Extracto
Ex vivo
-EXPANDED, natural alogénico killer (NK) las células se pueden utilizar para el tratamiento de diversos tipos de cáncer. En la terapia de células NK alogénicas, las células NK de donantes sanos deben ampliarse con el fin de obtener un número suficiente de células altamente purificadas, activados NK. En el presente estudio, hemos establecido un método simplificado y eficiente para la expansión a gran escala y la activación de las células NK de donantes sanos menores de buenas prácticas de fabricación (GMP) condiciones. Después de una sola etapa de agotamiento magnético de CD3
+ células T, se estimularon las células mononucleares de sangre periférica agotadas (PBMCs) y se expandieron con PBMCs autólogas irradiadas en presencia de OKT3 e IL-2 durante 14 días, lo que resulta en una muy población pura de células CD3
-CD16
+ CD56
+ células NK que se desee para el propósito alogénico. En comparación con las células NK recién aisladas, estas células NK expandido mostraron robusta producción de citoquinas y la actividad citolítica potente contra varias líneas celulares de cáncer. Es de destacar que las células NK expandido mataron de forma selectiva las células cancerosas sin demostrar citotoxicidad frente a células no tumorales alogénicas en ensayos de cocultivo. La actividad anti-tumor de células NK humanas expandido se examinó en ratones SCID inyectados con células de linfoma humano. En este modelo, las células NK expandido controlados de manera eficiente la progresión de linfoma. En conclusión, las células NK alogénicas se ampliaron de manera eficiente en un centro de GMP y demostraron una actividad antitumoral potente tanto
in vitro
y
in vivo
Visto:. Lim O, Lee Y, Chung H, Su JH, Kang SM, Jung Mi, et al. (2013) GMP, a gran escala expandidos células alogénicas asesinas naturales tienen una potente actividad citolítica contra las células cancerosas
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 8 (1): e53611. doi: 10.1371 /journal.pone.0053611
Editor: Jacques Zimmer, Centro de Investigación Pública de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo
Recibido: 3 de septiembre de 2012; Aceptado: 29 Noviembre 2012; Publicado: 11 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Lim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca del amplificador Corea Healthcare tecnología de I +; Proyecto D, Ministerio de Salud, Bienestar & amp; Asuntos de la Familia, República de Corea (A062260). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Eui-Cheol Shin es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE, y entiende que esto hace no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: MJ y HS se emplean en la Cruz Verde LabCell Corp. Mogam Instituto de Investigación de Biotecnología es una fundación de investigación sin fines de lucro. El número de patente: KR2008-74069. Fecha de publicación de Patente: 28 de marzo de 2012. Título de la Patente: Método de Crecimiento de las células asesinas naturales. Cesionario: Green Cross Corp. LabCell y el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl. Inventor: Mi-Jung joven, Dae Seog Heo, y Yu Kyeong Hwang. El número de patente: JP2011-521023. Fecha de patentes presentadas: 31 de enero de 2011. Título de la Patente: Método de Crecimiento de las células asesinas naturales. Cesionario: Green Cross Corp. LabCell y el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl. Inventor: Mi-Jung joven, Dae Seog Heo, y Yu Kyeong Hwang. El número de patente: CN200980130121.5. Fecha de patentes presentadas: 30 de enero de 2011. Título de la Patente: Método de Crecimiento de las células asesinas naturales. Cesionario: Green Cross Corp. LabCell y el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl. Inventor: Mi-Jung joven, Dae Seog Heo, y Yu Kyeong Hwang. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Los otros autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.
Introducción
asesinas naturales (NK) las células son linfocitos especializados que proporcionan una primera línea de defensa contra las infecciones virales y cáncer [1]. actividad de las células NK se regula por medio de señales de activación y receptores inhibidores [2]. La señal de activación de NK está mediada por varios receptores de NK incluyendo NKG2D y receptores de citotoxicidad naturales (NCR) [2], [3]. En contraste, la inhibición NK es conferida por los receptores similares a inmunoglobulina de células killer (KIR), que se unen a moléculas MHC de clase I en las células diana [2], [4]. la expresión de MHC de clase I tiende a perderse o hacia abajo reguladas en las células cancerosas [5] y, como consecuencia, se suprime la señal inhibidora NK, lo que permite a las células NK se activan y matan objetivos malignos.
