Extracto
El objetivo de este estudio es determinar la frecuencia genética de GNAS la activación de mutaciones en el cáncer colorrectal y la patología correspondiente de GNAS tumores mutantes. mutaciones oncogénicas en GNAS se han descrito en una serie de neoplasias, incluyendo las de la pituitaria, riñón, páncreas, y, más recientemente, en el cáncer de colon. Para determinar la frecuencia en el cáncer de colon que empleó una plataforma de pirosecuenciación sensible para la detección de mutaciones del R201C y puntos de acceso R201H GNAS en muestras de tumores que representan todas las etapas clínicas. Estamos, además, se ensayaron para mutaciones KRAS y BRAF como los informes anteriores han demostrado que estos a menudo co-ocurren con mutaciones activadoras GNAS. De los 428 tumores de colon ensayados, las mutaciones en GNAS estaban presentes en 10 de las muestras (2,3%), lo que indica que esto es una mutación significativa, aunque infrecuente, en los tumores colorrectales. Nueve GNAS tumores mutantes (90%) albergaban mutaciones activantes concomitantes ya sea en el KRAS o BRAF oncogén, que fue significativamente mayor que la frecuencia de mutación de estos genes en la población tumor (56%, p & lt; 0,0305). Los diez de los tumores mutantes GNAS surgió en la derecha (proximal) del colon (p & lt; 0,007), y 7 de 8 casos examinados mostraron una morfología de las vellosidades marcada. Tomados en conjunto, estos datos indican que los tumores de colon mutante GNAS comúnmente tienen mutaciones en KRAS síncronos o BRAF, son, del lado derecho en la ubicación, y se asocian con una morfología de las vellosidades
Visto:. Fecteau RE, Lutterbaugh J, Markowitz SD, Willis J, K Guda (2014) GNAS mutaciones identificar un conjunto de lado derecho, ras mutante, vellosos los cánceres de colon. PLoS ONE 9 (1): e87966. doi: 10.1371 /journal.pone.0087966
Editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de octubre de 2013; Aceptado: 31 de diciembre de 2013; Publicado: 30 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Fecteau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio con el apoyo de las subvenciones PHS 1P50CA150964 (SDM, JW, KG), CA148980 (KG), P30CA43703, T32GM007250 (REF) y CA059366 (REF) y por los regalos de la Fundación Marguerite Wilson (SDM), el Leonard y Fundación Joan Horvitz (SDM ). la Fundación Richard Horvitz y Erica Hartman-Horvitz (SDM), y la Alianza Nacional de Investigación del Cáncer Colorrectal (SDM) Los donantes no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
tumorigénesis colorrectal se caracteriza por una sucesión de aberraciones genéticas que transforman el epitelio normal del colon en un cáncer invasivo [ ,,,0],1]. Hemos definido previamente un conjunto de 140 genes que se someten a mutación somática recurrente en el cáncer colorrectal (CCR), lo que sugiere que son probables causas de la progresión del tumor [2], [3]. Uno de estos genes era GNAS, en la que encontramos mutaciones recurrentes en el codón 201, que alteró la Arg altamente conservada
201 a cualquiera de cisteína (R201C) o histidina (R201H) [2], [3]. GNAS es un oncogén conocido que fue descrito por primera vez en la hormona del crecimiento de la pituitaria secretora de adenomas y desde entonces ha sido encontrado para ser mutado en una serie de neoplasias, predominantemente en el punto de acceso codón 201 [4] - [7]. GNAS codón 201 mutaciones son particularmente frecuentes en las neoplasias mucinosos intrapapilar (TPMI) del páncreas donde el 67% de los casos son mutante [8]. El producto principal de la locus GNAS, la subunidad Gsα de proteínas G heterotriméricas, actúa para transducir señales de proteína G recptors acoplados (GPCR) a la enzima adenilato ciclasa efector en la vía de G-estimuladoras (Gs), lo que lleva a la producción de AMP cíclico (cAMP). Ambas mutaciones R201C y R201H producen la activación constitutiva de Gsα y la producción de cAMP autónoma [9], [10].
