cáncer
Extracto
Los retrovirus han sido fundamental en la investigación contra el cáncer desde principios de los estudios identificados proto-oncogenes como objetivos para la inserción mutagénesis. Integración de murino gamma-retrovirus en el genoma huésped favorece promotores y potenciadores e implica la interacción de la integrasa viral con BET anfitrión /factores de bromodomain. Nos informan de que este patrón de integración se conserva en virus de la leucemia felina (FeLV), una gamma-retrovirus que infecta a muchos tipos de células humanas. Análisis de los sitios de inserción de FeLV en la línea celular de carcinoma de mama MCF-7 reveló fuerte sesgo hacia las marcas de la cromatina activa sin evidencia de selección significativo crecimiento post-integración. Los objetivos más importantes de integración FeLV tenían poco en común con las transcripciones más abundantemente expresado, pero fueron fuertemente enriquecido para los genes del cáncer anotados. Un meta-análisis basado en varios perfiles de integración gamma-retrovirus (GRIP) estudios en células humanas (CD34 +, K562, HepG2) reveló un sesgo gen del cáncer similar, pero también notable especificidad de tipo celular, con excepciones importantes, incluyendo un punto de acceso universal de integración en el de largo no codificante ARN
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. Comparación de los objetivos de la adherencia con las bases de datos de super-potenciadores de las mismas líneas celulares mostraron que éstos sólo tienen solapamiento limitado y que grip proporciona una visión única de los conductores en sentido ascendente de crecimiento celular. Estas observaciones dilucidar la potencia oncogénica de las gamma-retrovirus y apoyan la aplicación más amplia de GRIP para identificar los genes y circuitos reguladores de crecimiento que impulsan distintos tipos de cáncer
Visto:. Gilroy KL, Terry A, Naseer A, de Ridder J, Allahyar A, Wang W, et al. (2016) Gamma-Retrovirus Integración Marcas tipo de células específicas genes cancerígenos: Una herramienta de perfilado Novel en Genómica del Cáncer. PLoS ONE 11 (4): e0154070. doi: 10.1371 /journal.pone.0154070
Editor: María Bryk, Texas A & amp; M University, Estados Unidos |
Recibido: 15 Febrero de 2016; Aceptado: 10 Abril de 2016; Publicado: 20 Abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Gilroy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel y sus archivos de soporte de información, o han sido puestos a disposición anteriormente a través de manuscritos publicados
Financiación:. KLG, eN, AN, AK, ERC e JCN fueron apoyados por un programa conjunto de Cancer Research UK y Bloodwise (los números de subvención A11951 (CRUK) y 13046 (Bloodwise); URL son http://www.cancerresearchuk.org/y https://bloodwise.org.uk/). JdR fue financiado por una subvención VENI (639.021.233) de NOW (Organización Holandesa para la Investigación Científica, http://www.nwo.nl/). AM fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (RP 97798, http://www.cihr-irsc.gc.ca/~~number=plural). GK-SW fue financiado por Innova Tecnología Alberta Futuros (AITF, http://www.albertatechfutures.ca/) e innova Centro de Investigación de Excelencia (Icore). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la capacidad de los retrovirus para dirigir la integración estable es inherentemente mutagénico y puede perturbar los genes de la célula huésped en el sitio de inserción proviral o incluso a una distancia significativa [1,2]. Mientras que esta característica ha llegado a ser considerado principalmente como una complicación no deseada para el uso de vectores retrovirales en terapia génica [3,4], ha sido durante mucho tiempo un valioso activo en la investigación del cáncer, ya que los sitios de integración de retrovirus en origen natural o experimentalmente cánceres inducidos de pájaros, ratones y gatos han proporcionado una rica cosecha de genes controladores del cáncer y sus familias, incluyendo
Myc
,
Myb
,
Pim
,
Runx
,
Bmi1
,
Gfi1
y
Notch
[1]. La finalización de la secuencia del genoma del ratón y el advenimiento de la clonación de alto rendimiento y la secuencia de los sitios de inserción ampliaron el alcance de estos estudios de forma masiva, dejando al descubierto muchos nuevos potenciales genes diana [5-7]. Se suponía que en los primeros estudios de integración retroviral es efectivamente al azar, y que los sitios comunes de integración específicos de cáncer (CISS) surgió simplemente de expansión clonal después de inserciones raros en los sitios sensibles que coincidieron en tumores independientes por casualidad. Por el contrario, se ha hecho evidente en los últimos años que los retrovirus tienen preferencias de integración significativos que reflejan sus características y modos de la colonización de acogida biológicas distintivas.