Recientemente, la actividad anti-tumor de las células NK se ha demostrado en el ajuste de alogénico hematopoyético trasplante de células madre (HSCT) [6]. En TPH agotado de células T, las células NK de donantes son las principales células efectoras responsables del control de las células cancerosas residuales [7]. La actividad de injerto contra tumor (GVT) de las células NK de donantes se mejora significativamente cuando los KIR y MHC de clase I son incompatibles entre donante y receptor, como señales inhibitorias están ausentes [8], [9]. Por lo tanto, el aumento de la actividad de las células NK GVT con KIR-MHC incompatibilidad es la razón fundamental subyacente para el desarrollo de la terapia de células NK alogénicas.
En la terapia de células NK alogénicas, las células NK de donantes sanos se preparan por
ex vivo
expansión y activación, y luego se administran a pacientes con cáncer [10]. Las células NK alogénicas de donantes sanos son superiores a las células NK autólogas de pacientes con cáncer, que quedan funcionalmente deteriorados durante la progresión tumoral [11], [12]. Además, la eficacia antitumoral de las células NK alogénicas se ve reforzada a través de la incompatibilidad entre donante y receptor KIR y MHC de clase I ligandos [13].
Con el fin de permitir el uso terapéutico de las células NK alogénicas en el ámbito clínico , se debe obtener un número suficiente de células NK altamente enriquecido. Se han reportado varios métodos para
ex vivo
la expansión de células NK con grado clínico [14]. Aunque las células NK diferenciadas a partir de sangre del cordón umbilical [15] o las células NK-92 [16] se han utilizado para la terapia, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recogidas de sangre entera o leucoféresis se utilizan como fuentes generales de las células NK [17], [18]. Debido a la ventaja de recolección aséptica en un sistema cerrado, PBMC colección por leucaféresis se ha utilizado comúnmente para las buenas prácticas de fabricación (GMP) según norma expansión de las células NK [14]. El proceso de expansión general de aplicación alogénico comienza con dos etapas secuenciales de agotamiento magnético de CD3 + células T
y enriquecimiento de CD56
+ NK células [19] - [21]. Con el fin de estimular la proliferación de células NK, irradiado células alimentadoras tales como PBMCs [19], Epstein-Barr líneas de células linfoblastoides transformadas por el virus (EBV-LCLs) [20] o líneas de células leucémicas de ingeniería [21] se utilizan a menudo. células alimentadoras irradiadas estimulan las células NK a través de ambos factores humorales y el contacto directo de célula a célula [22].
En el presente estudio, se estableció un método simplificado y eficiente para la expansión a gran escala y la activación de NK las células de los voluntarios sanos en condiciones GMP. Después de una sola etapa de agotamiento magnético de CD3
+ células T, las PBMCs agotados fueron estimuladas y expandidas con PBMCs autólogas irradiadas en presencia de OKT3 e IL-2 durante 14 días, lo que resulta en una población altamente pura de CD3
-CD16
+ CD56
+ células NK que se desee para el propósito alogénico. Estas células mostraron potente citotoxicidad contra las células tumorales
in vitro
, mientras que ahorra las células no tumorales alogénicas. Ellos eficientemente controlados progresión tumoral en un modelo de ratón SCID de linfoma humano. En su conjunto, las células NK alogénicas se ampliaron de manera eficiente en un centro de GMP y demostraron una actividad antitumoral potente tanto
in vitro Opiniones y
in vivo.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todas las muestras de estudio se obtuvieron después de la adquisición del consentimiento informado por escrito de los participantes en el estudio, de acuerdo con la declaración de Helsinki. Este protocolo de investigación fue revisado y aprobado por la junta de revisión institucional del Hospital de la Universidad Nacional de Seúl (Número de Permiso: H-1004-027-315).
