Extracto
El cáncer colorrectal es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. La enfermedad es curable cuando se detecta en una etapa temprana. Sin embargo, la tasa de cumplimiento de las recomendaciones actuales de cribado sigue siendo pobre. Una prueba de sangre preciso y mínimamente invasivo que tiene el potencial para una mayor conformidad del paciente sería una adición bienvenida a los métodos actuales. Los datos recientes han demostrado que el perfil de expresión génica de células de sangre periférica puede reflejar estados de enfermedad y por lo tanto tienen valor diagnóstico. En este estudio, en todo el genoma de perfiles de expresión génica de las células de sangre periférica de 20 controles sanos y 20 pacientes con cáncer colorrectal se realizaron utilizando la tecnología PAXgene ™ y microarrays de Affymetrix GeneChip®. Hemos identificado una lista de 1.469 genes que son expresados diferencialmente entre los controles sanos y pacientes con cáncer. la anotación de genes y el análisis funcional de enriquecimiento revelaron que los genes están relacionados principalmente con las funciones inmunes. En particular, un conjunto de genes que pertenecen a las vías Toll-like receptor fueron hasta reguladas en los pacientes con cáncer colorrectal. Estos resultados proporcionan una nueva comprensión del perfil de expresión génica de sangre en el cáncer colorrectal. Nuestro resultado puede servir de base para un mayor desarrollo de biomarcadores de sangre para el diagnóstico y tratamiento del cáncer colorrectal
Visto:. Xu Y, Xu Q, L Yang, Liu M, YE X, Wu F, et al . Análisis de Expresión (2013) Gen de células de sangre periférica revela Toll-like receptor Camino La desregulación en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (5): e62870. doi: 10.1371 /journal.pone.0062870
Editor: Frank T. Kolligs, Universidad de Munich, Alemania |
Recibido: 17 Septiembre, 2012; Aceptado: March 29, 2013; Publicado: May 1, 2013
Derechos de Autor © 2013 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la empresa bioMérieux. Este estudio también fue apoyado por becas de la disciplina china Nacional de Clínicas Key (2011-2012) y la Comisión de Ciencia y Tecnología de Shanghai de la municipalidad de Shanghai (número 10DJ1400500). Como QX, FW, FL, XY, BM y XM son los empleados de la empresa bioMérieux y han contribuido a este trabajo, por lo tanto, como uno de los proveedores de fondos, la empresa bioMérieux desempeñó un papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Varios autores (QHX, FW, FL, XY y XM) son los empleados de bioMérieux (Shanghai) Co. Ltd. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Otros autores declaran no tener conflictos de interés.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en hombres y el segundo cáncer más común en las mujeres en todo el mundo. En 2008, más de 1.234.000 casos se diagnosticaron, y más de 608.000 personas murieron de la enfermedad [1]. Dado su lento desarrollo de las lesiones precancerosas y extraíbles desde las etapas tempranas curables, la detección de CRC tiene el potencial de reducir tanto la incidencia y la mortalidad de la enfermedad [2]. Las herramientas de detección disponibles incluyen la prueba de sangre oculta en heces (FOBT), la prueba de ADN en heces, la sigmoidoscopia flexible, la colonografía tomográfica computarizada y la colonoscopia. Diferentes estrategias de cribado están en su lugar en varios países. Sin embargo, el cumplimiento de las recomendaciones actuales de cribado de CCR sigue siendo pobre. La baja tasa de participación en el cribado del CCR se debe a una serie de factores, incluyendo la baja precisión de los métodos actuales de detección basado en las heces, la incomodidad del paciente y la mala aceptabilidad de los métodos basados en la endoscopia. Una prueba de sangre preciso y mínimamente invasivo que tiene el potencial para una mayor conformidad del paciente sería una adición bienvenida a los métodos actuales. Cuando una anormalidad ha sido detectado por el análisis de sangre, pruebas adicionales que comprenden el examen y la colonoscopia patológica se recomienda para confirmar si la anomalía detectada es CRC.
