Extracto
Antecedentes
Nuestros estudios anteriores mostraron una baja regulación de GRIM-19 en cánceres primarios humanos de cuello uterino, y la restauración de GRIM-19 regresión tumoral inducida. La inducción de la proteína supresora de tumores p53 ubiquitinación y degradación por E6 oncoportein de alto riesgo-HPV mediante la formación de un complejo estable con E6AP se considera como un mecanismo crítico para el desarrollo del tumor cervical. Los objetivos de este estudio fueron determinar el papel potencial de GRIM-19 en el rescate de la proteína p53 y la inducción de la apoptosis de células de cáncer de cuello uterino.
Metodología /Principales conclusiones
Los niveles de proteína de GRIM-19 y p53 se detectaron en tejidos cervicales normales de 45 pacientes que se sometieron a histerectomía por causas distintas de las neoplasias de cualquiera de cuello del útero o endometrio, cáncer de cuello uterino y de los tejidos de 60 pacientes con carcinomas epiteliales escamosas no metastásicos. Coimmunoprecipitation y desplegable ensayo GST se realizaron para examinar la interacción de GRIM-19 con 18E6 y E6AP
in vivo e in vitro
respectivamente. La competición de 18E6 con E6AP en la unión GRIM-19 mediante la realización de ensayos de pull-down de competencia se diseñó para examinar la interrupción del complejo E6 /E6AP por GRIM-19. El augment de E6AP ubiquitinación por GRIM-19 se detectó en vivo y en el ensayo de ubiquitinación vitro. Los efectos de GRIM-19 dependiente de la acumulación de p53 en la proliferación celular, ciclo celular, la apoptosis se exploró por MTT, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, respectivamente. La supresión del tumor fue detectado por el modelo de xenoinjerto de ratón.
Conclusión /Importancia
Los niveles de GRIM-19 y p53 fueron regulados simultáneamente en los cánceres de cuello uterino. La restauración de GRIM-19 puede inducir la ubiquitinación y degradación de E6AP, e interrumpir el complejo /E6AP E6 a través de la interacción de N-terminal de GRIM-19 tanto con E6 y E6AP, que protege de la degradación de p53 y promover la apoptosis celular. estudios de tumores de xenoinjerto también revelaron la supresión de la degradación de p53 en presencia de GRIM-19. Estos datos sugieren que GRIM-19 puede bloquear complejo /E6AP E6; y sinérgicamente suprimir el crecimiento tumoral cervical con p53
Visto:. Zhou Y, Wei Y, Zhu J, Wang Q, Bao L, Ma Y, et al. (2011) GRIM-19 Interfiere E6 /E6AP Complejo para rescatar p53 e inducir la apoptosis en el cáncer de cuello uterino. PLoS ONE 6 (7): e22065. doi: 10.1371 /journal.pone.0022065
Editor: Scott A. Coonrod, Universidad de Cornell, Estados Unidos de América
Recibido: 18 de abril de 2011; Aceptado: June 14, 2011; Publicado: 12 de julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (973 programas): 2007CB914503 http://www.973.gov.cn, Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81071683, 81001168 81072127 91029710 y) http: //www.nsfc .gov.cn, "XI Programa Quinquenal" Programa Nacional de Apoyo a la Tecnología (2008BAI57B03) http://kjzc.jhgl.org, Institutos nacionales de Salud subvenciones CA105005, CA78282 y CA134274-P30 http://grants.nih.gov. proyecto de la Fundación Provincial de Anhui de Ciencias Naturales (20090413117, 11040606M178) http://www.ahkjt.gov.cn y Provincial de Proyectos de Investigación de Ciencias Naturales de Anhui Provincial de Educación Superior Universidad (KJ2010B375) http://www.ahedu.gov.cn/. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los virus del papiloma humano de alto riesgo (HR-HPV), como HPV18 y HPV16, no sólo es una causa importante de cáncer de cuello uterino [1], sino también a los agentes patógenos de un subconjunto de otros tumores como cabeza y escamosas del cuello carcinomas [2], cáncer de pulmón [3] cáncer del tracto digestivo superior [4] y el cáncer anogenital [5]. La expresión de oncoproteínas virales E6 en carcinomas de cuello uterino VPH-positivo [6] puede interactuar con la proteína asociada a E6 (E6AP) para formar complejo /E6AP E6 que induce específicamente a la ubiquitinación y la degradación rápida de la p53, factor de transcripción nuclear X-box vinculante 91 (NFX1-91) y PDZ dominio que contienen proteínas a través de la vía del proteasoma [7], [8], [9], [10]. la degradación de p53 es un requisito esencial para la supervivencia de los tumores VPH-AR-infectados; bloqueando así E6 E6AP complejo de la degradación /mediador de p53 puede ser un enfoque atractivo para el tratamiento de los cánceres con la infección por VPH-AR [11], [12], [13], [14].