Preparación de las células NK y la expansión
PBMCs se aislaron de donantes sanos por leucoféresis. CD3
+ células T se agotaron por VarioMACS (Miltenyi Biotec, Alemania). PBMCs sin células T se expandieron a una concentración de siembra de 2 × 10
5 células /ml en CellGro SCGM medio libre de suero (CellGenix, Alemania) con 1% de auto-plasma, 1 × 10
6 células /ml irradiadas (2.000 rad) PBMCs autólogas, 10 ng /ml de anti-CD3 OKT3 anticuerpo monoclonal (Orthoclon, Suiza) y 500 UI /ml de IL-2 (Proleukin, Suiza) en una bolsa de cultivo a-350N (NIPRO, Japón). OKT3 se complementó sólo una vez al comienzo de la expansión para estimular la población de células T en las células alimentadoras irradiadas. Las células NK fueron alimentados con medio fresco con 500 UI /ml de IL-2 cada dos días sin eliminación de medio de cultivo preexistente para mantener la concentración celular en 1~2 × 10
6 células /ml durante 14 días. La viabilidad de las células NK expandido se evaluó por tinción de yoduro de propidio. La expansión de las células NK se realizó bajo las condiciones de GMP en la Cruz Verde LabCell Corp. (Corea).
líneas celulares humanas
K562, células Jurkat, SW480, Ramos y Raji se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC). SNU398 células se obtuvieron a partir de la célula de Corea Línea de banco (KCLB). Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (GIBCO) suplementado con suero bovino fetal al 10% (GIBCO). Todas las líneas celulares se mantuvieron en fase de crecimiento logarítmico a 37 ° C en una atmósfera humidificada suplementada con 5% de CO
2.
inmunotinción
y análisis de citometría de flujo de células
NK se tiñeron con el anticuerpos monoclonales apropiados de la siguiente manera: anti-CD56-PE-Cy5 (B159), anti-CD3-FITC (UCHT1), anti-NKp30-PE (P30-15), anti-NKp44-PE (P44-8.1), anti- NKp46-PE (9E2 /NKp46), anti-DNAM-1-PE (DX11), anti-CD25-PE (M-A251), anti-CD158b-FITC (CH-L) (todos de BD Biosciences), anti- (; D systems todo desde amp I +), anti-CD158a-APC (EB6B) NKG2A-PE (131411), anti-NKG2C-PE (134591), anti-NKG2D-PE (149810), anti-CD69-PE (298614) , anti-CD158e-PE (Z27.3.7) (todos de Beckman Coulter), anti-CD56-APC-eFluor®780 (CMSSB), y anti-CD62L-PE (DREG-56) (todos de eBioscience). Para las líneas de células tumorales, anti-HLA de clase I-PE (G46-2.6) y anti-MIC-A /B-PE (6D4) se compraron de BD Biosciences, anti-ULBP-1-PE (170818) y anti- ULBP-2-PE (165903) se adquirieron de R & amp; D systems y anti-CD112-PE (TX31) y anti-CD155-PE (SKII.4) fueron adquiridos de BioLegend. Las muestras se adquirieron en un uso de software FlowJo BD FACS se analizaron Canto II o LSR Fortessa y datos (TreeStar Inc., O).
intracelular de citoquinas y CD107a tinción
p>
ensayo de liberación de 51Cr citotoxicidad
Un estándar 4 h
se realizó ensayo de citotoxicidad de liberación de 51Cr. Las células diana se marcaron con 100 Ci de
cromato de sodio 51Cr (BMS), y se incubaron con las células NK en tres proporciones diferentes E:T en fondo en U placas de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca). La liberación espontánea y la liberación máxima se determinaron mediante la incubación de células diana sin efectores en medio solo o en 4% de Triton X-100, respectivamente. El ensayo se realizó por triplicado. La radiactividad se contó en un contador gamma y se determinó el porcentaje de lisis específica según la fórmula:% de lisis específica = [(media de cpm experimental liberación media de liberación cpm espontánea) /(media de liberación de cpm espontánea liberación media cpm máxima)] × 100. Para experimentos de bloqueo, las células NK se pre-incubaron con 10 mg /ml anti-ratón IgG1k (MOPC-21; BD Biosciences), 10 mg /ml anti-DNAM-1 (DX11; BD Biosciences), 2 mg /ml anti- NKG2D (149.810; R & amp; D Systems), 2 mg /ml anti-NKp30 (P30-15; BioLegend) o 10 mg /ml anti-NKp44 (P44-8; BioLegend) durante 30 min a 4 ° C, y
ensayo de liberación de 51Cr se realizó contra SW480 y SNU398 en relación E:T de 10:01. La inhibición de la matanza se calculó como un porcentaje de la inhibición por el anticuerpo de control de isotipo.