La predilección del VIH lentivirus de integrar en los genes transcritos activamente es una característica clave de su patogénesis donde transita entre la infección latente y la replicación citopático. Para el VIH, este proceso implica la interacción entre la proteína integrasa viral y LEDGF, un co-activador transcripcional que ata el complejo de integración a la cromatina y facilita la integración [8,9]. Por el contrario, la replicación gamma-retrovirus generalmente no es citopático y anfitriones infectados persistentemente puede mostrar altos niveles de viremia, con tumores inducidos por mutagénesis de inserción un resultado relativamente común de infección [10,11]. La no aleatoriedad de virus de la leucemia murina de integración (MLV) se apreció primero de los primeros estudios que destacaron sesgos hacia ADNasaI sitios hipersensibles y inicio de la transcripción sitios [12]. La base de esta especificidad fue aclarada recientemente con la demostración de que la integrasa MLV interactúa con las proteínas BET /bromodomain (Brd2, 3 y 4) que a su vez se unen a la histona acetilada H3K27ac, marcando algunas de las regiones más activas de la cromatina [13-15 ]. La importancia de esta interacción se ve subrayada por la reducción significativa en el título y /o pérdida de la orientación de los SAT MLV crecido en presencia de inhibidores de BET JQ1 e I-BET
in vitro
[13-15]. Esto crea una conexión adicional con la investigación del cáncer como inhibidores BET están siendo investigados actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de múltiples tipos de cáncer [16].
El alcance total de salida de la integración aleatoria de MLV ha quedado claro sólo con el advenimiento de los métodos a gran escala para capturar y secuencia de los sitios de integración en las poblaciones de células infectadas de manera policlonal
in vitro
antes de cualquier selección de un crecimiento significativo. Los estudios a gran escala de la integración del vector MLV en células CD34 humanos o la infección de pseudotipo MLV de líneas celulares de cáncer humano ha revelado un proceso notablemente selectiva en la que más de la mitad de las integraciones se dirigen a menos de 2% del genoma humano [17,18]. Por otra parte, los sitios genómicos preferidas se producen en las marcas de la cromatina activos e incluyen potenciadores fuertes, así como promotores.
En este estudio hemos explorado las preferencias de integración de otro gamma-retrovirus, virus de la leucemia felina (FeLV). Utilizamos FeLV-B, una variante común de origen natural de FeLV que es capaz de infectar células humanas prácticamente todos cultivadas sin citopatología evidente [19] a través de la interacción con el transportador de fosfato ampliamente expresada Pit1 [20]. Se analizaron inicialmente integraciones en la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7, que es permisiva para la difusión, título elevado de replicación FeLV-B, y está entre las mejores líneas celulares de cáncer caracterizado con respecto a la genómica funcional. FeLV-B muestra una preferencia similar para los sitios de inicio de transcripción y las marcas de la cromatina activa a MLV, compatible con la conservación del bucle C-terminal de la integrasa que se une a apostar /Brd [21]. Sin embargo, la integración no FeLV especificidad fue dirigida principalmente a los genes más abundantemente expresado, pero fue fuertemente sesgada hacia los genes controladores de cáncer de mama. Este hallazgo inspiró un meta-análisis de gamma-retrovirus preferencia de la integración de varios estudios que revelaron un alto grado de especificidad de tipo celular, mientras que los genes de cáncer fueron favorecidos en todos los casos, incluso en las células normales. Estos hallazgos sugieren que el perfil gamma integración retroviral (GRIP) será una herramienta valiosa para la identificación de los genes del cáncer de controladores específicos de linaje en una amplia variedad de tipos de cáncer humano.