Nosotros y otros han demostrado previamente la posible utilización de perfiles de expresión génica muestras de sangre completa para la detección y diagnóstico de cáncer [3] - [9]. Antes de la manifestación clínica de la CRC, lo que normalmente lleva varios años, el anfitrión reacciona en la implantación de las células del cáncer a través del sistema inmune activado [10]. La activación del sistema inmune se refleja en cambios en los perfiles de expresión génica de las células de sangre inmunocompetentes, y estos cambios son detectables en la sangre periférica [11], [12]. En este estudio, hemos realizado perfiles de expresión génica de las células de sangre periférica utilizando la tecnología PAXgene ™ y microarrays de Affymetrix GeneChip®. Se identificó un gran número de genes expresados diferencialmente entre los controles y los pacientes de CRC. En particular, se informó de los perfiles de sobreexpresión de Toll-like receptor (TLR) vías de señalización relacionadas con los genes en el CCR para allanar el camino para estudios funcionales adicionales.
Materiales y Métodos
Los pacientes y recogida de muestras
Este estudio se llevó a cabo en la Universidad de Fudan de Shanghai Centro de cáncer (FDUSCC), Shanghai, china. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de FDUSCC para la investigación clínica. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. Veinte pacientes con CCR fueron reclutados en el Departamento de Cirugía Colorrectal, FDUSCC. Ningún paciente recibió radioterapia o quimioterapia preoperatoria. Los pacientes que sufren de CRC hereditaria o enfermedades inflamatorias del intestino (enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa) fueron excluidos de este estudio. Veinte voluntarios sanos sin síntomas gastrointestinales (diarrea y dolor abdominal) fueron reclutados a través FDUSCC. Todos los participantes tenían la extracción de sangre por lo menos siete días después de la colonoscopia. Para cada colección, 2,5 ml de sangre periférica se vio envuelta en un tubo de ARN de sangre PAXgene ™ (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Suiza) y se almacenaron a -80 ° C.
La extracción de RNA y Microarray Experimentos
ARN total fue extraído con el Sistema PAXgene ™ Blood RNA (PreAnalytiX GmbH). La cantidad de RNA total se midió con un espectrofotómetro a 260 nanómetros, y la integridad del ARN se evaluó mediante un RNA 6000 Nano LabChip® Kit en un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.). Todas las muestras se reunieron con el criterio de calidad: ARN Número Integridad & gt; 7,0 [13]. Cincuenta nanogramos de ARN total fueron transcritas inversa y linealmente amplificado como ADNc de cadena sencilla utilizando la tecnología Ribo-SPIA ™ con el Sistema WT-Ovation ™ ARN de amplificación (NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, EE.UU.), y los productos se purificaron usando el kit de purificación QIAquick ™ PCR (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania). Dos microgramos de ADNc amplificado y purificado posteriormente se fragmentaron con DNasa RQ1 RNasa libre (Promega Corp., Fitchburg, WI, EE.UU.) y se marcaron con biotina desoxinucleósidos trifosfato utilizando transferasa terminal (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, EE.UU.) y la GeneChip® Reactivo de marcado de ADN (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA, EE.UU.). El cDNA marcado se hibridó en el GeneChip® HG U133 Plus 2.0 de matriz en un horno de hibridación 640 (Agilent Technologies) a 60 vueltas por minuto a 50 ° C durante 18 horas. Después de la hibridación, los arrays se lavaron y se tiñeron según el protocolo de Affymetrix EukGE-WS2v4 utilizando una estación de Fluidics GeneChip® 450 (Affymetrix). Los arreglos fueron escaneadas con el escáner GeneChip ® 3000 (Affymetrix). Los datos de microarrays se han depositado en el repositorio público de ArrayExpress [14] con el número E-MEXP-3756.
Análisis estadístico
análisis de datos de expresión génica se realizaron utilizando el software R y paquetes del proyecto Bioconductor [15] - [17]. Los datos brutos se recogieron de CEL archivos y preprocesados utilizando el algoritmo robusto chip multi media (RMA) para la corrección de fondo, cuantil normalización y la mediana resumen esmalte [18], [19]. Los datos de la sonda de nivel-set fueron log2-transformado. Además, se aplicó un enfoque de filtrado basado en bioinformática utilizando la información en la base de datos Entrez Gene [20]. Se eliminaron los conjuntos de sonda sin anotación Entrez Gene ID. Para sonda de varios conjuntos de mapeo a la misma Entrez Gene ID, sólo probarán conjuntos que muestran el mayor rango entre cuantil se mantuvieron, y el resto eran excluidos.