Flow citotoxicidad de citometría de ensayo
La citotoxicidad de las células NK expandido contra PBMC alogénicas se evaluó mediante el ensayo de citotoxicidad de citometría de flujo. células diana tumorales K562 se marcaron con 100 nM de calceína-AM (Molecular Probes, Eugene, OR), y células alogénicas o autólogas de destino PBMC se marcaron con células NK expandidas anti-HLA de clase I, las células diana K562 marcadas, y se marcaron PBMC células diana se cocultivaron en la proporción de 03:01:01 durante 2 h. Las células muertas se tiñeron con 7-AAD (BD Biosciences). El porcentaje de lisis específica se determinó de acuerdo con la fórmula:% de lisis específica = (% medio de 7-AAD
+ células en los pocillos con NK co-cultivo) - (% medio de 7-AAD
+ células teñidas en pozos con el objetivo sólo)
en vivo
estudio en ratones SCID
CB-17-Prkdc
ratones SCID (Centro de Recursos animales, Australia) se utilizaron a las 7 semanas de edad. ratones SCID fueron alojados en jaulas microisolator, y toda la comida, agua, ropa de cama y se trataron en autoclave antes de su uso. células NK expandidas se marcaron con 5 M CFSE (Sigma), y 2 × 10
7 de las células marcadas con CFSE se inyectan en forma intravenosa cada ratón. Los ratones se sacrificaron a las 2, 24, 48, 72 y 168 h bajo anestesia general. suspensiones de células individuales se prepararon a partir principales órganos como los pulmones, el bazo, sangre periférica, hígado, ganglios linfáticos, médula ósea, los riñones, los ovarios, los testículos y el cerebro. El porcentaje de CFSE
+ células se analizó en lymphogating por citometría de flujo análisis de las suspensiones de células individuales a partir de muestras en serie. Para evaluar la eficacia antitumoral de las células NK expandido, CB-17-Prkdc
ratones SCID se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola con 1 x 10
5 células Raji y 1 × 10
7 expandido células NK en 400 l de PBS el día 0. Tres dosis adicionales de las células NK expandido (1 × 10
7cells /ratón) se administraron dentro de los nueve días. El anticuerpo monoclonal anti-CD20, rituximab (0,01 mg /ratón) se inyectó por vía subcutánea en el momento de la primera administración de células NK expandido. ratones individuales se controlaron diariamente para la morbilidad y la mortalidad asociada a tumor. En particular, se observó la postura anormal de las extremidades posteriores resultantes de una incapacidad para extender las extremidades traseras. Cuando los ratones muestran signos de morbilidad asociada al tumor, como la pérdida excesiva de peso, letargo y /o la angustia, que se sometieron a eutanasia de acuerdo con las directrices institucionales de cuidado animal. La anestesia general fue inducida por una inyección intramuscular de 100 mg /kg de ketamina (Yuhan, Corea) y 12,5 mg /kg de xilazina (Rompun, Bayer). Alojamiento de animales, la manipulación, y todos los procedimientos que implican ratones fueron aprobados por el comité institucional de Mogam Biotecnología Instituto de Investigación (Permiso Número: MG-10-111A), y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales que regulan el cuidado de los animales en Corea
El análisis estadístico
se utilizó la prueba t de Student no pareado para comparar la citotoxicidad y la secreción de citoquinas de las células NK antes y después de la expansión. Se utilizó la prueba t de Student pareado La comparar la expresión de marcadores de superficie de las células NK antes y después de la expansión. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA).