GRIM-19 fue originalmente identificado como una proteína supresora tumoral que estuvo involucrado en la muerte celular [15] a través de la asociación y la supresión de STAT3 [16], [17]; Su expresión está regulada en el renal, de próstata y de cuello uterino [16], [17], [18], [19], [20]. Por otra parte, GRIM-19 suprime la remodelación inducida por oncogenes de citoesqueleto y la motilidad celular [21]; y la progresión del ciclo celular mediante la interacción con supresor de tumor p16Ink4a [22]. Por lo tanto, GRIM-19 ejerce mecanismos diferentes en una variedad de tipos de células. Aquí mostramos que GRIM-19 induce la acumulación de p53 a través de una interrupción del complejo E6 /E6AP y una inducción de auto-ubiquitinación de E6AP en células de cáncer de cuello uterino. Este estudio demuestra una función novedosa y un mecanismo molecular por el cual GRIM-19 inhibe la tumorigénesis inducida por VPH-AR mediante la protección de la degradación de p53.
Resultados
GRIM-19 y p53 están regulados a la baja al mismo tiempo en cuello de útero cánceres
Nuestro estudio demostró que previamente GRIM-19 induce la regresión del tumor cervical en un modelo de xenoinjerto en ratones, lo que sugiere un posible papel de GRIM-19 en la regulación del crecimiento del tumor [20]. Desde supresor de tumores p53 también se expresa bajo en los tumores cervicales, se examinó adicionalmente si hay una correlación entre los niveles de GRIM-19 y p53. Los niveles de GRIM-19 y p53 fueron significativamente (
p
& lt; 0,01) más bajo en los tumores, y directamente correlacionados entre sí en & gt; 99% de los tumores de cuello uterino (Fig. 1). De acuerdo con una p53 bajo en los tumores, un gen diana p53 bien estudiado, PUMA, también se downregulated en los tumores en comparación con los tejidos normales (Fig. 1). Estos resultados demostraron que los niveles de GRIM-19 y p53 fueron suprimidos al mismo tiempo, lo que sugiere un posible vínculo entre GRIM-19 y p53 en el cáncer de cuello uterino.
(A) los extractos celulares totales (50 g) de los tumores cervicales primarias (T ) y los tejidos cervicales normales (N) se examinaron para la expresión de GRIM-19, p53 y PUMA por transferencia de Western. Se muestran los resultados representativos de transferencia Western. T1-T4 fue de los pacientes individuales con cáncer cervical. T1 y T2 fueron diagnosticados como fase IIa; y T3 y T4 fueron diagnosticados en estadio IA carcinomas epiteliales escamosas. (B) Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína, medido por la densidad óptica de cada banda. La relación de la densidad de GRIM-19, p53, PUMA sobre el GAPDH correspondiente se calculó (45 casos de tejido normal y 60 casos de tejido tumoral).