En IPMNs, mutaciones GNAS son frecuentemente acompañadas de mutaciones de KRAS, con un 51% de los casos GNAS mutantes también que llevan mutaciones en KRAS [8]. La activación de mutaciones en KRAS, y en menor medida, su efector aguas abajo BRAF, son eventos frecuentes en el cáncer de colon. Por otra parte, la secuenciación del exoma completo de las muestras de cáncer colorrectal por nuestro grupo y colaboradores revelaron coincidentes mutaciones GNAS y KRAS en una pequeña cohorte de tumores de colon, lo que indica mutaciones GNAS en los cánceres de colon podrían también suelen ir acompañados de mutaciones en KRAS y /o BRAF [2] .
frecuencias notificadas de GNAS mutaciones activadoras en el CCR se han diferenciado entre los diversos grupos, que van desde tan poco como 0,5% a 9% [2], [11] - [13]. En el presente estudio, hemos empleado una plataforma de pirosecuenciación sensible a secuenciar el punto caliente mutacional de codones R201 en una cohorte de 428 tumores de colon esporádicos para determinar una frecuencia más precisa en el CCR. También ensayamos para las mutaciones en KRAS y BRAF para determinar la prevalencia de la coincidentes GNAS /o mutaciones de KRAS GNAS /BRAF en nuestra cohorte de tumores. Los datos clínicos y patológicos fue revisado para determinar si los tumores mutantes GNAS están asociados con ningún fenotipos clínicos o morfológicas únicas. Aquí nos muestran que los tumores de colon mutante GNAS albergan KRAS recurrentes o mutaciones de BRAF, el objetivo de los extremos proximal anatómica "-del lado derecho" de colon, y exhiben una morfología de las vellosidades.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el protocolo de acumulación de muestras de tumores titulado, "CWRU 7296: Colón epitelial Banco de Tejidos", fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico de los Hospitales universitarios de Investigación del caso humano con el número asignado UH IRB 03-94-105. Bajo este protocolo, se obtuvo tejido desechado a través del consentimiento informado por escrito de los pacientes para su uso en investigación.
Las muestras tumorales
Tumor especímenes fueron obtenidos de un archivo congelado que consistía en 428 cánceres colorrectales no seleccionados y sin familia informado la historia (en adelante, los adenocarcinomas colorrectales esporádicos) devengados según el protocolo anterior. Los datos clínicos se obtuvieron y se montan a través de los informes de casos individuales para cada patología tumoral. opinión microscópico de la morfología del tumor de muestras seleccionadas fue realizado por un anatomopatólogo (J.W). Todas las muestras se ensayaron para determinar mutaciones en el codón 201 GNAS, KRAS codones 12, 13, 61, y 146, y BRAF codón 600 usando tanto la secuenciación de Sanger y pirosecuenciación.
extracción de ADN y pruebas de MSI
extracción de ADN genómico de muestras de tumores se realizó utilizando un protocolo estándar de tiocianato de guanidina [14] o la sangre DNeasy Tissue Kit y (QIAGEN). Se llevó a cabo la prueba del estado de MSI en BAT26 y BAT40 loci genómicos como se describe anteriormente [15].
pirosecuenciación
Análisis de pirosecuenciación GNAS codón 201 se realizó en todas las muestras. ensayos de Pyrosequencing fueron diseñados utilizando el software PSQ Ensayo de Diseño (QIAGEN, Chatsworth, CA) que incluía GNAS codón 201, los codones KRAS 12 y 13, KRAS codón 61, KRAS codón 146, y BRAF codón 600. Para cada ensayo, una de las PCR cebadores se biotina en el extremo 5 'y se purificaron usando cromatografía líquida de alta resolución. Las secuencias de cebador son los siguientes. GNAS: Para: 5'-biotina-TTGGCTTTGGTGAGATCCATTG-3 ', 5'-Rev CACCTGGAACTTGGTCTCAAAGAT-3', 5'-Sec TTCCAGAAGTCAGGACA-3 '; KRAS codones 12 y 13: Para 5'TCGATGGAGGAGTTTGTAAATGA-3 ', 5'-biotina-Rev TTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3', 5'-Sec CTTGTGGTAGTTGGAGC-3 '; KRAS codón 61: 5'Para CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCA-3 ', 5'-biotina-Rev TCCTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3', 5'-Sec ATATTCTCGACACAGCAG-3 '; KRAS codón 146: Para 5'-AGGCTCAGGACTTAGCAAGAAGTT-3 ', 5' Rev-biotina-GCCCTCTCAAGAGACAAAAACAT-3 ', 5'-Sec AATTCCTTTTATTGAAACAT-3'. BRAF codón 600: Para 5'TTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA-3 ', 5'-biotina-Rev CCACAAAATGGATCCAGACA-3', 5'-Sec TGATTTTGGTCTAGCTACA-3 '. Todas las reacciones de PCR se realizaron con Taq FastStart (Roche) y las concentraciones de cebadores de 0,2 uM. Ciclismo condiciones incluían un primer paso de desnaturalización a 95ºC durante 4 min y 49 ciclos de 95ºC durante 15 s, 54ºC durante 30 s, y 72ºC durante 20 s. Tras la PCR, los productos de amplificación fueron secuenciados en un instrumento de pirosecuenciación PyroMark MD (QIAGEN) y se realizó el análisis de mutación como se describe anteriormente [16].