Resultados
Características de gran escala, células NK-GMP ampliado
En el presente estudio, se expandió de manera eficiente las células NK de donantes sanos mediante el cultivo de PBMC agotado de células-T y PBMC autólogas irradiadas en presencia de IL-2 y OKT3 durante 14 días en un centro de GMP. El día 14, los productos, llamados MG4101, estaban compuestos de células CD3 altamente enriquecido
-CD56
+ (98,10 ± 0,88%) o CD56
+ CD16
+ (97,43 ± 1,66%) las células NK con una contaminación mínima por CD3 células
+ T (0,06 ± 0,14%), CD14
+ monocitos (0,09 ± 0,14%) o CD19
+ células B (0,04 ± 0,07%) (Fig. 1A-B ). Durante el cultivo, las células NK se ampliaron 691,4 ± 170,2 veces (Fig. 1C) con 95.2 ± 1.9% de viabilidad (Fig. 1D). En los ensayos de citotoxicidad contra varias células tumorales, las células NK expandido ejercidas aumento de la actividad citolítica en comparación con las células NK recién aisladas (Fig. 1E). La potente actividad de las células NK expandido también se demostró por la desgranulación de CD107a marcador, y por la secreción de IFN-γ y TNF-α durante el cocultivo con células K562 (Fig. 1F).
(A-B) T- células PBMCs empobrecido se ampliaron en las condiciones GMP descritos en los Materiales y Métodos. El porcentaje de células CD3
-CD56
+, CD56
+ CD16
+, CD3
+, CD14
+ y CD19
+ células fueron analizadas por citometría de flujo análisis ( B, n = 8). representativos se presentan gráficos de puntos de FACS (A). (C) La expansión de plegado de las células NK se determinó antes (D0) y después (D14) la expansión de células NK (n = 8). (D) La viabilidad de las células NK expandido se evaluó por tinción de yoduro de propidio. (E) La citotoxicidad de las células NK contra diversas células tumorales se comparó antes (D0) y después (D14) la expansión de células NK (n = 4). La relación effector:target era 10:01. células (F) NK se cocultivaron con células K562 a una relación de 1:01 durante 4 h, y la tinción de citoquinas intracelulares (IFN-gamma y TNF-a) y CD107a se realizó como se describe en los Materiales y Métodos. Los datos se compararon antes (D0) y después de la expansión (D14). La media y SD se presentan. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01; ***
p
. & Lt; 0,001
células NK La expresión de los receptores de células NK en gran escala, se expandió-GMP
La expresión superficial de activar o inhibitoria receptores NK se analizó antes y después de la expansión a gran escala. Entre receptores activadores, NKG2C, NKp30 y NKp44 aumentaron significativamente durante la expansión, mientras que NKG2D, NKp46 y DNAM-1 no lo hicieron (Fig. 2A). La expresión de los receptores inhibitorios, NKG2A y KIR se mantuvo prácticamente sin cambios en la cultura, mientras que las proporciones de CD158a
+ b
+ e
+, CD158a
+ e
+ y CD158b
+ e
+ NK se redujeron las células (Fig. 2B). estado de activación de las células NK se evaluó por tinción para CD25, CD62L y CD69, todas las cuales resultaron ser aumentado en la superficie de las células NK expandido (Fig. 2C). También se evaluó la expresión de receptores de quimioquinas, tales como CXCR3 y CXCR4. La frecuencia de CXCR4
+ células NK se incrementó significativamente durante la expansión de las células NK, mientras que la frecuencia de CXCR3
+ células NK no se ha cambiado (Fig. 2D)
.
La expresión superficial de los receptores de activación (A ), receptores inhibidores (B), los marcadores de activación (C) y los receptores de quimioquinas (D) se analizó mediante citometría de flujo antes de (D0) y después (D14) la expansión de células NK (n = 10~12). Individuo o co-expresión de KIR (CD158a, CD158b o CD158e) se calculó mediante puertas booleanas utilizando el software FlowJo (B). *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01; ***
p
. & Lt; 0,001
La actividad citotóxica contra varias líneas de células tumorales
A continuación, se evaluó la actividad citotóxica de la población de células NK ampliado. Varias líneas de células tumorales muestran diferentes niveles de susceptibilidad a células NK expandido (Fig. 3A). Para entender esta variada susceptibilidad, la expresión de ligandos para los receptores de NK se analizó en las líneas celulares de tumor. De ellos se ensayaron para la expresión, los ligandos más relevantes fueron HLA de clase I, los ligandos de NKG2D; ligandos ULBP-1, ULBP-2 y MIC-A /B y DNAM-1; CD112 (Nectin-2) y CD155 (Necl5). La línea de células más susceptibles, K562, expresó ligandos de NKG2D, pero no el ligando KIR, HLA de clase I (Fig. 3B). Jurkat, SW480 y SNU398 células expresan ligandos de NKG2D no sólo, sino también de HLA de clase I, y fueron moderadamente susceptibles a las células NK expandido. células diana NK-sensibles (K562, Jurkat, SW480 y SNU398) tienden a sobre-expresan CD112 y CD155 en comparación con las células diana resistentes a NK (Ramos, Raji y PBMCs). Es de destacar que las células NK no mataron PBMCs alogénicos, que expresa HLA de clase I sin NKG2D y DNAM-1 ligandos (Fig. 3A y B).