GRIM-19 aumenta los niveles de proteína p53 en células tumorales cervicales
Para investigar más a fondo la relación entre GRIM-19 y p53, las células HeLa con sobreexpresión (pG19) o desmontables (siG19) de GRIM-19 fueron utilizados, y los niveles de GRIM-19 y p53 se evaluaron mediante transferencia Western (Figura 2A). Curiosamente, cuando se compara con el control correspondiente (p /SiCon) células, p53 y sus genes diana PUMA y p21 aumentado en HeLa /células pG19 (Fig. 2A, paneles de la izquierda) y la disminución en HeLa /Células siG19 (Figura 2A, paneles de la derecha ). Además, otras dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino, SiHa y CaSki, fueron transfectadas con un plásmido de expresión GRIM-19 o dsRNA de orientación GRIM-19 y en comparación con sus respectivos controles. Resultados similares a los observados en HeLa fueron obtenidos en estas células también (Fig. 2B). Por otra parte, las pruebas sobre otras líneas de células tumorales sin VPH (A549 y HO8910) no revelaron los mismos resultados como se observa en células HeLa (Figura S1). Por lo tanto, los niveles de GRIM-19 directamente correlacionados con los de p53 en células de cáncer cervical
. (A & amp; B) Los niveles de proteína de GRIM-19 y p53 en cánceres de cuello uterino primarios. transferencia de Western con los anticuerpos indicados se realizó usando lisados de las líneas celulares indicadas. (C) Efecto de GRIM-19 sobre la expresión del ARNm de p53. El ARNm de GRIM-19 (panel izquierdo) significativamente alta en HeLa /células pG19 (*
p Hotel & lt; 0,01), el panel derecho muestra la expresión del ARNm de p53. Las diferencias no son estadísticamente significativas. (D) GRIM-19 no afectó a la actividad de p53-promotor. Se utilizó un reportero de p53-Luc. Los datos presentados son la media de tres experimentos independientes con muestras por triplicado en cada prueba. (E) GRIM-19 incrementa la vida media de p53. Las células se trataron con CHX (100 g /ml) para los períodos de tiempo indicados y los lisados se sometieron a transferencia Western con los anticuerpos indicados. Los resultados representativos de uno de cada tres experimentos independientes se muestran (panel izquierdo). El valor restante para p53 se calculó como la relación de los valores densitométricos de p53 sobre GAPDH en cada muestra (panel derecho). Los valores medios restantes de tres experimentos independientes se trazaron. (F) GRIM-19 inhibe la degradación de p53
in vivo
. Antes de recoger las células se trataron con MG132 durante 4 h, y se realizó inmunoprecipitación con anticuerpo p53. Western Blot de los productos IP se utiliza anticuerpo ubiquitina. Se utilizaron anticuerpos GAPDH para determinar la carga comparable.
Para investigar si GRIM-19 aumentó p53 a través de la regulación transcripcional, los niveles de mRNA p53 se analizaron mediante el ensayo de RT-PCR y cuantitativa indicador de luciferasa fueron realizados en HeLa /células HeLa pCon y /pG19. El nivel de ARNm de p53 no se vio afectada por la sobreexpresión de GRIM-19 (Fig. 2C). Además, p53 indicador de luciferasa promotor impulsado no reveló cambios significativos en la actividad del promotor p53 en HeLa /pCon y células HeLa /pG19 (Fig. 2D), lo que sugiere que GRIM-19 no está involucrada en la activación transcripcional de p53.
en los tumores cervicales, p53 está mutado con poca frecuencia [23], y que se degrada rápidamente por E6 /E6AP [6], [24], el próximo examinó si aumento en los niveles de p53 se debe a una mayor vida media de la proteína . HeLa /pG19 y HeLa /pCon células fueron tratadas con los niveles de proteína p53 cicloheximida y fueron monitoreados en el tiempo. De hecho, la vida media de la proteína p53 era significativamente (
p
& lt; 0,01) prolongada en células HeLa /pG19 comparación con HeLa /células pCon (Fig 2E.).
In vivo
ensayo de ubiquitinación también mostró que la p53 en células HeLa ubiquitinated /pG19 se redujo drásticamente en comparación con HeLa /pCon células (Figura 2F).
En su conjunto, estos resultados sugieren que GRIM-19 los niveles de p53 restauradas a través de la estabilización de proteínas en lugar de transcripcional sobre regulación en tumores cervicales.
GRIM-19 estabiliza la proteína p53 mediante la interacción con las proteínas E6 y E6AP
la degradación de p53 mediada por E6AP
E6 /se considera como un mecanismo importante en la iniciación y el desarrollo de los carcinomas cervicales [23], [25]. Desde GRIM-19 se une a 16E6 [26], la hipótesis de que GRIM-19 interfiere con el complejo de E6 /E6AP, protegiendo de esta manera p53 de la degradación. El uso de ensayos de inmunoprecipitación con lisados celulares a partir de células HeLa, encontramos la interacción de GRIM-19 con E6AP
in vivo gratis (Fig. 3A). A continuación, examinó la interacción GRIM-19-E6AP
in vitro
con los ensayos de GST pull-down. E6AP codifica tres isoformas de proteínas diferentes (I, II y III) que difieren en sus colas de terminal N, todos los cuales tienen la capacidad de estimular E6 mediada por la degradación dependiente de ubiquitina de la proteína p53 [27]. Debido a que varios dominios funcionales de E6AP habían sido identificados anteriormente [28], se generaron tres plásmidos recombinantes que expresan las supresiones basados en la isoforma E6AP-III con cola de histidina: pE6AP-Δ1 (1-286 aa), pE6AP-Delta 2 (287-521 aa) y pE6AP-Δ3 (522-872 aa). sitios de unión de E6 se encuentran entre los aa 287 a 521 de E6AP-III, mientras que el dominio hect para sitios de unión de ubiquitina se encuentra en el segmento de 522 a 872 aa (Fig. 3C) [29]. Se encontró que sólo E6AP-Δ3 obligado a GST-etiquetados GRIM-19 mediante el ensayo de pull-down GST (Fig. 3B-C), pero no el E6AP catalíticamente inactiva que contiene una mutación en Cys en la posición 840 (Fig S2), estos resultados apoyado nuestra conclusión de que GRIM-19 se puede unir el dominio de hect E6AP. Para asignar la región exacta de la interacción GRIM-19 con E6AP, hemos empleado GST-etiquetados GRIM-19 supresiones pGST-G19-Δ1, pGST-G19-Delta 2 y pGST-G19-Δ3; Y encontraron que los aminoácidos 1-35 de GRIM-19 eran suficientes para las proteínas de unión a E6AP (Fig. 3D).