Resultados
integración FeLV en células de cáncer de mama humano se dirige a los sitios de inicio de transcripción y las marcas de la cromatina activa
la clonación de sitios de integración FeLV-B en células MCF-7 de cáncer de mama infectados por enlazador mediada por PCR y mapeo con el genoma humano produjo 20.634 por virus auténtica albergar fragmentos de unión, lo que corresponde a 8.052 inserciones únicas (figura 1A, S1 conjunto de datos). El relativamente bajo número de copias por inserción única sugirió que ninguna selección clonal significativo había ocurrido durante el breve período de crecimiento
in vitro
, y esta cuestión se examinó por análisis de sesgo orientación proviral. Mientras que el propio proceso de integración es aleatorio con respecto a la orientación, la propensión de gamma-retrovirus para activar genes del huésped mediante la inserción potenciador, un proceso que está fuertemente afectada por la orientación, conduce a la aparición de clones dominantes con sesgo pronunciado en integración puntos calientes clave que puede ser demostrado estadísticamente mediante un análisis 'heads-colas "[22]. Hemos aplicado esta prueba para el conjunto de datos FeLV /MCF-7. De los 100 genes diana con mayor frecuencia, 8 mostraron evidencia de sesgo de orientación (valores de p 0,011 a 0,049 por la prueba exacta de Fisher), pero ninguna de estas observaciones sobrevivieron Bonferroni o Benjamini-Hockberg corrección de múltiples ensayos (en todos los casos el valor de p 8 con Bonferroni la corrección era 1, y el valor p con la corrección de Benjamini-Hockberg era 0,612). Por otra parte, ninguno de los genes cercanos fueron anotados conductores de cáncer, y ninguno muestra el clásico 'corriente arriba y hacia atrás' agrupación que se observa con más frecuencia con este modo de activación de oncogenes [1]. Además, las inserciones en los 100 genes específicos con mayor frecuencia no mostraron evidencia de mayor número de copias en comparación con el conjunto de datos en su conjunto, con un promedio de 2,7 y 2,6 copias /inserción, respectivamente (p = 0,44). Estas observaciones sugieren que se ha producido la selección clonal mínimo después de la integración y que cualquier distribución no aleatoria observada en el genoma se debe principalmente a la preferencia de lugar de inserción. La agrupación de inserciones FeLV en los alrededores de la transcripción se inicia sitios (DST) fue evidente a partir del conjunto de datos, con un doble pico en +/- 1,5 kb y un canal directamente en el SAT indistinguible del patrón reportado para MLV [17] (Figura 1B). Se determinó la posición de las inserciones en el gen más cercana y se muestra en la figura 1C. La mayor parte de las inserciones se encuentran dentro del gen, con el siguiente grupo más grande cadena arriba del gen, de acuerdo con su orientación de los elementos potenciadores
A:. Experimental flujo de trabajo. B: Posición de inserciones en células MCF-7 con respecto a los SAT, que muestra un pico doble con cubeta en el SAT. C:. Gráfico de sectores que muestra la posición de inserciones en células MCF-7 con respecto al gen cercano
Para determinar si las marcas epigenéticas específicas también fueron atacados por el virus, se analizaron los datos del consorcio ENCODE. conjuntos de datos de chip-ss para todas las marcas de histona disponibles en células MCF-7 fueron procesados y picos anotados como se describe en Materiales y Métodos. Disponible marcas de histona eran H3K27ac, H3K9me3, H3K36me3, H3K27me3 y H3K4me3. Se determinó la superposición de las células MCF-7 inserciones de marcas de histona y se resume en la figura 2. En primer lugar se consideran marcadores de la cromatina activa, siendo estos H3K27ac (marca potenciador), H3K4me3 (activo promotor de la marca) y H3K36me3 (marcador de elongación). Como se resume en la figura 2A, una gran proporción de las células MCF-7 inserciones solapa con estas marcas de histona (41,8%); el mayor solapamiento se produce con ya sea solo H3K4me3 (1119 inserciones, 15,7%) o con ambos H3K4me3 y H3K27ac (1508 inserciones, 21%). Al considerar las marcas represivas H3K9me3 y H3K27me3, había muy poca superposición con las células MCF-7 inserciones (solo 0,97% en total, la figura 2B). Teniendo en cuenta la importancia de la superposición del par de