(A) La citotoxicidad de las células NK expandido contra varias líneas de células tumorales fue analizada por
ensayo de liberación de 51Cr con la relación indicada effector:target (E:T) por triplicado. También se analizó la citotoxicidad contra PBMCs normales. El ensayo se realizó dos veces con células NK expandido de diferentes donantes, y se presentó datos representativos. Cada gráfico representa la media ± SD. (B) Expresión de HLA de clase I, ULBP-1, ULBP-2, MIC-A /B, CD112 y CD155 se analizó por citometría de flujo en varias líneas de células tumorales y PBMCs normales (líneas continuas). histogramas grises representan controles de isotipo. (C) las células NK expandidas se pre-incubaron con anticuerpos de bloqueo para DNAM-1, NKG2D, NKp30 y /o NKp44, y la citotoxicidad se analizó contra SW480 o SNU398 células por
ensayo de liberación de 51Cr por triplicado. E:T relación era 10:01. El porcentaje de inhibición de la citotoxicidad se calculó como un porcentaje de la inhibición por el anticuerpo de control de isotipo. El ensayo se realizó dos veces con células NK expandido de diferentes donantes, y se presentan datos representativos. Cada gráfico de barras representa la media + SD.
Para evaluar el papel de la activación de los receptores NK, un ensayo de citotoxicidad con células NK expandido se realizó en presencia de anticuerpos bloqueantes específicos de NKG2D, DNAM-1, NKp30 y NKp44. Si bien el bloqueo de un único receptor solo citotoxicidad ligeramente afectado, el bloqueo de múltiples receptores conducido a una reducción sustancial en la citotoxicidad. En particular, el bloqueo de los cuatro receptores de citotoxicidad inhibida en más de un 85% (Fig. 3C). Por lo tanto, la citotoxicidad de la población de células NK expandido se incrementa sinérgicamente por la activación simultánea a través de múltiples activación de los receptores NK.
Ausencia de actividad citotóxica contra células no tumorales alogénicas
El uso clínico de células NK expandido desde donantes sanos no relacionados pueden dar lugar a toxicidad debido a la actividad citotóxica frente a células receptoras transformadas alogénicos. Para evaluar el potencial de la citotoxicidad contra células receptoras normales, las células NK expandido se cocultivaron simultáneamente con células tumorales K562 y PBMCs alogénicos normales, y se evaluó la citotoxicidad contra cada objetivo respectivo. se encontró citotoxicidad contra las PBMCs alogénicos ser insignificante (0,43 ± 0,27%) (Fig. 4A) y comparable a la citotoxicidad contra las PBMCs autólogas (0,40 ± 0,40%) (Fig. 4B). Este mínimo citotoxicidad no se vio afectada por la presencia o ausencia de células tumorales K562. Mientras tanto, las células NK expandido murieron eficazmente células tumorales K562 independientemente de la presencia de alogénicas o autólogas PBMCs (Fig. 4A-B). Por lo tanto, las células NK expandido discriminados eficazmente las células tumorales de las PBMCs alogénicos normales y de forma selectiva las células transformadas muertos. La citotoxicidad específica de tumor sin matar de las células no tumorales alogénicas nos permitió aplicar las células NK expandido de donantes no relacionados y saludables en un entorno alogénico
.