Se llevaron a cabo ensayos (A) Co-inmunoprecipitación para determinar la interacción entre GRIM-19 con E6AP
in vivo
. Los lisados celulares de células HeLa se inmunoprecipitaron con IgG normal y anti-GRIM-19 anticuerpos y transferencia Western con anti-E6AP. De entrada (preIP) carril representa 10% del extracto utilizado en la reacción de inmunoprecipitación. HC = cadena pesada de IgG. Se llevaron a cabo (B) experimentos GST pull-down para examinar la interacción de deleciones E6AP Su-etiquetados con la proteína 19-GRIM fusionada GST-
in vitro
. (C) Diagrama esquemático de E6AP indicando varios dominios funcionales que incluyen los sitios de unión para GRIM-19. (D) La interacción de GST-GRIM-19 con deleciones E6AP. * Indica la posición de la banda con el tamaño molecular correcto. Se llevaron a cabo (E) ensayos de co-inmunoprecipitación para determinar la interacción entre GRIM-19 con 18E6. Los lisados celulares de células HeLa transfectadas con el p18E6-Flag fueron sometidos a IP con los anticuerpos indicados. De entrada (preIP) carril representa 10% del extracto utilizado en la reacción de inmunoprecipitación. LC = cadena ligera de IgG. (F) La interacción de GST-GRIM-19 supresiones con 18E6. * Indica la posición de la banda con el tamaño molecular correcto. (G) supresión de cartografía de los sitios de unión E6 o E6AP en la GRIM-19.
Nos han informado de la interacción de GRIM-19 con 16E6 antes [26], que a continuación exploramos la asociación de GRIM -19 y 18E6. Debido a la baja expresión de E6 y pobre reactividad de anticuerpos E6 disponibles que se han reportado por una serie de publicaciones [30], [31], [32], [33], pero no hemos podido obtener una mancha 18E6 occidental satisfactoria por parte del lisados celulares. Por lo tanto, se construyó un plásmido p18E6-bandera que expresa una proteína 18E6 Bandera de etiquetado. A través de ensayos de inmunoprecipitación en células HeLa transfectadas con p18E6-Flag, encontramos 18E6 co-precipitado con GRIM-19
in vivo gratis (fig. 3E). Para asignar la región exacta interactuar de GRIM-19 con 18E6, hemos empleado el sitio de unión de GRIM-19 con 18E6 utilizando GST-etiquetados GRIM-19 deleciones (pGST-G19-Δ1, pGST-G19-Delta 2 y pGST-G19- Δ3); Y encontraron que los aminoácidos 1-35 de GRIM-19 eran suficientes para las proteínas de unión a 18E6
in vitro gratis (Fig. 3F).
Por lo tanto, concluimos que GRIM-19 puede unirse tanto 18E6 y E6AP
in vivo e in vitro
, que podrían desempeñar un papel en la acumulación de la proteína p53.