MCF-7 inserciones de cada uno de los cinco marcas de histona, ninguna fue estadísticamente significativa con la excepción de H3K27ac, que era altamente significativa con un valor p de 4.96E-69 (los valores de p para todos los otros solapamientos por pares eran 1). Habiendo examinado la relación global entre anotación marca de histona y la inserción MCF-7, se examinó la relación a las marcas de histona de los grupos de inserción más significativos. Se realizó un análisis "más cercana gen 'como se describe en Materiales y Métodos, asignando a cada inserción de un gen y evaluar la importancia de la inserción en ese gen. Del mismo modo, las marcas de las histonas fueron anotados y anota significación (p-scores) obtuvieron utilizando la suite Galaxy /Cistrome como se describe en Materiales y Métodos. Los 500 mejores éxitos de genes para cada marca de histonas (identificado por p-score) se recopilaron y se comparan con los objetivos de integración retroviral superior y la superposición evaluados. La probabilidad de que un solapamiento tal que ocurren por azar se evaluó mediante la simulación Monte-Carlo como se describe en Materiales y Métodos. Los datos se resumen en la figura 2C y en la Tabla 1. Los tres marcas de cromatina activa muestran solapamiento significativo cuando se consideran los grupos de genes más significativos, con valores de p de & lt; 1.67E-8, 0,00236 y 0,0014 para H3K27ac, H3K4me3 y H3K36me3 respectivamente. La cromatina represiva marca H3K9me3 y H3K27me3 no muestran ninguna asociación significativa con las células MCF-7 inserciones (p = 1 y p = 0,97, respectivamente). En general, la comparación con todas las modificaciones de las histonas disponibles muestran sistemáticamente que las inserciones están dirigidos a las marcas de la cromatina activa y están ausentes de marcas represivas
A:. Asociación global de inserciones con marcas de histona activos que muestran el número de características que se cruzan. B: Asociación global con las marcas de las histonas represivas. C: La asociación estadística de los genes cercanos enriquecido significativamente mayor para las inserciones y las marcas de las histonas. se muestran los valores de p transformadas. La línea punteada representa p = 0,05. D: Ejemplos de grupos de genes dirigidos por FeLV en células MCF-7, como se muestra en la UCSC Genome Browser. Las inserciones se muestran en púrpura en la parte superior, seguido de los esquemas de la estructura de genes, y la densidad de la señal finalmente H3K27ac chip-ss.
se anotó el número de la superposición de los genes de la parte superior 500, al igual que el p valores de importancia de solapamiento. Tenga en cuenta que el valor p para H3K27ac representa un 1 en 60x10
6 posibilidad de que la asociación se produce por casualidad, pero el verdadero valor de p será menor ya que este nivel de coincidencia no se observó en 60x10
6 simulaciones.
genes del cáncer de controladores objetivos de integración de FeLV en células MCF-7 de cáncer de mama
Los estudios a gran escala anteriores se han centrado en murino gamma-retrovirus e integración del vector en células normales y malignas y se observó anecdóticamente que muchas inserciones de vectores en células CD34 normales estaban en sitios peligrosos '' en relación con el riesgo de malignidad, incluyendo el locus LMO2 que ha ofrecido como un objetivo frecuente de la integración del vector en la terapia génica leucemias asociado [3,4]. Inspección inicial de los grupos principales de la inserción de FeLV en células MCF-7 mostró una notable concentración en los genes con reportado sobreexpresión o amplificación de cáncer de mama o con un fenotipo desmontables de pérdida de función en células MCF-7. Ejemplo grupos de genes que se muestran en la figura 2D incluyen tres grupos de genes Hox, incluyendo el largo no codificante ARN
HOTAIR
, junto con chromobox
CBX2
y el largo no codificante ARN
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. En la mayoría de los casos, las inserciones coincidieron principalmente con picos de H3K27 acetilación, y en menor medida con el trimethylation H3K4 y marcas trimethylation H3K36, consistente con los datos anteriores que muestra asociación con las marcas de cromatina activa (anotación histona completa para estos genes se muestran en la S1 Fig) .
