Extracto
La angiogénesis y la invasividad del cáncer contribuyen en gran medida a la malignidad del cáncer
Arf6. y su efector, AMAP1, son frecuentemente sobreexpresado en cáncer de mama, y constituyen una vía central para inducir la invasión y la metástasis. En esta vía, Arf6 es activada por EGFR vía GEP100. Arf6 es altamente expresado también en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y está implicada en la angiogénesis. Aquí, se encontró que HUVECs AMAP1 también altamente expresa, y que el factor de crecimiento endotelial vascular del receptor-2 (VEGFR2) reclutas GEP100 para activar Arf6. funciones AMAP1 por la unión a cortactin en la invasión del cáncer y la metástasis. Se demuestra que la misma vía GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin es esencial para las actividades de la angiogénesis, incluyendo la migración celular y la formación tubular, así como para la mejora de la permeabilidad celular y VE-cadherina endocitosis de HUVECs estimulada por VEGF. Componentes de esta vía son altamente expresado en la angiogénesis patológica, y el bloqueo de esta vía inhibe eficazmente VEGF o la angiogénesis inducida por tumores y la neovascularización coroidea. La vía GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin, activado por tirosina quinasas receptoras, parece ser común en la angiogénesis y el cáncer de la invasión y la metástasis, y proporciona sus nuevas dianas terapéuticas
Visto:. Hashimoto A, Hashimoto S, Ando R, Noda K, Ogawa E, Kotani H, et al. (2011) GEP100-Arf6-AMAP1-Cortactin Camino de uso frecuente en el cáncer de invasión se activa por VEGFR2 para promover la angiogénesis. PLoS ONE 6 (8): e23359. doi: 10.1371 /journal.pone.0023359
Editor: Toru Ouchi, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de abril, 2011; Aceptado: July 13, 2011; Publicado: 15 de agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Hashimoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones-en-ayudas del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura de Japón (MESSC), la Fundación Takeda Ciencia y la Fundación Mitsubishi. No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
vasculares factores de crecimiento endotelial (VEGF) son los principales factores implicados en la angiogénesis [1] - [4]. Un miembro de la familia de VEGF, VEGF-A saber, se descubrió originalmente como un factor vascular permeabilidad [5]; y la función primaria de la señalización de VEGF implica mejora de la permeabilidad de las células endoteliales y la permeabilidad vascular [6]. Una pequeña GTPasa, Arf6, se ha implicado en la señalización de VEGF y la angiogénesis. Se ha demostrado que la expresión de una forma dominante negativa de Arf6, Arf6 (T27N), en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) inhibe factor de crecimiento vascular endotelial receptor-2 (VEGFR2) mediada por la señalización intracelular, tales como Rac1 activación [ ,,,0],7]. Consistentemente, la supresión de la actividad a través de la Arf6 Slit2-Robo4 bloques vía la angiogénesis y promueve la estabilidad vascular [8]. Sin embargo, el mecanismo en cuanto a cómo VEGFR2 regula la actividad Arf6, así como los mecanismos por los que las funciones Arf6 en la angiogénesis, y también en otros aspectos de la señalización de VEGF, todavía en gran parte sigue siendo difícil de alcanzar.
Una pequeña GTPasa, Arf6, regula principalmente el reciclaje de los componentes de la membrana de plasma y juega papeles pleiotrópicos, entre ellos la protrusión de la membrana y la remodelación de [9], [10]. Hemos demostrado previamente que diferentes células de cáncer de mama sobreexpresan tanto Arf6 y su efector, AMAP1; y que sobreexpresa Arf6 y AMAP1 constituyen entonces un eje de señalización robusto para inducir la invasión y metástasis [11] - [15]. En la invasión y la metástasis, GEP100, un intercambiador de nucleótidos de guanina para Arf GTPasas, es principalmente responsable de la activación Arf6, y esta activación requiere la asociación de GEP100 con el receptor activado por ligandos del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [15]. análisis patológico reveló que los componentes de esta vía son altamente expresado en el 40-80% de los tumores primarios de mama humano [12], [15]. funciones AMAP1 por la unión a cortactin en la invasión del cáncer y la metástasis. El bloqueo de la vía GEP100-Arf6-AMAP1-Cortactin de siRNAs o inhibidores bloquea eficazmente la invasión del cáncer de mama y metástasis [11] - [13], [15]. Leer-outs de esta vía Arf6 incluir la interrupción de las adherencias célula-célula-E-cadherina en base [15], mediante la inducción de la endocitosis E-cadherina (nuestros resultados no publicados).