GRIM-19 interrumpe E6 /E6AP complejo y aumentar E6AP ubiquitinación y degradación
Dada que tanto 18E6 y E6AP-Δ3 pueden interactuar con los aminoácidos 1-35 de la N-terminal de GRIM 19 (Fig. 3G), que determina si 18E6 competía con E6AP en la unión GRIM-19 mediante la realización de ensayos de pull-down de competencia. En presencia de la proteína GST-G19 purificado y el aumento de cantidad de E6AP-Δ3, la unión de 18E6 a GRIM-19 disminuyó progresivamente a medida que E6AP-Δ3 aumentó (Fig. 4A). Aunque E6AP-Δ2 no interactúan con GST-G19, es bien conocido que esta región alberga sitios E6 de unión [28]. Por lo tanto, hemos probado si GST-G19 y E6AP-Δ2 competir en la unión con 18E6. En presencia de E6AP-Δ2, GST-G19 con destino a 18E6 disminuyó en comparación con 18E6 presentado solo (Fig. 4B). Por otra parte, no se observó una asociación de E6AP-Δ2 con GST-G19 en presencia de 18E6, lo que sugiere que las proteínas no pueden formar un complejo heterotrimeric de 18E6 /E6AP-Δ2 /GST-G19.
(A ) se llevaron a cabo ensayos competitivos para analizar la unión de 18E6 a la proteína de fusión GST-GRIM-19 en presencia de cantidades crecientes de E6AP-Δ3 que van desde 0 hasta 6 g. (B) Tire hacia abajo experimentos para determinar la unión de 18E6 a GST-GRIM-19 proteínas. ¿Dónde se añadieron proteínas E6AP-Delta 2 indicados (10 ug) en GST reacción desplegable. (C) GRIM-19 aumentada E6AP degradación
in vivo
. Antes de recoger las células se trataron con MG132 durante 4 h, y se realizó inmunoprecipitación con anticuerpo E6AP. Western Blot de los productos IP se utiliza anticuerpo ubiquitina. Se utilizaron anticuerpos GAPDH para determinar la carga comparable. (D)
in vitro
E6AP ensayo de ubiquitinación En. ubiquitina humana recombinante, E1, E2 (Ubch5c), batereria-GST expresada y purificada y GTS-GRIM-19, E6AP (de tipo salvaje o mutante catalíticamente inactivo CA) a partir de extracto de germen de trigo se mezclaron para
in vitro
ensayo de ubiquitinación E6AP y a inmunotransferencia con anticuerpo ubiquitina. (E) Total lisados celulares de células HeLa que expresan los plásmidos de expresión indicados eran transferencia Western con los anticuerpos indicados.
Ha sido bien establecido que E6AP puede apuntar en sí para la ubiquitinación, lo que representa un mecanismo para controlar su propia vida media [7], [34]. Luego exploramos si la expresión de GRIM-19 puede influir en la degradación de E6AP, en presencia de, E6AP ubiquitinated GRIM-19 sobreexpresa significativamente mayor en comparación con HeLa /células pCon (Fig. 4C). En ubiquitinación ensayo in vitro demostró que GRIM-19 aumentó la autoubiquitination de tipo salvaje E6AP, pero no su mutante CA dominante negativo mediante el uso de purifed E1 y E2 (Ubch5c), expresada en bacterias E6AP GRIM-19, y de tipo salvaje y CA E6AP mutante traducida en el sistema de extracto de germen de trigo (Fig. 4D). De hecho, encontramos la proteína E6AP se redujo en células con sobreexpresión de GRIM-19 (Fig. 4E, S1).
En resumen, podemos concluir que GRIM-19 evita la degradación de p53 al impedir la formación de E6 /E6AP complejo y promueve ubiquitinación y degradación de E6AP.
GRIM-19 retrasos G0 /G1 transición, inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis y promueve la acumulación de p53 in vivo
Dado que las inducciones de la detención del ciclo celular y el crecimiento celular supresión son las principales funciones de p53, el próximo evaluó el efecto de GRIM-19 dependiente de la estabilización de p53 en el ciclo celular. análisis de distribución del ciclo celular revelaron una transición G0 /G1 retrasado significativamente en células HeLa /pG19 en comparación con HeLa /células pCon (Tabla 1). Además, como se indica mediante el ensayo de MTT, la proliferación celular de las células HeLa /pG19 fue significativamente (p & lt; 0,05). Suprimidas en día 3 y día 4 (Fig. 5A) en comparación con células HeLa /pCon
(A ) Un ensayo de MTT se realizó en las células indicadas. ensayo de MTT se realizó como en Materiales y Métodos. Cada punto de datos representa la media ± SE de 8 muestras. (B) Las características morfológicas de las células HeLa /pCon células HeLa y /pG19 fueron examinadas por microscopía electrónica de transmisión. condensación de la cromatina, la expansión y las lagunas de la membrana nuclear ensanchadas, estructura de la membrana nuclear vaga, fracturas de membrana nuclear y la expansión del retículo endoplásmico se indican con flechas. ER, retículo endoplasmático; NM, membrana nuclear. (C) La longitud total y la forma escindida de la caspasa-3 y PARP en células HeLa /pCon células HeLa y /pG19 se determinaron mediante análisis de Western blot. (D) HeLa /Con y HeLa /células G19 fueron transplantadas a 6 semanas de edad, los ratones desnudos atímicos hembra (10 ratones para cada línea celular) y se cultivaron durante 6 semanas. Los tumores se cosecharon, y se midieron los pesos. Los datos presentan la media de 10 tumores en cada grupo. (E) La expresión de GRIM-19, p53, p21, PUMA, p27 y E6AP en los tumores derivados de ratones tal como se determina por análisis de transferencia Western, y los resultados representativos se presentan. (F) Un modelo para la colaboración entre GRIM-19 y p53. Cuando GRIM-19 está presente en altos niveles, que interactúa con el complejo de E6 /E6AP, promueve su ubiquitinación, por lo tanto, la prevención de la degradación de p53. La pérdida de GRIM-19 permite que el ataque del complejo E6 /E6AP en p53 y su degradación a través del proteasoma.