Estas observaciones nos animaron a llevar a cabo un análisis más sistemático de los sitios de inserción preferidos. análisis genético más cercano identificado 6926 genes. Los 100 mejores genes se determinaron por primera selección para la significación estadística (p & lt; 0,05 mediante la prueba exacta de Fisher), y luego la clasificación por orden del número de inserciones. Los 100 primeros objetivos MCF-7 de integración de estos criterios abarcan 773 inserciones (6,7% de inserciones en total), y se muestran en la Tabla S1. Estos se controlaron de forma cruzada contra el gen del cáncer de censo [23], una base de datos rigurosa, actualizada periódicamente de los genes del cáncer basado en una fuerte evidencia de estado del gen controlador (http://cancer.sanger.ac.uk/census/).
se encontraron 11 de las 100 células MCF-7 objetivos de integración para ser genes del cáncer de controladores (véase la figura 3A y la Tabla S2). Este es un enriquecimiento muy significativo sobre el nivel de fondo de genes controladores del cáncer en el genoma en su conjunto, que es 2,2% (p = 2.01E-09). Para investigar las vías dirigidas por la integración de FeLV, los genes diana 100 principales fueron interrogados por el conjunto de software QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (IPA, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/Ingenuity). Se encontró que el proceso biológico superior definido para este conjunto de genes fue 'cáncer' (valor de p gama 1.95E-2-4.6E-6, la mediana p = 0,00789), proporcionando una prueba de selectividad para los programas genéticos de este tipo (figura 3B). Tener establecida la orientación preferencial de genes controladores del cáncer, se examinó la especificidad de tipo celular de los genes diana. IPA anotación "cáncer" para los mejores MCF-7 aciertos se examinó examinado cáncer subprocesos. Sorprendentemente, tres de los cinco principales de cáncer de sub-procesos estaban relacionados con el cáncer de mama, que muestra un gen específico de la firma cáncer de tejidos fuertes en los objetivos de integración superiores (figura 3C) guía
A:. Porcentaje de los 100 grupos de genes de inserción que son genes conductor cáncer en comparación con el genoma en su conjunto. B: IPA principales procesos agrupaciones que muestra la gama de valores de p transformadas, con mediana indicada por cruz gris. C: Top 5 subtipos de cáncer '' identificados por el IPA con valor de p se muestra transformado. La línea punteada representa p = 0,05. D:. Porcentaje de los 100 grupos de genes de inserción con la anotación conocida de cáncer de mama como se determina mediante la revisión sistemática de la literatura en comparación con un conjunto aleatorio de 100 genes
Para verificar la anotación de genes del cáncer de mama enriquecido en el MCF sitios de integración superior -7, una pantalla de la literatura científica revisada por pares se realizó para las 100 principales genes de las células MCF-7 de destino en comparación con 100 genes elegidos al azar. Para minimizar el sesgo, en cada caso se utilizó el mismo término de búsqueda (& lt; nombre de gen & gt; + "cáncer de mama"), y los mismos criterios para la conocida anotación de cáncer de mama (asociación directa del gen con cáncer de mama con un control posterior, por ejemplo, la precipitación o estudios de expresión). 29 de las 100 células MCF-7 objetivos de integración habían conocido anotación de cáncer de mama, en comparación con 5 de los genes al azar 100, una diferencia que fue altamente significativa (p = 3.35E-28, la figura 3D). Tomados en conjunto estos resultados indican que la integración preferentemente se orienta a un tipo específico de células conjunto de genes que también es relevante para el cáncer de fenotipo.