La expresión proteica de Arf6 es aumentado notablemente en HUVECs cuando se cultivan con VEGF, y en un modelo de isquemia del miembro posterior de ratón en el que la angiogénesis depende principalmente de VEGF [7], [16]. Aquí, se encontró que HUVECs AMAP1 también altamente expreso, comparable a los niveles observados en células de cáncer de mama altamente invasivas. También se encontró que GEP100 físicamente asociados con VEGFR2 activado por ligandos para activar Arf6, y que Arf6, se movilizan las AMAP1. Al igual que la invasión del cáncer y la metástasis, las funciones AMAP1 mediante la unión a cortactin en la angiogénesis. Esta vía GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin es esencial no sólo para la migración de células endoteliales inducida por VEGF y la formación tubular, sino también para la mejora inducida por VEGF de VE-cadherina endocitosis y la permeabilidad celular. Componentes de esta vía son altamente expresado en los vasos CD31-positivo con la angiogénesis patológica, y el bloqueo de esta vía inhibe eficazmente la angiogénesis patológica. Nuestros resultados revelan que la vía GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin, activado por tirosina quinasas receptor del factor de crecimiento, es común en la angiogénesis y la invasión y la metástasis de algunas células de cáncer de mama, y por lo tanto proporciona nuevas dianas terapéuticas para los trastornos humanos que se caracterizan por la hiper-angiogénesis y el desarrollo del cáncer maligno
Materiales y Métodos
las células
HUVECs fueron adquiridos de Iwaki y se cultivaron en medio de crecimiento endotelial-2 (EGM2; Lonza)., de acuerdo con el fabricante de instrucción. Tenga en cuenta que EGM2 contiene una baja concentración de VEGF, una concentración que no está abierto al público. MDA-MB-231 y MCF7 células, obtenidas de la American Type Culture Collection, se cultivaron como se describe anteriormente [15]. Cos-7 células fueron cultivadas en DMEM con 10% de suero de ternera fetal (FCS, Hyclone).
La angiogénesis
La cuantificación de las respuestas angiogénicas se llevó a cabo por el dirigido
in vivo
ensayo de angiogénesis (DIVAA, Trevigen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 20 l de VEGF (500 ng ml
-1) o células MDA-MB-231 (5 × 10
6 ml
-1) se inyectó en tubos angioreactor, que estaban llenos de membrana basal extractos; y tubos se implantaron por vía subcutánea en las áreas dorsales de ratones desnudos. Nueve días más tarde se recogieron los tubos y las cantidades de isolectina B4 acumulados dentro de los extractos de la membrana basal se midieron utilizando un lector fluorescente multidisco (ARVO, Perkin Elmer), después de la digestión proteolítica de la membrana basal. Para el tratamiento siRNA, dúplex de ARN se mezclaron con AteloGene (Koken), de acuerdo con las instrucciones del fabricante; y 200 l de la mezcla se inyectó en los lados inferiores de los tubos angioreactor implantados en ratones, en el día 0 y día 4. Se añadieron péptido P4-TAT y el péptido de control SC en los tubos angioreactor antes de la implantación. Estos estudios se realizaron en el Instituto de Biociencias de Osaka, y los protocolos utilizados para los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal del Instituto de Biociencias de Osaka (Número de permiso: 07-103).