Importancia de Análisis de Microarrays método (SAM) [21] se utilizó para identificar los genes expresados diferencialmente entre los grupos de control y CRC. Para los estudios de expresión génica que implican microarrays, se ha convertido en una práctica común para centrarse en el control de la tasa de falso descubrimiento (FDR), que estima la proporción esperada de rechazos incorrectos entre las hipótesis rechazadas [22], [23]. Para minimizar los falsos positivos, nos fijamos el umbral del FDR a 0,01 para todas las comparaciones. Ontología de genes (http://www.geneontology.org) [24] y la vía de análisis de la pantera (http://www.pantherdb.org/pathway) [25] se realizaron con la herramienta bioinformática GENECODIS [26] y el software MetaCore ™ (GeneGo Inc., EE.UU.).
Expresión génica Análisis cuantitativo por PCR en tiempo real
Para cada muestra, 200 ng de ARN total fue inverso-transcrito en cDNA utilizando Primer Guión ™ transcriptasa inversa (Takara, Dalian, china). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó por el sistema LightCyclerH 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) en placas de 96 pocillos utilizando SYBR Premezcla Ex Taq ™ (Takara, Dalian, China). Primer secuencias de genes diana se proporcionan en la Tabla S1.
CSNK1G2 gratis (caseína quinasa 1, gamma 2) habían sido previamente demostrado que se expresa de forma estable en la sangre entera humana [27], y por lo tanto se utilizó como control interno. La cuantificación relativa de la expresión de ARNm se calculó utilizando el método descrito por Vandesompele
et al
[28]. Las comparaciones de los perfiles de expresión de genes entre dos muestras se evaluaron utilizando la prueba t de Welch. Las pruebas de significación fueron de dos caras, y un
P valor
por debajo de 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Nuestro estudio incluyó a 20 pacientes con CCR y 20 controles sanos. Todos los participantes eran chinos, entre ellos 18 hombres y 22 mujeres, con una edad mediana de 58 años (rango, 42-69 años). Las distribuciones de edad y sexo fueron equilibrados entre los grupos de control y CRC. Los tumores se clasifican de acuerdo al sistema de tumor-nódulo-metástasis (TNM). Dos de los pacientes con CCR en estadio I, 7 estaban en estadio II, estadio III eran 6 y 5 fueron en estadio IV. Las especificaciones detalladas de los pacientes se describen en la Tabla 1 y la Tabla S2.
La reciente liberación de los microarrays HG-U133plus2 ofrece 54.000 conjuntos de sondas para el cribado de 38.500 genes humanos. Frente a una cantidad tal abrumadora de información, fue necesario reducir el número total de genes analizados a un número manejable de genes con esquemas de anotación y visualización uso biológicas verificadas para facilitar el reconocimiento de patrones en los datos [29]. por tanto, se les practicó un procedimiento de filtrado basado en bioinformática para resumir los conjuntos de sonda a nivel del gen y excluir a aquellos conjuntos de sonda con anotaciones biológicas de bajo grado. Después de la filtración, los perfiles de expresión de genes de 9.529 únicos en 20 pacientes con CCR y 20 controles fueron seleccionadas para el análisis de aguas abajo.