secuenciación Sanger
secuenciación de Sanger se utilizó para confirmar todas las mutaciones detectado por pirosecuenciación análisis. se utilizó ADN genómico aislado de muestras de tumor para la amplificación PCR de las regiones que abarcan el codón 201 de GNAS, los codones 12, 13, 61, y 146 de KRAS, y el codón 600 de BRAF. Adelante y atrás primers utilizados para la amplificación PCR fueron marcadas con un 'M13 hacia adelante (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' 5) y 5 'M13 inverso (5' CAGGAAACAGCTATGAC-3 ') secuencia de cebador universal, respectivamente. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes. GNAS: Para 5'GTTGGCAAATTGATGTGAGC-3 ', 5'-Rev CCCTGATCCCTAACAACACAG-3'; KRAS codones 12 y 13: Para 5'-TGGTGGAGTATTTGATAGTGTA-3 ', 5'-Rev CATGAAAATGGTCAGAGAA-3'; KRAS codón 61: 5'Para TCCAGACTGTGTTTCTCCCT-3 ', 5'-Rev AACCCACCTATAATGGTGAATATCT-3'; KRAS codón 146: Para 5'-AGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3 ', 5'-Rev GGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3' BRAF codón 600: Para 5'TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3 ', 5'-Rev GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'. Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando 0,4 uM concentración de cada cebador y FastStart Taq polimerasa (Roche, Indianapolis, IN). Las condiciones de ciclación para todas las parejas de cebadores consistieron en una desnaturalización inicial a 95 C durante 4 minutos seguido de 39 ciclos de 95 C durante 30 s, 58 C durante 30 s, 72 C durante 30 s, y una elongación final a 72 C durante 3 min .
Análisis estadístico
se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar las diferencias en la proporción de tumores mutantes GNAS entre las clases de sexo, origen étnico, estado de KRAS /BRAF, el estado de la estabilidad de microsatélites, estadio clínico, y la localización del tumor. Un valor de p de dos colas de menos de 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Frecuencia de GNAS Hotspot Las mutaciones en el cáncer colorrectal
Pyrosequencing detectado mutaciones activadoras de GNAS codón 201 en diez de los adenocarcinomas colorrectales 428 (2,3%) (Tabla 1). Cada una de estas mutaciones también se validó utilizando secuenciación de Sanger (Fig. 1). De los diez GNAS codón 201 mutaciones detectadas, se identificaron siete p.R201H y tres sustituciones de aminoácidos p.R201C, todos los cuales eran mutuamente excluyentes (Tabla 2). Siete de estas mutaciones detectadas surgieron entre los tumores estables 377 microsatélites analizados (1,9%), y tres se levantaron entre los 41 tumores con inestabilidad de microsatélites (7,7%). El aumento de la frecuencia de mutaciones en tumores GNAS inestables microsatélites fue de significación estadística marginal (p = 0,065). La frecuencia de mutación en el codón 201 de 0,0063 por par de bases diploide es significativamente mayor que la tasa de mutación de fondo de 1,2 × 10
-6 mutaciones por par de bases que caracteriza a los cánceres de colon de microsatélites estables (P = 3E (-36)) [3 ].
cromatogramas representativos (izquierda) y pirogramas (derecha) de GNAS de tipo salvaje, GNAS R201C, y las mutaciones R201H GNAS detectado en el cáncer de colon. Las flechas en cromatogramas muestran, picos heterocigotos mutantes. picos en caja en pirogramas destacan alelos mutantes. Los porcentajes indican las frecuencias alélicas calculadas a partir de las intensidades de pico pyrogram.
GNAS mutaciones están asociadas con una morfología de las vellosidades
Evaluación patológica de los tumores GNAS mutantes revelaron una morfología de las vellosidades prominente en siete de las ocho (88%) casos disponibles para su revisión. En cinco de estos casos, los cánceres mutantes GNAS surgieron en un adenoma velloso contigua. En dos de estos casos, los cánceres sí mismos demostraron una arquitectura de las vellosidades muy inusual (Figura 2). adenomas vellosos son un subtipo de pólipo adenomatoso, que representa aproximadamente el 5-15% de los adenomas [17]. cánceres vellosos, sin embargo, actualmente no están reconocidos como una sub-clasificación específica de CRC, aunque los estudios sugieren que los adenocarcinomas de las vellosidades puede dar cuenta de aproximadamente el 9% de los casos de CCR [18], [19]. Nuestros resultados indican que GNAS tumores mutantes surgen cerca exclusivamente en asociación con la morfología de las vellosidades presente ya sea en el cáncer o el adenoma antecedente
H & amp;. E Fotomicrografía de un mutante GNAS, adenocarcinoma de las vellosidades. El tumor tiene la morfología de las vellosidades que sobresalen típico con papilas contienen un núcleo fibrovascular y forrado con epitelio adenomatoso.