inducida por láser CNV
CNV se llevó a cabo como se describe anteriormente [17], [18]. Un día antes de la administración láser, 5 mg kg
-1 P4-TAT o péptido SC se inyectaron por vía intraperitoneal en macho 2 meses de edad, C57BL /6 ratones (CLEA Japón). Los próximos ratones día fueron anestesiados con pentobarbital (0,05 mg g
-1 peso corporal) y sus pupilas dilatadas con fenilefrina al 0,5% y 0,5% tropicamida (Santen). CNV se indujo con un láser nm 532 (Lumenis Novus Spectra). Cuatro puntos de láser (200 mW de potencia, 75 micras de tamaño de punto, 100 mseg) se colocaron en cada ojo utilizando un sistema de suministro de lámpara de hendidura y una cubierta de vidrio como una lente de contacto. La producción de una burbuja en el momento de tratamiento con láser, que indica ruptura de la membrana de Bruch, es un factor importante en la obtención de CNV; por tanto, sólo se quema en el que una burbuja fue producido se incluyeron en este estudio. Inmediatamente después del tratamiento con láser, 5 mg kg
-1 P4-TAT o el péptido codificado de control se inyectó por vía intraperitoneal cada día durante 7 días. En el día experimental 8, los ratones fueron anestesiados y perfundidos a través del ventrículo izquierdo con 5 ml de PBS seguido por 2 ml de 0,5% de dextrano marcado con FITC (Mr 2000 kDa, Sigma) en 1% de gelatina. Los ojos fueron enucleados y fijados en paraformaldehído al 2% durante 30 min. El segmento anterior y la retina se retiraron entonces de la ojera. Se hicieron alrededor de 4 a 6 relajantes incisiones radiales, y el epitelio pigmentario de la retina restante (RPE) compleja -choroidal-escleral se flatmounted con Vectashield medio de montaje (Dako) y coverslipped. Flatmounts se examinaron con un microscopio (BIOREVO; Keyence) y las imágenes de cada CNV se almacenaron digitalmente. Los ojos con complicaciones hemorrágicas tales como hemorragia vítrea o hemorragia subretinal causada por la irradiación con láser se excluyeron de la evaluación. A continuación se midió el tamaño medio de las lesiones de la CNV, y los datos se presentan como la media ± s.e.m. con
n
como se indica. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión y el Comité para el Uso de Animales y Cuidado de la Universidad de Hokkaido.
VE-cadherina endocitosis
endocitosis VE-cadherina se ensayó por el método de VE-cadherina anticuerpo de unión, como se describe [19]. Brevemente, HUVECs, chapado a una densidad confluente, se prestarved con EGM2 sin suero durante 4 h y, a continuación, la incubación con un anticuerpo monoclonal BV6 (10 mg ml
-1), que es contra el dominio extracelular de cadherina VE, a 4 ° C durante 1 h. Después de lavar el anticuerpo no unido por lavado las células con EGM2 enfriado en hielo, las células se incubaron a continuación a 37 ° C durante 30 min en presencia o ausencia de VEGF (50 ng ml
-1). Las células fueron lavadas con glicina 25 mM (pH 2,5) que contiene 3% de albúmina de suero bovino durante 15 min a una temperatura ambiente para eliminar los anticuerpos unidos a la superficie, y se fijaron en paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100, y se somete con el etiquetado de moléculas BV6 internalizados por el uso de un anticuerpo contra IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 546 (Molecular Probes). Para el tratamiento siRNA, las células se preincubaron con dúplex de ARN durante 48 h, antes de la siembra. Para el tratamiento péptido TAT, las células se incubaron con los péptidos TAT durante 30 min a 37 ° C entre el 4 h hambre y el etiquetado con BV6. Se contó el número de células que presentan al menos un grupo de cinco o más estructuras de vesículas como resistente a los ácidos VE-cadherina-positivos (n & gt; 300). Los resultados se expresan como la media ± s.e.m. de tres experimentos independientes, y el análisis estático se realizó mediante ANOVA.
Otros métodos
GST-GGA desplegables, inmunoprecipitación, inmunotransferencia, anticuerpos y sustancias químicas, ADNc, siRNAs, transfecciones, formación tubular, quimiotaxis la migración transwell, dos actividades migración celular dimensional tinción inmunohistoquímica, la permeabilidad celular, microscopía de inmunofluorescencia, la unión de GST-PH, la viabilidad y RT-PCR se describen en los materiales de apoyo y Métodos S1.
resultados
VEGF activa a través de Arf6 GEP100 en las células endoteliales
Aunque la actividad Arf6 está implicada en la señalización de VEGF y la angiogénesis, que aún no esta activa si VEGF Arf6. Hemos encontrado que la estimulación de cultivo primario de HUVECs por VEGF activación de hecho inducida de Arf6 endógeno (Figura 1A). Esta activación fue transitoria, alcanzó un máximo de 1 min y luego disminuyó, como se ha observado con otras pequeñas GTPasas [20]. HUVEC expresan predominantemente VEGFR2 entre los miembros VEGFR-familiares. Fosforilación de la tirosina de VEGFR2 se produjo dentro de 1 min y un pico de 3 min y se redujo en 10 min después de la estimulación (Figura 1A).