diferenciales expresan los genes (DEGs) entre los grupos de control y de CRC se identificaron con el análisis SAM (FDR = 0,01; type = "Dos clases no apareado"; estadística de prueba = "t-estadístico"; número de permutaciones = 1,000). En total, se encontraron 881 y 588 genes que ser arriba y hacia abajo-regulada en los pacientes con CCR. El análisis funcional de enriquecimiento de ontología de genes y la vía de la pantera se llevaron a cabo con un nivel de significación de 0,05 para el ajuste
valor de p
. El análisis de la vía Pantera reveló una lista de 22 vías canónicas que fueron significativamente enriquecido en la lista de DEG. Como era de esperar, las vías asociadas con las funciones inmunes específicas están bien representadas y altamente significativa, incluyendo la activación de células B, la activación de células T, vía de señalización de interferón-gamma, y vía de señalización de la interleucina. Paralelamente, varias vías relacionadas con la angiogénesis, incluyendo el PDGF, VEGF y FGF vías de señalización también fueron excesivamente significativa. El top ten de las vías moleculares asociados y los genes relevantes se muestran en la Tabla 2. Además de identificar las vías canónicas significativas, también comprobamos los genes asociados con las categorías funcionales. El análisis de ontología de genes reveló un total de 74 categorías de procesos biológicos que fueron excesivamente significativa, incluyendo la respuesta inmune innata, la transducción de señales, transporte de proteínas, proceso de apoptosis, la fosforilación de proteínas y la reproducción viral. Los diez principales categorías de procesos biológicos asociados se enumeran en la Tabla 3.
Sorprendentemente, las vías de señalización TLR fueron la partida más significativa enriquecido tanto en la vía Panther y análisis IR (GO0002224: Toll como vía de señalización del receptor,
P =
1.7E-8; GO0002755: vía de señalización del receptor tipo toll dependiente de MyD88,
P =
1.1E-7; GO0034142: toll-like receptor 4 vía de señalización,
P =
1.1E-7 y Panther00054: vía de señalización de los receptores Toll,
P =
1.1E-06). El vías que van desde el software MetaCore ™ señalización TLR están representados gráficamente en la Figura 1. Como se observa en el gráfico, múltiples TLR (
TLR1, TLR2, TLR4, TLR6
y
TLR8
), así como sus objetivos de abajo, fueron significativamente regulado en los pacientes con CCR. Además, también se identificaron los ligandos endógenos de los TLR, incluyendo
HSP70
y
HMGB1
, que se ha demostrado que un máximo de regular
TLR2
y
TLR4
en las superficies de células tumorales e inducir la progresión tumoral y la metástasis [30], [31]. Los TLRs activados reclutan entonces
MyD88
, lo que lleva a la activación subsiguiente de abajo objetivos, incluyendo
NF-kB
, proteína asociada mitógenos (MAP) quinasa y factores reguladores de interferón [32].
la ilustración vía se generó y se vincula con los datos experimentales disponibles en la suite MetaCore ™. Doce genes (
TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR8, MYD88, MD-2, Beclin 1, TAB2, TAK1, IRAKM
y
IKB) con descuento que hasta reguladas en los pacientes con CRC están vinculados a Toll-like receptor vías de señalización y se puede visualizar en el mapa como figuras termómetro similar. Hasta-Ward termómetros tienen un color rojo e indican los niveles regulados hasta de la expresión génica en los pacientes con CCR.
Cuantitativo PCR en tiempo real es generalmente considerado como el ensayo "estándar de oro" para medir gen expresión y se utiliza a menudo para confirmar los hallazgos de los estudios de microarrays [33]. por tanto, se seleccionaron seis vías de señalización TLR genes relacionados (
IRAK3, MD2
,
TLR1, TLR2, TLR4
y
TLR8
) para la validación cuantitativa en tiempo real PCR. Los resultados, como se muestra en la Tabla 4, indican que los perfiles de expresión de genes determinados por la hibridación de microarrays y análisis cuantitativa en tiempo real fueron altamente comparables. Los perfiles de genes de sobreexpresión en los pacientes con CRC se confirmaron en los datos de PCR en tiempo real.
Discusión
La detección temprana del CRC es crucial para el éxito del tratamiento y la supervivencia del paciente. Sin embargo, la falta de cumplimiento sigue siendo el mayor reto actualmente limitando la eficacia del apantallamiento CRC. El rico contenido de diversos elementos celulares y moleculares en la sangre, que proporcionan información sobre el estado de salud de un individuo, lo convierten en un compartimento ideal para desarrollar pruebas no invasivas para la detección de CCR [34]. En este estudio, se realizó el perfil de expresión génica global de muestras de sangre periférica recogidas de 20 controles y 20 pacientes de CRC. Hemos identificado una lista de 1.469 genes expresados diferencialmente de consenso que entre los controles y los CRC. Nuestros resultados son consistentes con estudios previos [3], [5], [9] y muestran que la mayoría DEGs están involucrados en la respuesta inmune, así como la apoptosis celular, la transducción de señales, transporte de proteínas y regulación de la expresión génica.
