonista Dickkopf1 (DKK1) es un GATA6 Gen Objetivo
GATA proteínas están relacionados con la señalización de Wnt en la embriogénesis del corazón y los pulmones [4], [30], [31]. Por lo tanto, la hipótesis de que GATA6 contribuye a la carcinogénesis pancreática en parte a través de sus efectos en la señalización de Wnt, una relación putativo que no ha sido explorado en detalle para este tipo de tumor. En comparación con las células lentivirales infectados shRNA simulacros, tanto las células AsPC1-GATA6sh y A13a-GATA6sh mostraron una disminución significativa en la actividad de señalización Wnt funcional mediante el ensayo de TOPFLASH (Figura 4A), mientras que la sobreexpresión de GATA6 en Panc1 y células HPNE promovido actividad de señalización Wnt (Figura 4B ). Para determinar si se requiere la expresión de ß-catenina para estos efectos que silenciado la expresión de ß-catenina usando una estrategia shRNA en las células Panc1-GATA6, dando lugar a una inhibición significativa de la proliferación celular y la formación de colonias (Figura 4C y 4D). En los tejidos de cáncer de páncreas, la sobreexpresión GATA6 se correlacionó significativamente con la acumulación nuclear de la proteína ß-catenina (8/12 PDAC con sobreexpresión GATA6 que muestran la acumulación nuclear ß-catenina en comparación con 3/20 sin sobreexpresión GATA6, p = 0,004) (Figura 4E). De este modo, la sobreexpresión GATA6 en PDAC contribuye a la proliferación celular y la formación de colonias mediante la mejora de la señalización de Wnt canónica.
(A) actividad de señalización Wnt en las células de ensayo basado en TOPFLASH AsPC1-GATA6sh y A13a-GATA6sh. La actividad de luciferasa se representa como la relación de OT a de los niveles en las células con GATA6 desmontables con respecto a la de las células transfectadas de manera simulada. (B) actividad de señalización Wnt en las células HPNE-GATA6 determinados por ensayo TOPFLASH Panc1-GATA6 y. La actividad de luciferasa se representa como la relación de OT a de los niveles en las células transfectadas GATA6 en relación con la de las células transfectadas de manera simulada. células Panc1-GATA6 (C y D) se transfectaron transitoriamente con ß-catenina o simulacro de shRNA y (C) la proliferación celular o la formación (D) colonia determinada. Todos los datos experimentales mostrados representa el resumen de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01. (E) Immunolabeling patrones de GATA6 y la proteína ß-catenina en dos tejidos PDAC representativos. Las flechas indican el etiquetado nuclear de tanto GATA6 y ß-catenina en secciones en serie del mismo tejido de cáncer. Por el contrario, la muestra PDAC con baja expresión GATA6 también muestra ninguna expresión de ß-catenina.
GATA6 regula sus genes diana mediante la unión al motivo de unión a GATA [2]. Para identificar los genes diana GATA6 que pueden influir en la señalización de Wnt, se realizó un perfil de expresión génica utilizando AsPC1-GATA6sh y A13a-GATA6sh y sus controles simulados y se identificaron 113 genes comúnmente disregulados (Figura 5 y Tabla S1) uno de los cuales era Dickkopf-1 (
DKK1
), un antagonista de la señalización canónica de Wnt [32]. Wnt11, un gen diana GATA6 conocido [30], también fue identificado lo que sugiere que GATA6 contribuye a la regulación vía Wnt en parte a través de la regulación de estos genes. Debido DKK1 previamente no ha sido reconocido como un
GATA6
gen diana que se centró específicamente en la relación de GATA6 a DKK1.
(A) Diagrama de Venn que indica el número de genes desregulados identificados por el análisis de microarrays de AsPC1-GATA6sh (a la izquierda del círculo, azul) y las células A13a-GATA6sh (círculo de la derecha, amarillo). La cruz-zona verde indica genes comúnmente disregulados e incluye DKK1. (B) PCR en tiempo real de confirmar la sobreexpresión DKK1 en AsPC1-GATA6sh y células A13a-GATA6sh. (C) La detección de la proteína secretada DKK1 en medios acondicionados en AsPC1-GATA6sh y células A13a-GATA6sh. los niveles de proteína DKK1 secretadas se indican mediante el uso de OD450 absorbancia. (D) ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina que confirma la unión de GATA6 a la
DKK1
promotor. IgG no inmune y de todo el genoma derivan gDNA se utilizan como controles negativos y positivos, respectivamente. ensayo (E) EMSA confirmando la unión de GATA6 a putativo GATA sitios de unión#2 y#3. La secuencia mutante mGATA-#3 no genera ninguna unión detectable. Extr nuclear, extracto nuclear; GATA6-P, una sonda de control positivo derivado de la
TFF2
promotor que contiene un sitio de unión GATA6; Gata-# 2, la sonda que contiene la supuesta GATA sitio de unión N ° 2; Gata-# 3, la sonda que contiene la supuesta GATA sitio de unión N ° 3; mGATA-#3, sonda que contiene un putativo sitio de unión a GATA mutado Nº 3; se refieren a métodos para detalles adicionales (F) Efecto de la expresión GATA6 sobre la actividad de la
DKK1
promotor. Los datos se presentan como la relación de la actividad de luciferasa de luciérnaga para actividad de luciferasa Renilla reniformis. pGL3 se utilizó como control negativo para el fondo. (G) PCR en tiempo real para la expresión de ARNm en células DKK1 Panc1. Cuando sea apropiado, todos los datos experimentales mostrados representa el resumen de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; ***, P & lt;. 0.001
PCR en tiempo real confirmó DKK1 mRNA upregulation y aumento de la secreción de la proteína DKK1 en los medios de comunicación celular en ambas líneas celulares en presencia de caída GATA6 (figuras 5B y 5C) . Para determinar si
DKK1
es un objetivo directo de GATA6, se realizaron búsquedas en el
DKK1
promotor de secuencias de unión GATA6 consenso. Cuatro motivos de unión a GATA independientes fueron identificados (Figura S3), y por la cromatina immunoprecipitation ensayo la unión directa de GATA6 a estos motivos en el
DKK1
promotor se demostró (Figura 5D). La unión por GATA6 también se confirmó mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética (Figura 5E y datos no presentados). A continuación utiliza un indicador de la luciferasa bajo el control del
DKK1
promotor para determinar si la unión a GATA6
DKK1
impactos sobre la actividad transcripcional del gen. Este reportero fue activado tanto en células 293T y Panc1 que reflejan la activación endógena de expresión DKK1. Sin embargo, después de la expresión forzada GATA6 (Fig. 5F) actividad de luciferasa se redujo significativamente, mientras que ningún efecto sobre
DKK1
promotor de la actividad se observó en la presencia del mutante motivo (mGATA6) de unión GATA6, lo que indica que los efectos represivos de GATA6 en
DKK1
requiere la unión directa de GATA6 a la
DKK1
promotor. La expresión forzada de tipo salvaje, pero no en la proteína mGATA6 Panc1 también dieron lugar a una disminución significativa en los niveles de ARNm de DKK1 (Figura 5G). Tomados en conjunto, estos datos indican que GATA6 regula negativamente DKK1 transcripción a través de la unión directa al motivo GATA en el
DKK1
región promotora.
Expresión DKK1 en PDAC se correlaciona con la activación de Wnt
Miembros de la familia de DKK (DKK1, DKK2, DKK3 y DKK4) se secretan proteínas que inhiben la señalización de Wnt canónica mediante la unión a una subunidad del receptor Wnt LRP5 complejo /6 [32]. 0,01;