A, la activación de Arf6 y la fosforilación de tirosina de VEGFR2 a la estimulación VEGF de HUVECs. B, coprecipitación de GEP100 con VEGFR2 a la estimulación VEGF de HUVECs, analizado por inmunoprecipitación anti-GEP100 (IP) y de inmunotransferencia anti-VEGFR2. PI, suero pre-inmune. C-D, Actividades de Arf6 (C), y Erk y Akt (D) en HUVEC transfectadas con siRNAs para GEP100 o irrelevantes secuencias (TIR) a la estimulación de VEGF. E, coprecipitación de VEGFR2-V5 y su tirosina mutantes de fosforilación deficiente (951F, 1175F y 1214F) con HA-GEP100 expresado en células Cos-7, analizados por los anticuerpos anti HA-inmunoprecipitación (GEP100) y anti V5-inmunoblot (VEGFR2). F, la activación de Arf6-HA por VEGFR2-V5 o sus mutantes (951F, 1175F y 1214F) tras la estimulación VEGF en células Cos-7, en el que GEP100 cDNA no etiquetados se transfectó simultáneamente. En A-F, 10 ng ml
-1 VEGF se utilizó para la estimulación de 1 min (+) o durante los tiempos indicados, mientras que los controles incluyeron células sin estimulación (0 min o -). actividades Arf6 se evaluaron por el método de GST-GGA pulldown (A, C, F). Totales, lisados de células totales (20 g). En A-D, las HUVEC se cultivaron en suero bajo (0,5% FCS) al medio durante 16 h antes de la estimulación. Estos ensayos se realizaron al menos dos veces y se dan cifras representativas.
A pesar de que las vías de señalización corriente abajo de VEGFR2 se han estudiado ampliamente [21], ninguno de ellos podía interpretar los mecanismos de activación Arf6. Además, más de un solo tipo de GEF pueden activar Arf6 [22], [23]. a continuación, hemos tratado de identificar GEF (s) principal responsable de esta activación Arf6 inducida por VEGF. GEP100 se une a tirosina fosforilada EGFR [15]. Hemos probado si GEP100 también se une a tirosina fosforilada VEGFR2, y encontramos que VEGFR2 se coprecipitated con GEP100 en HUVECs de forma endógena, cuando las células fueron estimuladas por VEGF (Figura 1B). A continuación, derribado por el método GEP100 siRNA en HUVECs, y encontramos que esta caída abolida en gran medida la activación inducida por VEGF de Arf6 (Figura 1C y Figura S4). Estos resultados sugieren que GEP100 es principalmente responsable de la activación inducida por VEGF de Arf6 en HUVECs.
señalización de VEGF es conocida por activar Erk y Akt [21]. El silenciamiento de GEP100 no afecta a la activación de Erk y Akt en HUVECs (Figura 1D). Estos resultados, junto con los resultados descritos anteriormente, confirman la especificidad de GEP100 en la señalización de VEGF, e indican que la vía de señalización de VEGF que activa Arf6 es independiente de que la activación de Erk y Akt en HUVECs. Por otra parte, la activación de ERK y Akt tanto se produce 10 minutos después de la estimulación de VEGF, que es mucho más lento que la activación de Arf6.
Modo de GEP100 unión a ligando-activado VEGFR2
A continuación se investigó el mecanismo preciso por el que el ligando-activado VEGFR2 emplea GEP100. El dominio PH de GEP100 une a ciertas tirosinas fosforiladas de EGFR [15]. En primer lugar, examinamos si este dominio PH también se une a tirosinas fosforiladas de VEGFR2. Para ello, expresamos V5-etiquetados VEGFR2 en células Cos-7, y sus lisados se sacó abajo-
in vitro Vaya con el dominio PH de GEP100, fusionada con glutatión
s
transferasa (GST). Se encontró que el dominio PH GST-GEP100 tira hacia abajo ligando-activado VEGFR2-V5, mientras que los dominios PH de ARNO o fosfolipasa Cδ no lo hacen (Figura S1). VEGFR2 tiene 6 tirosinas fosforiladas principales, tras la estimulación de VEGF: Tyr951, Tyr996, Tyr1054, Tyr1059, Tyr1175 y Tyr1214 [21] (véase la figura S2). Se sintetizaron estos péptidos de tirosina en su forma fosforilada, y encontramos que el dominio PH GST-GEP100 se une al péptido fosforilado Tyr951, pero no a los otros péptidos fosforilados (Figura S3). Además, el dominio PH GST-GEP100 no se unió a la no fosforilada Tyr951 péptido (Figura S3). Se confirmó la fosforilación de Tyr951 a la estimulación VEGF en HUVEC (Figura S5).