citotoxicidad selectiva de las células NK expandido contra objetivos mixtos de PBMCs normales y células K562 se analizó por ensayo de citotoxicidad de citometría de flujo como se describe en los Materiales y Métodos. células diana tumorales K562 se marcaron con calceína-AM, y, o bien alogénico (A) o autólogas (B) células diana PBMC se marcaron con anti-HLA de clase I. Las células NK expandidas, las células diana K562 marcadas, y la PBMC marcado células diana se cocultivaron en la proporción de 03:01:01 durante 2 h. Las células muertas se tiñeron con 7-AAD, y el porcentaje se calculó la lisis específica. Citotoxicidad contra las PBMC (a la izquierda de cada panel) y células K562 (derecha de cada panel) se presenta por separado. El ensayo se realizó en duplicado. Cada gráfico de barras que representa la media ± SD.
actividad antitumoral in vivo de las células NK expandido en ratones SCID
En
in vivo
estudio de las células NK expandido, que administra marcadas con CFSE, células NK humanas expandido a ratones SCID y se controló la cinética de su distribución. Las células NK etiquetados aparecieron por primera vez en los pulmones, donde residían durante 48 horas, luego poco a poco desaparecieron (Fig. 5A). En el bazo, sangre periférica y el hígado, la frecuencia de las células NK administrados alcanzó su pico a las 48 horas y, a continuación disminuyó gradualmente (Fig. 5A). En la médula ósea, los ganglios linfáticos, el cerebro, los riñones, los ovarios y los testículos, la CFSE infusa
+ NK se detectaron células mínimamente (≤1.1%) (Tabla S1). Todos los ratones administrados por NK apareció sano similar al grupo de control durante el curso del estudio.
células NK CFSE marcado con (A) (2 × 10
7 células /ratón) se inyectaron por vía intravenosa en ratones SCID. Los ratones se sacrificaron a las 2, 24, 48, 72 y 168 h, y el porcentaje de CFSE células
+ en los pulmones, el bazo, sangre periférica y el hígado se analizó en lymphogating por citometría de flujo (n = 4). Cada gráfico representa la media ± SEM. (B-C) ratones SCID se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola con 1 x 10
5 células y Raji 1 × 10
7 expandieron las células NK en 400 l de PBS en el día 0 (n = 10 /grupo) . Tres dosis adicionales de las células NK expandido (1 × 10
7cells /ratón) se les administró un plazo de nueve días. El anticuerpo monoclonal anti-CD20, rituximab (0,01 mg /ratón) se inyectó por vía subcutánea en el momento de la primera administración de células NK expandido. parálisis Tumor-asociado (B) y la supervivencia (C) fueron monitoreados. La prueba de eficacia fue confirmada por conjunto adicional de experimento usando 10 ratones por cada grupo, y el conjunto representativo de los datos se presentan.
A continuación, la actividad anti-tumor de las células NK expandido se examinó en ratones SCID inyectados intravenosamente con células de linfoma de células B humanas Raji. La morbilidad fue evaluado por la parálisis pata trasera, como células Raji tienen tropismo de la médula espinal, y la mortalidad fue evaluada. Administración de las células NK humanas expandido abrogada significativamente la progresión del tumor, como se evidencia por la morbilidad reducida (Fig. 5B) y la mortalidad (Fig. 5C). La eficacia de las células NK humanas expandido se mejoró aún más por la co-administración de rituximab de dosis baja (0,01 mg /ratón), mientras que la misma dosis de rituximab sin células NK no mejoró los resultados de la enfermedad. Esta dosis de rituximab se considera que es extremadamente baja y es comparable a 1 /25.000 de la dosis habitual en los seres humanos [29]. En resumen, la ampliación de las células NK demostrado
actividad anti-tumor in vivo en un modelo de tumor de murino, y la adición de anticuerpo específico de tumor mejorado significativamente su eficacia, presumiblemente mediante la activación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Discusión
inmunoterapias de cáncer han utilizado varios tipos de células inmunes, incluyendo células dendríticas (DC), linfocitos T citotóxicos (CTL), asesino de células activadas por linfocinas (LAK), asesino inducida por citoquinas (CIK) las células y las células NK [23] - [26]. Aunque ha habido recientes avances en la terapia de DC y la terapia de CTL, la aplicación clínica es algo limitado ya que los antígenos del cáncer primero deben caracterizarse [23], [24]. En contraste, las células LAK, células CIK y células NK tienen actividad citolítica independiente de antígeno contra las células tumorales. Con frecuencia, las células LAK o células CIK se preparan de pacientes con cáncer y se administraron después de forma autóloga
ex vivo
manipulación [25], [26]. En el caso de las células NK, tanto alogénico y células NK autólogas se pueden utilizar para la terapia anti-cáncer. Trabajos anteriores han demostrado que las células NK alogénicas pueden administrarse con seguridad a pacientes con cáncer [10]. la terapia de células NK alogénico es particularmente beneficioso, ya que mejora la eficacia anti-cáncer de las células NK a través de la inducción de la incompatibilidad entre donantes y receptores KIR en células NK de donantes y MHC de clase I ligandos sobre los tejidos receptores [13].