Los genes en los sitios de inserción preferidos de FeLV muestran niveles heterogéneos de expresión
Anterior los estudios han demostrado que la gamma-retrovirus se integran en regiones de la expresión de genes activos, a menudo en regiones reguladoras tales como regiones promotoras y potenciadoras. Para determinar si el FeLV se dirige a los genes más altamente expresado, los mejores MCF-7 objetivos de integración se compararon con los genes más altamente expresado en células MCF-7 utilizando un microarray conjunto de datos publicados anteriormente [24]. MCF-7 genes se clasifican en función de la intensidad y la posición de los 100 genes diana GRIP observado (Figura 4A). Este análisis reveló ningún sesgo aparente de la integración de FeLV de los genes más altamente expresados. Para analizar esta relación estadísticamente, el aumento de tamaño de las muestras se utilizaron para examinar cómo varió la relación cuando se consideran solamente los golpes de la tapa o una selección más amplia de genes. El nivel de solapamiento en cada tamaño de la muestra se comparó con la predijo que ocurra por casualidad por simulación de Monte-Carlo, y los valores de p calculado (véase Materiales y Métodos para más detalles) guía
A:. Rango parcela orden que muestra la intensidad de todas las sondas de microarrays de células MCF-7. Se muestra en rojo son las 100 mejores grupos de genes mediante la inserción targetted FeLV. B: Transformado valores de p de la importancia de la asociación entre los mejores genes diana de inserción y los genes más altamente expresado para los diferentes tamaños de las muestras. La línea discontinua representa el nivel de significación p = 0,05. C: Tabla que muestra los valores de p representado en B para los diferentes tamaños de las muestras
Los top 150 genes diana retrovirales no mostraron mayor solapamiento con las 150 genes altamente expresados de lo esperado por azar en las células MCF-7. células (valores de p para los mejores 50, 100 y 150 genes fueron de 1, 0,22 y 0,43, respectivamente (figura 4B y 4C)). El largo no codificante ARN
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era el único elemento genético que se superponen los genes más altamente expresado y los objetivos retrovirales preferidos en este análisis. Con la salvedad de que las tasas de transcripción y los niveles de ARN de estado estable no son sinónimos, estos resultados sugieren que los 150 objetivos de integración retroviral superiores están siendo seleccionados por un proceso más sutil que la afinidad de las regiones más activas de la cromatina huésped. Por el contrario, se extiende el análisis a un mayor número de objetivos preferidos (& gt; 200) detectado creciente superposición con los genes más altamente expresado, lo que sugiere un proceso de selección bimodal
Gamma-retroviral preferencia integración:. Un meta-análisis
Después de haber demostrado que el FeLV se dirige selectivamente los genes del cáncer de controladores en una línea celular de cáncer de mama humano, aplicamos el mismo enfoque para conjuntos de datos publicados de sitios de integración '' no seleccionados gamma retrovirus en las células humanas para establecer la generalidad de estas observaciones. Para este metanálisis que utilizó los datos publicados de inserción a partir de dos líneas de células humanas de cáncer, K562 y HepG2 [18] y CD34 + células normales [17]. Si bien estos estudios se llevaron a cabo con gRVs murinos y la infección de las células humanas se logró por pseudotyping de virus MLV infeccioso con VSV-G envoltura [18] o de administración de vector anfotrópico [17] en lugar de la infección natural, un código de preferencia de histona muy similar a nuestro se observó estudio, lo que sugiere que la función de la integrasa conservado es el principal determinante de la especificidad
.
los detalles de los conjuntos de datos utilizados en el meta-análisis se resumen en la figura 5A. Los conjuntos publicados son sustancialmente más grande que nuestro MCF7 ajustado y para obtener un número similar de genes sitio de inserción preferidos hemos establecido un umbral de significación mayor antes de la clasificación de los genes por el número de inserciones previamente. Durante tres conjuntos de datos MLV allí de nuevo fue un enriquecimiento muy significativo para los genes del cáncer de controladores. Para las células CD34 +, 15% de los principales genes diana marcados como conductores de cáncer (enriquecidos en comparación con la línea de base del genoma total de, p = 2.69E-18), por K562 el número fue de 11% (p = 2E-9) y para HepG2 6% . (p = 0,0096)
A: Resumen de los datos utilizadas, incluyendo el tamaño de los conjuntos de datos. B: Mapa de calor que muestra la asociación global de sitios de inserción GRV con la modificación de histonas para todas las líneas celulares. El azul representa marcas favorecidas mientras que el rojo representa marcas desfavorecidos. Los asteriscos denotan nivel de significación, con * siendo p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt; 0,001. C: El enriquecimiento de los genes del cáncer de controladores con el refinamiento de los mejores éxitos para todas las líneas celulares. La línea discontinua representa el porcentaje de genes del cáncer de controladores en el genoma (2,2%) D: Posición de inserciones con respecto al sitio de inicio de la transcripción de todas las líneas celulares. Número aproximado de inserciones totales se muestra debajo de cada tabla.