Debido a la promoción de la apoptosis celular es otra función clave de p53, se realizó la apoptosis de las células ensayos que incluyen la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y transferencia Western con anticuerpos de caspasa 3 y PARP. Una gama de características de apoptosis temprana se indica en células HeLa /pG19, incluyendo la condensación de la cromatina nuclear, se amplió brecha de membrana nuclear, estructura de la membrana nuclear vaga, fracturas de membrana nuclear y la expansión del retículo endoplásmico; sin embargo, estos fenómenos no se observaron en células HeLa /pCon (Fig. 5B flechas). Además, la escisión de la caspasa 3 y PARP se aumentó en las células HeLa /pG19 en comparación con HeLa /células pCon (Fig. 5C).
También encontramos que los pesos de los tumores en los ratones trasplantados con células HeLa /pG19 se redujo significativamente en comparación con los de los grupos control (
p
& lt; 0,05) (Fig. 5D). GRIM-19 y p53, junto con p21, p27 y PUMA proteínas se incrementaron significativamente, pero E6AP disminuyó en los tumores derivados de células HeLa /pG19 comparación con los tumores de células HeLa /pCon (Fig. 5E).
Finalmente, basado en nuestras observaciones, un modelo para GRIM 19-apoptosis celular inducida por peligro el E6 /E6AP y la estabilización de p53 se especuló (Fig. 5F). Este modelo sugiere que la presencia de GRIM-19 promueve la auto-ubiquitinación y degradación de E6AP mediante la interacción con estas proteínas y contribuye a la estabilización de p53, la detención del crecimiento y la apoptosis.
Discusión
alta riesgo los virus del papiloma humano (VPH-AR), tales como HPV18 y HPV16, se asocian con el 99,7% de los cánceres de cuello uterino [35], que son los tumores ginecológicos más comunes en los países en desarrollo [36]. Las oncoproteínas virales E6 y E7 se expresan en carcinomas de cuello uterino VPH-positivo [6], mientras que la proteína E2 viral reprime la transcripción de los oncogenes E6 /E7 y activa la replicación del ADN viral junto con el viral E1 helicasa [37], [38], [39]. La degradación mediada por E6 /E6AP de p53 se considera un mecanismo más importante en la iniciación y el desarrollo de los cánceres cervicales [6], [11], [12], [25], [40], [41]. Estudios recientes sugieren que la interferencia del complejo de E6 /E6AP puede matar tumores de cuello uterino, aumentando el nivel de proteína p53 [11], [12], [40]. En nuestro estudio, se presenta un nuevo enfoque para prevenir la degradación de p53 por la restauración de GRIM-19 que interrumpe el complejo /E6AP E6.