Sobre la base de estos resultados, se genera entonces una forma mutante de VEGFR2-V5, en el que Tyr951 se cambió a fenilalanina (951F) y expresamos en células Cos-7 junto con hemaglutinina (HA)-etiquetados GEP100, y encontraron que este mutante no se coprecipita con HA-GEP100 (Figura 1E). Como control, se confirmó que la de tipo salvaje VEGFR2-V5 se coprecipitated con HA-GEP100 (Figura 1E). Por otra parte, las mutaciones de las otras tirosinas, como Tyr1175 y Tyr1214, en fenilalanina (1175F y 1214F, respectivamente) no afectaron a la coprecipitación (Figura 1E). A continuación, expresó VEGFR2-V5 o sus mutantes, junto con Arf6-HA y GEP100 en células Cos 7, y las actividades de Arf6-HA se midió mediante el uso del método de GST-GGA pulldown [24]. Se encontró que el mutante 951F de VEGFR2-V5 no induce la activación de Arf6-HA en respuesta a VEGF, mientras que el 1175F y 1214F mutantes, así como el tipo salvaje VEGFR2-V5, inducir la activación Arf6-HA (Figura 1F). Estos resultados indican que VEGFR2 físicamente asociados con GEP100 para activar Arf6 a la estimulación VEGF: una asociación que requiere la unión de fosforilados Tyr951 de VEGFR2 y el dominio PH de GEP100. También confirmó que la forma fosforilada de Tyr951-VEGFR2 se coprecipitated con GEP100 de HUVECs de forma endógena, a la estimulación de VEGF (Figura S2).
Requisitos para Arf6 en formación tubular inducida por VEGF y la migración
tubulares (o de tipo capilar) la formación de la red de HUVEC cultivadas
in vitro
es uno de los sello procesos necesarios para la angiogénesis [1], [2]. Para examinar la participación de Arf6 en la angiogénesis inducida por VEGF, que después se ensayaron los efectos de Arf6 siRNA. Desmontables de Arf6 deteriora significativamente la formación tubular inducida por VEGF, en comparación con el control de dúplex de ARN irrelevantes (TIR) (Figura 2A y la Figura S4), sin afectar la viabilidad celular (Figura 2B). célula actividad migratoria inducida por VEGF es otra característica distintiva de la actividad angiogénica [25]. tratamiento Arf6 siRNA abolió las actividades de migración trans-VEGF inducida casi por completo, los cuales fueron evaluados utilizando cámaras de Boyden modificadas [26] (véase la figura 2C). actividades de migración bidimensionales inducidos por VEGF, evaluados mediante el ensayo de cicatrización de la herida [27], fue también casi completamente bloqueada por el tratamiento Arf6 siRNA (Figura 2D).
HUVEC, se trató con siRNAs para Arf6 o secuencias irrelevantes ( Irr), se sometieron a ensayo de formación de la red tubular en presencia de 10 ng ml
-1 VEGF (a), a un ensayo de viabilidad (B), y a un ensayo de migración usando una cámara de Boyden modificada (C) o usando un ensayo de cicatrización de la herida (D) en presencia y ausencia de VEGF (10 ng ml
-1). En A y D, los ensayos se realizaron más de dos veces, y se muestran figuras representativas. En B, más de 1 × 10
4 células fueron anotados en cada ensayo. En C, los datos se presentan como el número de células observadas por campo microscópico (× 20) que transmigrado el filtro de cámara de Boyden. Seis campos fueron contados en cada ensayo. Las barras de error muestran la media ± SEM, n = 3. * p & lt;. 0,05
Los altos niveles de expresión en HUVECs AMAP1 y la participación de GEP100 y AMAP1 en actividades angiogénicos VEGF inducida
AMAP1 es un efector aguas abajo de Arf6, y funciona en la invasión del cáncer y la metástasis [12]. La mayoría de las células de cáncer de mama malignos con actividades invasivas de alta anormalmente sobreexpresan tanto Arf6 y AMAP1 proteínas, mientras que las células de cáncer de mama weakly- o no invasivos expresan sólo niveles marginales de estas dos proteínas [11], [12]. HUVECs se sabe que expresan Arf6 a un alto nivel [7], lo que nos pareció ser casi equivalente a la observada con MDA-MB-231 células de cáncer de mama altamente invasivas (Figura 3A). HUVECs también expresan AMAP1 a un nivel muy alto, lo que también es comparable a MDA-MB-231 células (Figura 3A).