Las marcas epigenéticas dirigidos por el virus en cada contexto celular se examinaron como se describe anteriormente usando los datos de chip-ss de ENCODE (para las células K562 y HepG2) o la Hoja de Ruta la epigenética humano (para células CD34). Las mismas modificaciones de las histonas se consideraron como para las células MCF-7, siendo estos H3K27ac, H3K4me3, H3K36me3, H3K9me3 y H3K27me3. De acuerdo con los estudios publicados anteriormente, había un enriquecimiento general para inserciones virales en las marcas de la cromatina activa (H3K27ac, H3K4Me3 y H3K36me3) mientras que las marcas represivas (H3K9me3 y H3K27me3) fueron desfavorecidas por el virus [17,18]. La única excepción a este patrón fue K562s que mostraron un enriquecimiento de las inserciones en la marca de H3K27me3, aunque esto no fue estadísticamente significativa. Los resultados se resumen en la figura 5B.
figura 5C muestra una clara tendencia con el aumento de enriquecimiento para los genes controladores del cáncer hacia los genes más altamente orientados en las cuatro líneas celulares. Este patrón es menos clara para el conjunto de datos HepG2, aunque no hay razón para sospechar que los golpes de la tapa pueden haber sido oscurecida por la saturación en este enorme conjunto de datos (3 x 10
6), debido a la puntuación de las inserciones verdaderamente independientes en la mayor estofados como duplicados. La evidencia en apoyo de esta interpretación se proporciona mediante la inspección de la distribución de las inserciones en los alrededores de los sitios de inicio de la transcripción. Cuando estos se normalizaron por la altura del pico, la HepG2 muestra un nivel basal mucho más grande de inserciones no-TSS, consistente con la hipótesis de saturación (Figura 5D).
La figura 6A muestra la superposición de los genes en el top 100 para cada una de las líneas celulares ensayadas. Si bien hay algunos genes diana comunes compartidos por más de un tipo de células, lo que es más sorprendente es que la mayoría de los golpes de la tapa son exclusivos de ese tipo de célula particular, con relativamente poca superposición. La ampliación de los conjuntos de datos para abarcar las 500 genes no disminuye este patrón general exclusiva según el tipo de célula, aunque esto más relajado de corte reveló un pequeño subconjunto de seis elementos 'universalmente' dirigidos:
MALAT1
,
MIR7851
.
1 |,
RCC1
,
VMP1
,
ZC3H4
y
ZMYND8 gratis (figura 6B).
R: diagrama de Venn que muestra el nivel de solapamiento entre las 100 principales objetivos de genes en cada línea celular probado. B:. Como (A) pero teniendo en cuenta la superposición de los 500 genes superiores en cada línea celular
perfiles de integración Gamma-retroviral es complementaria a perfilar super potenciador
El reciente descubrimiento de que la integración GRV está mediada por la unión a BET revelado un vínculo convincente para el cáncer, como BET unión a las histonas acetilado es una de las característica definitoria de 'super-potenciadores', un término acuñado para describir grandes grupos de potenciadores que muestran densa unión de reguladores maestros y jugar un papel en la identidad de la célula específica de tejido [25]. Por otra parte, los inhibidores de la unión BET puede interrumpir el crecimiento de las células del cáncer [16] y este fenómeno se ha atribuido a la sensibilidad aguda a apostar interrupción de super-potenciadores en oncogenes como MYC y BCL2 [26,27].