Se ha informado de que GRIM-19 puede suprimir la actividad transcripcional de STAT3 a través proteico proteína de interacción, e inhibir el crecimiento del cáncer [16], [17]. STAT3 se ha demostrado que inhibe la expresión de p53 a través de una represión de la transcripción en las vías de señalización de oncogenes inducida por Src en ciertas líneas celulares de roedores [42]. Algunos estudios en líneas celulares de cáncer mostraron una correlación entre altos de actividad STAT3 mutaciones en el gen p53 y constitutivos, aunque no se establecieron las relaciones de causa y efecto [43]. En cierta cabeza y cuello carcinomas de células escamosas, el estado de p53 se ha demostrado abajo regular NF-kappa B y la expresión del gen STAT3 inducida [44]. Hemos demostrado en nuestra publicación anterior que la pérdida de GRIM-19 se correlaciona con una alta actividad STAT3 en los cánceres de cuello uterino primarios [20]. Aunque estas observaciones sugieren la posibilidad de que la pérdida de GRIM-19 promueve la alta actividad de STAT3, que podría regular en última instancia transcriptionally abajo la expresión de p53, nuestros estudios no revelaron (fig 2C & amp;. D) cualquier cambio en la expresión de indicador de luciferasa conducido por p53 humana promotor y de ARNm de p53 endógeno. Por lo tanto, la desregulación STAT3 no puede tener una consecuencia directa sobre la expresión de p53 en nuestro modelo. Así, dos 19-GRIM vías independientes: 1) una activación de STAT3 y 2) una regulación a la baja de p53 al mismo tiempo que se producen en VPH transformado carcinomas cervicales para la promoción de tumorigénesis después de la pérdida de expresión de GRIM-19. Más importante aún, la interferencia con la expresión STAT3 utilizando ARN
i
o su función utilizando enfoques dominantes negativos (Figura S3) no alteró significativamente los GRIM 19-efectos sobre la estabilización de p53. Por lo tanto, la estabilización de proteínas p53 por GRIM-19 parece ocurrir independientemente de STAT3.
En este artículo, también a prueba si GRIM-19 inhibe la degradación de p53 en ausencia de E6. células negativas de dos VPH HO8910 y A549 que tanto contiene p53 de tipo salvaje [45] se examinaron para su expresión de p53 después de la sobreexpresión de GRIM-19. Aunque GRIM-19 era capaz de aumentar la degradación de E6AP en estas dos células, los niveles de proteína de p53 se mantuvo sin cambios (Fig S1), lo que sugiere que GRIM-19 es capaz de prevenir la degradación de p53 dependiente de E6.
Los informes recientes han demostrado que GRIM-19 puede interactuar con algunas otras proteínas fisiológicas importantes, como HtrA2 [46]; Por otra parte, las proteínas virales tales como U95 y vIRF1 también pueden unirse a GRIM-19 [21], [26], [47]. Hemos demostrado previamente una asociación entre 16E6 y GRIM-19 [26]; aquí, también encontramos la interacción de GRIM-19 con 18E6 y E6AP
in vivo
y
in vitro
, y la inducción de la degradación de autoubiquitination E6AP por GRIM-19. En células de cáncer cervical de infección de HR-HPV, GRIM-19 fue capaz de inducir la acumulación de la proteína p53 y aumentar genes diana de p53 tales como p21 y PUMA. Además, se observaron cambios significativos en el perfil del ciclo celular, la proliferación celular, y los signos morfológicos característicos de la apoptosis en células HeLa sobreexpresión de GRIM-19. Por lo tanto, GRIM-19 y p53 puede sinérgicamente suprimir el crecimiento celular del cáncer de cuello uterino.
E6AP es un regulador crítico de la degradación de p53 en el cáncer cervical humano en una forma dependiente de la E6. Aparte fromp53, E6 complejo /E6AP ha informado de interferir con varias funciones celulares [48], incluyendo activadores de la transcripción tales como IRF3, co-activadores tales ASP300, inductores de la apoptosis tales como Bak, GADD34, procaspasa-8 y su adaptador FADD, proteína quinasas tales como Tyk2, la adhesión celular asociada moléculas tales como paxilina, y NFX1-91, a moléculas que atenúa la actividad de telomerasa. En la mayoría de estos casos los objetivos complejos E6 /E6AP estas proteínas a la degradación que permiten la transformación oncogénica [48]. interacción E6 con E6AP ha informado que es importante para la carcinogénesis de la piel en modelos de ratones transgénicos [49], [50]. E6AP también se dirige a las proteínas E6 de manera independiente. De hecho, se ha informado de varios sustratos, tales como miembros de la familia Src de proteínas quinasas [51], proteínas Polycomb Ring1B [52] y la leucemia promielocítica (PML), la proteína [53]. Naturalmente que ocurren mutaciones esporádicas E6AP están asociados con el síndrome de Angelman, una forma grave de retraso mental, en el que la acumulación de agregados de proteínas no degradadas ha informado [52], [54], [55], [56]. Por lo tanto, la proteína E6AP en asociación con E6 y en algunas situaciones en su propia juega un papel central en el control de la degradación de proteínas de varias patologías humanas.