A, la expresión de Arf6 y AMAP1 proteínas en HUVECs y su comparación con los de invasiva ( MDA-MB-231) y (células MCF7) de cáncer de mama no invasivas, por inmunotransferencia 20 g del total de lisados celulares usando anticuerpos como se indica. β-actina se utilizó como control. B-E, HUVECs, se trató con siRNAs para GEP100, AMAP1, cortactin o secuencias irrelevantes (TIR), se sometieron al ensayo de formación tubular (B), modificado ensayo de cámara de Boyden (C), la herida de ensayo (D) o la viabilidad celular de curación ensayo (E), como en la figura 2. AMAP2 siRNAs se incluyeron como otro control (B, E). Estos ensayos se realizaron al menos dos veces, y se muestran figuras representativas. Las barras de error muestran la media ± s.e.m., n = 3. * p & lt;.
0,05
A continuación examinó si GEP100 y AMAP1 están involucrados en actividades angiogénicos VEGF inducida por
in vitro
. Desmontables de GEP100 y AMAP1 cada formación tubular inducida por VEGF afectado significativamente, y las actividades casi completamente bloqueados inducidos por VEGF de células migratorias (Figura 3B-3D y la figura S4), sin afectar la viabilidad celular (Figura 3E). Como control, también derribado AMAP2 [28] (véase la figura S4), una isoforma cerca de AMAP1, y no observaron un efecto inhibidor sobre la formación tubular (Figura 3B).
Requisitos para Cortactin y su asociación con AMAP1 en actividades angiogénicos VEGF inducida
AMAP1 funciones mediante la formación de un complejo con cortactin en células de cáncer de mama invasivo [12], [13]. Se encontró que AMAP1 forma un complejo con cortactin también en HUVECs, y esto la formación del complejo aumentó significativamente cuando las células se cultivaron con VEGF (Figura 4A). Por otra parte, siRNAs cortactin eficazmente las actividades angiogénicas inhibidos inducidos por VEGF
in vitro
, sin afectar la viabilidad celular (Figura 3B y 3E).
A, coprecipitación de cortactin con AMAP1 en HUVECs se cultivaron en presencia de 10 ng ml
-1 VEGF, se analizó por inmunoprecipitación anti-AMAP1 y de inmunotransferencia anti-cortactin, como se indica. PI, suero pre-inmune. B-D, HUVECs, se cultivaron en presencia de P4-TAT (P4) o un péptido permeable celular revueltos (SC) a 10 M (C, D, F) o a concentraciones tal como se indica (B, E) de 1 h antes para análisis, se sometió a el ensayo de formación tubular (B), modificado ensayo de cámara de Boyden (C), de heridas de ensayo (D) y ensayo de viabilidad celular (e), la curación como en la figura 2, en presencia de los péptidos. La coprecipitación de cortactin con AMAP1 en estas células se analizó como anteriormente (F). Totales, lisados de células totales (20 g). Estos ensayos se realizaron al menos dos veces, y se muestran figuras representativas. Las barras de error muestran la media ± sem, n = 3. * p & lt;. 0.05
previamente Hemos diseñado un péptido de células permeable, es decir, P4-TAT, que bloquea AMAP1 y cortactin de unión, y por lo tanto inhibe el cáncer invasión y metástasis [13]. P4-TAT, pero no el control mezclado TAT-péptido (SC), bloquearon actividades angiogénicos inducidos por VEGF
in vitro
, como la formación tubular y la migración de células, de una manera dependiente de la dosis, sin afectar la viabilidad celular ( Figura 4B-4E). Se confirmó que la P4-TAT, pero no SC, bloques endógena unión de AMAP1 con Cortactin en HUVEC (Figura 4F). Estos resultados indican que las funciones AMAP1 a través de su formación de complejos con Cortactin en HUVECs, y esto la formación del complejo es necesario para las actividades angiogénicos inducidos por VEGF.