Para investigar el paralelo entre agarre y super-potenciadores definidos por métodos bioquímicos, se compararon los genes cercanos identificados por ambos métodos. Las listas de genes super-promotor de asociados se obtuvieron de la base de datos dbSUPER [28] para MCF7, K562, HepG2 y células primarias CD34 (RO01480, RO01536 y RO01549). Para células MCF-7, a sólo 98 genes fueron registrados en la lista de super-potenciador, y de estos 8 eran los genes controladores de cáncer según la definición de los datos más recientes gen del cáncer de censo, en comparación con 11 de las 100 principales objetivos GRIP (figura 7A) . Observaciones similares fueron observados para los otros conjuntos de datos, y sólo el conjunto K562 reveló un enriquecimiento más fuerte para los genes del cáncer de controladores en los genes asociados super-promotor de más de los objetivos principales GRIP (23% frente a 11%; p = 0,004). La dificultad de definir una línea de corte preciso entre super-potenciadores y potenciadores convencionales [29] es ilustrado por la gran variación en el número de super-potenciadores para un determinado tipo de células, con los tres CD34 primaria + dbSUPER entradas con un número de superenhancers que van de 326 a 733.
a: Porcentaje de los 100 genes identificados para mejor agarre y superenhancers que son los genes de cáncer de controladores para todas las líneas celulares. B:. La superposición entre las 100 mejores genes para mejor agarre y superenhancers en cada línea celular
A pesar de los números similares de los genes del cáncer de controladores identificados mediante los dos métodos, los genes identificados fueron en su mayoría distinta, y sólo el 2 /genes del controlador 11 de cáncer identificados por el GRIP también se observaron en la base de datos para el super-promotor de células MCF-7 (S2 Tabla). En cuanto a los más amplios conjuntos de genes, también había relativamente poca superposición entre los genes identificados en el Top 100 de agarre y super potenciador objetivos (Figura 7B).
Pathway análisis revela aguas arriba reguladores distintos objetivos de retrovirales y super potenciador genes asociados
El paquete de software IPA incluye un módulo para evaluar las posibles reguladores de la transcripción aguas arriba de cualquier conjunto de genes abstraída, ayudando a iluminar las actividades biológicas en ese sistema celular. Para obtener un análisis completo y estadísticamente robusta, se analizaron las 500 genes diana GRIP para cada tipo de células (Tabla 2). Los conductores aguas arriba fuertemente predichos para el MCF-7 conjunto de datos GRIP incluyen principalmente los conductores cáncer (MYC, KMT2A) y el cáncer asociado genes (ATF4). Cabe destacar que estos genes se vieron muy específicas mediante la inserción retroviral, lo que refleja su estado transcripcionalmente activa y la accesibilidad a la integración. Este análisis sugiere que estos genes están implicados en orquestar la expresión del conjunto de destino GRIP y por lo tanto puede representar a los controladores críticos del programa de cáncer. Observaciones similares se observaron para las otras líneas celulares de cáncer, y para las células normales CD34 +, aunque en este último caso dos de los impulsores de aguas arriba más fuertemente predichos fueron citoquinas (CSF, IL15), que no fueron blanco de la integración retroviral y eran aparentemente no transcripcionalmente activo en las células diana.
Este análisis también se llevó a cabo para conjuntos de genes asociados super potenciador, teniendo las 500 genes que determine el 'ranking' en la entrada de la base de datos dbSUPER, o la totalidad establecer si había menos de 500 genes. Aunque los conjuntos de genes asociados super potenciador eran en algunos casos más pequeño (rango 98-742 genes), que cedió predijeron los reguladores aguas arriba con puntajes estadísticos similares. Una vez más estos reguladores aguas arriba revelaron relativamente poca superposición entre agarre y genes regulados super potenciador, que ilustra las distintas perspectivas sobre los programas de crecimiento subyacentes al descubierto por estos enfoques. Otra diferencia es que la integración retroviral fue significativamente más propensos a atacar los reguladores aguas arriba GRIP en comparación con el conjunto super-potenciador (p = 0,005, prueba exacta de Fisher).
Discusión
Este estudio muestra que la integración gamma-retrovirus en las células humanas está sesgada hacia genes conductor cáncer de una manera altamente tipo específico de célula. Mientras gamma-retrovirus han sido ampliamente utilizados como herramientas de descubrimiento de gen de cáncer debido a su potencial mutagénico de inserción en sus huéspedes naturales, este enfoque requiere la tarea onerosa de recogida de múltiples tumores en etapa terminal a partir de modelos animales y genómica comparativa análisis para confirmar la relevancia de los resultados al cáncer humano [5-7,11,30].