en estudios anteriores, los diversos métodos de
ex vivo
la expansión de células NK han sido desarrollados para uso clínico [14]. PBMCs recogidos por leucoféresis se utilizan a menudo como una fuente general de las células NK, que tienen una ventaja de la recogida aséptica en un sistema cerrado [14]. El proceso de expansión general de aplicación alogénico comienza con dos etapas secuenciales de agotamiento magnético de CD3 + células T
y enriquecimiento de CD56
+ NK células [19] - [21]. En el presente estudio, sólo una única etapa de agotamiento magnético de células CD3
+ células T satisfizo la calidad del producto en el respeto de la pureza y la viabilidad. En día14, el producto final se compone de CD3 altamente pura
-CD56
+ células NK (98,10 ± 0,88%) con un mínimo de contaminación por células CD3
+ T (0,06 ± 0,14%), CD14
+ monocitos (0,09 ± 0,14%) o CD19
+ células B (0,04 ± 0,07%). Entre PBMCs agotado células T, las células NK se ampliaron selectivamente mientras que otras células, tales como células B y monocitos se convirtieron mínimamente detectable. Para la aplicación clínica alogénico, se desea la reducción de células T en el producto final para evitar la enfermedad de injerto contra huésped [10].
En estudios anteriores, varios intentos se trataron de estimular la proliferación de células NK con células alimentadoras irradiadas tales como PBMCs, EBV-LCLs o líneas de células leucémicas de ingeniería [19] - [21]. El presente procedimiento incluye PBMCs autólogas irradiadas suministrados con OKT3 en el comienzo de la expansión. células T OKT3 estimulada entre células alimentadoras irradiadas pueden estimular las células NK proliferación a través de ambos factores humorales y el contacto directo de célula a célula. Otros estudios están bajo investigación para esclarecer el papel funcional de células alimentadoras.
En el presente estudio, las células NK mostraron expandido robusta producción de citoquinas y la actividad citolítica potente contra varias líneas celulares de cáncer en comparación con las células NK recién aisladas. Estas células sobreexpresan NKG2C, NKp30, NKp44, y marcadores de activación incluyendo CD25, CD62L y CD69. Es de destacar que las células NK expandido mataron de forma selectiva las células cancerosas sin citotoxicidad frente a células no tumorales alogénicas en ensayos de cocultivo. Esta actividad citotóxica de las células NK dirigida expandido sugirió que la aplicación alogénico de células NK expandido en pacientes de cáncer sería seguro. De hecho, no hay efectos secundarios significativos se han observado en una fase continua que estudio utilizando células NK alogénicas expandidas (www.clinicaltrial.gov; NCT 01212341).
Con el fin de controlar la cinética de
in vivo
distribución, administramos CFSE-etiquetado, la ampliación de las células NK humanas a ratones SCID. Las células NK etiquetados aparecieron por primera vez en los pulmones, donde residían durante 48 horas, luego poco a poco desaparecieron (Fig. 5A). En el bazo, sangre periférica y el hígado, la frecuencia de las células NK administrados alcanzó su pico a las 48 horas y, a continuación disminuyó gradualmente (Fig. 5A). Mientras tanto, también se estudió la expresión de receptores de quimioquinas como CXCR3 y CXCR4 en las células NK expandido.