Debido E6AP también actúa como un coactivador de doble función para los receptores de hormonas esteroideas (SHR) que incluye receptor de progesterona, receptor de estrógeno, receptor de andrógenos, receptor de glucocorticoides, receptor retinoico-α ácido y del receptor de la hormona tiroidea [29], [57], y los aminoácidos de 170 a 680 son el dominio de activación de E6AP [29], la interacción de GRIM-19 con E6AP (522-872 aa) podría predecir que GRIM-19 probablemente regula la transcripción de genes SHR-dependiente.
En resumen, nuestros estudios por primera vez muestran un nuevo mecanismo por el cual GRIM-19 bloques complejo E6 /E6AP; y la colaboración entre dos proteínas supresoras de tumores diferentes en la regulación del crecimiento celular.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los tejidos del cuello uterino se obtuvieron de pacientes que se sometieron a histerectomía entre enero de 2008 y noviembre de 2009 en el hospital Provincial de Anhui afiliado a la Universidad médica de Anhui, Hefei, china. El estudio fue revisado y aprobado por la junta de revisión ética del Hospital Provincial de Anhui. Se obtuvo consentimiento escrito de cada paciente.
Todos los procedimientos experimentales con animales realizados en este estudio han sido aprobados por el animal de laboratorio del Comité de Ética de la provincia de Anhui Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui con el número 201000179 permiso, y eran de conformidad con las directrices para el cuidado de animales establecidos por esta Comisión.
tumores
Una parte de los tejidos extirpados fueron recién incluido en parafina, cortado en secciones de 5 a 7 micras de espesor para el diagnóstico patológico, y el resto del tejido se congeló a -80 ° C para su uso posterior para extraer proteínas y ARN. estadios clínicos se determinaron por un patólogo ginecológica certificado de acuerdo a una Federación Internacional de Ginecología modificado Obstetricia (FIGO) para el cáncer de cuello de útero en 2000. Los 60 no metastásicos carcinomas epiteliales escamosas examinadas en estos estudios fueron HPV16 o HPV18 positivo y pertenecían a escribir Ia (13 pacientes), Ib (9 pacientes) y IIa (38 pacientes). Además, 45 tejidos cervicales normales de los pacientes que se sometieron a histerectomía por causas distintas de la neoplasia de cuello uterino o bien el endometrio fueron recogidos y utilizados como controles normales en este estudio.
Cultivo de células y transfección
Humano líneas celulares de cáncer cervical HeLa, SiHa y CaSki y el adenocarcinoma de pulmón humano línea celular A549 de la American Type Culture Collection (ATCC) se cultivaron DMEM con suero bovino fetal 10%. La línea celular de cáncer de ovario humano HO8910 se adquirió de banco de células de la Academia de Ciencias de China [58], [59] y se cultivaron en RPMI-1640 completo. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) se utilizó para la transfección. El transfectadas establemente líneas celulares HeLa /pCon y HeLa /pG19 expresando vector de control y humano GRIM-19, respectivamente, se han descrito anteriormente [20].
xenoinjertos tumorales
Los animales fueron criados en laboratorio estándar condiciones. Dos grupos (10 en cada grupo), de 6 semanas de edad ratones desnudos atímicos hembra (Beijing centro de animales experimentales) se implantaron subcutáneamente en el flanco derecho de los ratones con células HeLa /pG19 o células HeLa /pCon (1 × 10
7) en 0,1 ml de PBS que contenía 50% de matrigel. Todos los ratones fueron alojados en un entorno libre de patógenos. Al final del experimento (6 semanas después de la implantación), los ratones se sacrificaron, se recogieron y se pesaron los tumores. Una porción de cada tumor se procesó para análisis de inmunohistoquímica y bioquímicas, y el resto se congeló a -80 ° C hasta su uso.
plásmidos
Los plásmidos LZRSpBMN-enlazador-IRES-EGFP-STAT3C (STAT3C) que expresa un mutante constitutivamente activa STAT3 y LZRS MNSP-enlazador-IRES-EGFP-STAT3DN (STAT3DN) que expresa un mutante dominante negativo de STAT3 fueron regalos del Dr. Hodge DR como se describe anteriormente [60]. Los Pires-Puro2-Myc vector vacío (pCon) y Pires-Puro2-GRIM-19-Myc (pG19) que expresan un Myc-etiquetados GRIM-19 fueron descritas anteriormente [20].