Un estudio reciente realizado por Yamada y sus colegas detectaron GNAS codón 201 mutaciones de punto de acceso en el 83% adenomas vellosos del colon y el recto entre los pacientes japoneses [13]. De acuerdo con ello hemos ampliado nuestro análisis de la mutación de un pequeño panel de vellosidades, y adenomas tubulares túbulovelloso para determinar la frecuencia de mutaciones GNAS en una cohorte adenoma occidental (Tabla 3). En general, encontramos GNAS codón 201 mutaciones en el 46% (6/13) de los adenomas vellosos y en el 15% (3/20) de los adenomas túbulo, y en ningún adenomas tubulares. Por lo tanto GNAS mutaciones en adenomas surgen exclusivamente en el contexto de la morfología de las vellosidades. Sin embargo, en la población occidental se caracterizó encontramos que los adenomas vellosos dividen molecularmente en dos grupos de tamaño aproximadamente iguales, uno del grupo compuesto por adenomas vellosos que surgen a través de la vía de mutación GNAS, y el otro conjunto de adenomas vellosos que surgen a través de una vía alternativa.
GNAS CRC mutantes son predominantemente KRAS /BRAF mutante y situado en el colon proximal
Entre IPMNs, mutaciones GNAS son con frecuencia co-acompañadas de mutaciones de KRAS. Entre GNAS cánceres de colon mutantes, se identificaron mutaciones en los oncogenes KRAS y BRAF en nueve de los diez (90%) casos, una fracción que es significativamente mayor que la frecuencia global de mutaciones de KRAS y BRAF en la cohorte de tumor (P & lt; 0,0305, la prueba exacta de Fisher). La frecuencia global de mutaciones de KRAS y BRAF en nuestra población tumor fue de aproximadamente 56% (44% KRAS, 12% BRAF), que está de acuerdo con estudios anteriores [20]. Cuando se examina para la localización anatómica dentro del colon, se encontró que los diez muestras mutantes GNAS que se derivan de cánceres primarios que se originaron en el colon proximal, entre el ciego y el ángulo esplénico del colon, lesiones comúnmente referidos como del lado derecho (P & lt; 0,007, Fisher La prueba exacta). Incluido en nuestra cohorte de tumores eran ambos microsatélites estables (MSS) y los tumores de colon microsatélites inestables (MSI), con MSI casos que surgen predominantemente en el lado derecho. Debido a tres tumores mutantes GNAS eran también tumores MSI, es posible que incluyendo cánceres MSI sesga la asociación de mutaciones GNAS con el colon proximal. Sin embargo, cuando todos los cánceres MSI se excluyen del análisis, la asociación de los cánceres GNAS positivas con el colon proximal sigue siendo significativa (P & lt; 0,044)
Es interesante observar que, si bien todos los cánceres mutantes GNAS estaban del lado derecho , se encontraron GNAS adenomas mutantes en todo el colon (Tabla 4). No se observaron diferencias significativas en los tumores mutantes GNAS cuando se analizaron por género, etnia, estadio clínico, o estado de los microsatélites.
Discusión
En este estudio se encontró que las mutaciones se asocian con un GNAS distinta subclase de los cánceres de colon que se caracteriza por la localización en el colon proximal, por tener KRAS coincidente o mutación BRAF, y por asociación con la morfología de las vellosidades. Aunque la frecuencia de los cánceres de colon GNAS mutante es 2,3%, encontramos estos tumores constituyen una subclase molecular-patológica distinta de cáncer de colon. A nuestro entender, este análisis de 428 tuomrs de colon es el más extenso análisis de estas mutaciones que se ha hecho. La frecuencia de 2.3% de las mutaciones GNAS en esta cohorte, es superior a la reportada en último lugar por Idziaszczyk y sus colegas en 2010, aunque menos que la observada inicialmente en un pequeño estudio anterior por nosotros y colaboradores [2]. Curiosamente, GNAS cánceres mutantes no se encuentran en el colon distal, mientras que surgen GNAS adenomas vellosos mutantes en todo el colon, aumentando la posibilidad de que GNAS adenomas mutantes progresan más rápidamente con el cáncer en el colon proximal o son más propensos a ser sintomático y detectan cuando se encuentra en el colon distal. Estas preguntas deben ser abordados más experimental para distinguir entre estas dos posibilidades.