Implicación de la vía de señalización en la angiogénesis Arf6
a continuación, examinó si la vía GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin está implicada en la angiogénesis patológica
in vivo
. Para esto, primero confirmó que los vasos patológicos CD31-positivas [16] son fuertemente positivas para GEP100 y AMAP1 (Figura 5A). Los anticuerpos contra Arf6 aplicables a la inmunohistoquímica no estaban disponibles. A continuación, prueba GEP100 siRNAs y P4-TAT. Para esto, los tubos angioreactor [29], cargados con VEGF o células MDA-MB-231, se implantaron en ratones desnudos, y 9 días más tarde se midieron las cantidades de isolectina B4 acumulados dentro de los tubos. se sabe que las células MDA-MB-231 para producir varios factores angiogénicos [30]. La administración de GEP100 siRNAs, pre-mezclada con AteloGene [31], en ratones implantados con estos angioreactors inhibió su angiogénesis en una manera dependiente de la dosis, mientras que un ARN dúplex irrelevante no lo hizo (Figura 5B y 5D). P4-TAT, pero no SC, también inhibió esta angiogénesis de manera dependiente de la dosis (Figura 5C y 5E).
A, inmunohistoquímica de tejido de granulación y las secciones de tejido de la cicatriz por el uso de los anticuerpos indicados. Bares, 100 m. B-E, Efectos de GEP100 siRNAs y P4-TAT (P4) sobre la angiogénesis se midieron utilizando angioreactors implantados en ratones desnudos, que contenía extractos de membrana basal y VEGF (500 ng ml
-1) o MDA-MB-231 células (1 × 10
5 células); y cantidades de isolectina B4 acumulados dentro de los extractos de la membrana basal se midieron después de la incubación durante 9 días. siRNAs, mezclado con AteloGene a concentraciones tal como se indica, se inyectaron en los ratones el día 0 y día 4. TAT-péptidos se añadieron en angioreactors antes de la implantación, a las concentraciones indicadas. Un dúplex de ARN irrelevante (IRR) o un péptido codificado (SC) se utilizaron como controles. Las barras de error muestran la media ± s.e.m., n = 8. * p & lt; 0,05. F-G, Efecto de P4-TAT en la formación de la CNV. micrografías representativas de las lesiones CNV en flatmounts coroideos de un animal tratado con P4-TAT o SC. Línea discontinua roja muestra la extensión de las lesiones CNV llenos de FITC-dextrano. Barra de escala, 100 micras. El análisis cuantitativo del tamaño medio de la CNV se muestra en G. Las barras de error muestran la media ± SEM, n = 70 a 77. * P & lt;.
0,05
Por otra parte examinamos los efectos de P4-TAT en coroidea neovascularización (NVC), que es la principal causa de pérdida severa de la visión en pacientes con degeneración macular relacionada con la edad [32], por el uso de la neovascularización coroidea inducida por láser en ratones [17], [18]. P4-TAT o péptido SC se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones todos los días de un día antes de que el tratamiento con láser hasta el final del experimento. Elegimos la administración intra-peritoneal en lugar de la inyección directa en los ojos, para evitar dañar a los ojos por el último método. P4-TAT también fue eficaz en la inhibición de la CNV (Figura 5F y 5G).
Implicación de la vía de señalización Arf6 de la permeabilidad endotelial y la VE-cadherina endocitosis
La función primaria de la señalización de VEGF implica la promoción permeabilidad de la célula endotelial y la fuga vascular. la señalización de VEGF induce la endocitosis de la VE-cadherina, y esto endocitosis es crucial para la mejora de la permeabilidad endotelial [33], [34].
A continuación se investigó si la vía GEP100-Arf6-AMAP1-Cortactin también participa en la permeabilidad endotelial y la VE-cadherina endocitosis. VEGF mejora la permeabilidad de HUVECs intactas por dos veces, medida por el movimiento paracelular de moléculas de dextrano [19], [35] (véase también la figura 6A). A continuación, examinó los efectos de siRNAs para GEP100, Arf6 y AMAP1 sobre la permeabilidad. Para siRNAs para ser eficaces en este ensayo, el tratamiento debe iniciarse siRNA 36 h antes de que se re-sembraron las células en cámaras para formar monocapas confluentes. Se encontró que HUVECs, se trata con estos siRNAs ya exhiben altos niveles de permeabilidad incluso sin VEGF, y no responden a la estimulación VEGF de cambiar su permeabilidad, (Figura 6A). A continuación mide las tasas de endocitosis de VE-cadherina, desde la membrana plasmática al citoplasma. acelera VEGF VE-cadherina endocitosis por varios pliegues en HUVECs intactas [19] (véase la Figura 6B y 6C). Como en el caso de la permeabilidad, HUVECs trató con GEP100, Arf6 o AMAP1 siRNAs, todas las altas tasas expuestas de la VE-cadherina absorción incluso sin VEGF, y no respondió a VEGF (Figura 6B y 6C). HUVECs intactas presentan uniones célula-célula con alta integridad-cadherina VE-basado, mientras que la estimulación de VEGF evoca su irregular, morfología desorganizado [19] (véase también la figura 6B). Se encontró que el VE-cadherina basados en uniones célula-célula se desorganizan incluso sin estimulación VEGF, cuando las células se tratan con estos siRNAs (Figura 6B). En estos experimentos, siRNAs irrelevantes y AMAP2 se utilizaron como controles negativos. Estos resultados sugieren que la pérdida de estas proteínas perturba células para formar sus adherencias célula-célula intactos, y las células con tales adherencias célula-célula desorganizados ya no son sensibles a la regulación VEGF.
HUVECs, se trató con siRNAs para Arf6, GEP100, AMAP1 o una secuencia irrelevante (IRR) (a-C), o por P4-TAT (P4) o péptido SC (D-F), se sometieron a un ensayo de permeabilidad mediante la medición de movimiento paracelular de FITC-dextrano (Mr 40 moléculas de ensayo de absorción kDa) (a, D), y para un VE-cadherina mediante el seguimiento de la endocitosis de la superficie celular cadherina VE (B, C, e, F). En A-C, las células fueron pretratadas con siRNAs durante 36 h antes de la siembra. En D-F, se añadieron péptidos TAT para el cultivo confluente y se incubaron durante 30 min antes del análisis. VE-CAD, verde; núcleos, azul. Las barras de escala representan 10 micras. Las barras de error muestran la media ± s.e.m., n = 3. * P & lt;.
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A continuación, probamos P4-TAT. A diferencia de los siRNA-tratamientos descritos anteriormente, P4-TAT se puede añadir directamente a los cultivos celulares que son confluentes y ya forman, adherencias célula-célula intactos normales. Hemos encontrado que la adición de 10 mM P4-TAT a los bloques de cultivo confluentes la mejora mediada por VEGF de la permeabilidad celular, mientras que no afecta a la permeabilidad en ausencia de VEGF (Figura 6D). Del mismo modo, P4-TAT bloqueado endocitosis inducida por VEGF de VE-cadherina, mientras que no causa la internalización de VE-cadherina en células cultivadas en ausencia de VEGF (Figura 6E y 6F). cambios morfológicos inducidos por VEGF de las uniones célula-célula también se bloquearon mediante P4-TAT (Figura 6E). Estos efectos de P4-TAT eran dependiente de la dosis, y el péptido de control SC no mostraron tales efectos inhibitorios (Figura 6D-6F). Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que la vía GEP100-Arf6-AMAP1-Cortactin es esencial para la regulación de VEGF de la permeabilidad de las células endoteliales y la VE-cadherina endocitosis. Nuestros resultados también sugieren que los componentes de esta vía esencialmente pueden estar involucrados en la formación de adherencias célula-célula endoteliales intactas, ya que el medio de cultivo celular ya contiene una baja concentración de VEGF.
Discusión
angiogénesis y la invasión del cáncer comparten varias propiedades comunes [36]. Hemos demostrado anteriormente que la vía GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin se utiliza para la invasión y la metástasis de muchas células de cáncer de mama; y en este artículo, nos muestran que esta vía también se utiliza en la angiogénesis, incluyendo angiogénesis inducida por el cáncer de mama y la neovascularización coroidea. La sobreexpresión de las proteínas y Arf6 AMAP1 es necesaria para el buen funcionamiento de esta vía en la invasión y metástasis [11], [12]. Tanto Arf6 y AMAP1 también se expresan en altos niveles en las células endoteliales, como se ha visto con células de cáncer de mama altamente invasivas.