Tal vez el resultado más sorprendente para salir de los datos es la sobreexpresión de la señalización TLR genes relacionados con la vía en los pacientes con CCR. TLR, los mamíferos homólogos de la proteína de peaje Drosophila, son la familia mejor caracterizada de los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) [35]. Hasta la fecha, TLRs 1-10 han sido identificados en los seres humanos [36]. TLRs jugar un papel crucial en la respuesta inmune innata y la posterior inducción de la respuesta inmune adaptativa frente a la infección microbiana o lesiones de tejidos [37], [38]. Estudios recientes muestran que TLRs funcionales se expresan no sólo en las células inmunes, sino también en las células cancerosas, lo que plantea un papel de TLRs en tumor biología [39], [40]. Una creciente órganos del cuerpo de evidencia han sugerido que los TLR actúan como una espada de doble filo en las células del cáncer [41]. Por un lado, los TLR desempeñan papeles cruciales en la activación de las respuestas inmunes antitumorales con el fin de inhibir la progresión del tumor. Por otra parte, la desregulación de señalización TLR puede proporcionar un microentorno que es necesario para las células tumorales proliferen y evadir la respuesta inmune [42].
En particular, ha habido varios estudios que informan de una asociación entre TLRs y colorrectal neoplasia. Fukata
et al.
Mostró que TLR4 se sobreexpresa en la neoplasia colorrectal asociado con la inflamación del ratón. Los ratones deficientes en TLR4 estaban protegidas significativamente de la carcinogénesis de colon [43]. Wang
et al.
Reportó altos niveles de expresión de TLR4 y MyD88 asociados a la metástasis del hígado y de mal pronóstico en pacientes con CRC [44]. Además, TLR4 y IL-6 expresión en el microambiente tumoral se asociaron con la presencia de adenocarcinoma, y los niveles más altos de expresión TLR4 en el estroma de los tumores se observó con progresión de la enfermedad [45].
A medida que la primera línea de defensa inmune, células de sangre periférica se ha demostrado para expresar todos los TLRs y muestran niveles más altos de TLR mRNAs en comparación con otros tejidos [46]. Postulamos que la sobre regulación de TLR genes relacionados de señalización en la sangre periférica es probablemente debido tanto a la infiltración de células inflamatorias TLR-expresan y la sobre regulación de la expresión del receptor en estas células que se produce en respuesta a estímulos de crecimiento del tumor. Se necesita más investigación para entender la relación mecanicista y los significados biológicos de la sobreexpresión de genes relacionados con las vías de TLR en pacientes con CCR. Dado el uso terapéutico de los agonistas de TLR se ha investigado en varios modelos de cáncer [41], el estudio sistemático de las funciones TLRs 'puede contribuir sustancialmente al desarrollo de nuevas dianas para el diagnóstico y tratamiento de la CRC.
En conclusión , mostramos que el control de la expresión génica en los resultados de sangre en los perfiles de transcripción diferenciados entre los controles y los pacientes de CRC. Por lo tanto, basado en microarrays de perfiles de expresión génica de sangre representa una gran promesa para el desarrollo de nuevos biomarcadores para la detección de CRC. Los estudios futuros deben incluir más muestras para la identificación y validación de biomarcadores. Por otra parte, dado que el CRC se considera que es una enfermedad genética y epigenética heterogénea [47], también sería interesante investigar el perfil de expresión de genes en la sangre de los diferentes subtipos, que puede proporcionar una nueva comprensión de la CRC.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Primer secuencias de genes relacionados con TLR y
CSNK1G2
gen de referencia
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062870.s001 gratis (DOCX)
Tabla S2.
información clínica detallada de los controles y los pacientes de CRC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062870.s002 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Deseamos agradecer a todos de los participantes en este estudio por sus contribuciones. Apreciamos enormemente los esfuerzos de Wencui Huang y sus colegas en el Departamento de Cirugía Colorrectal, Universidad de Fudan de Shanghai Centro de Cáncer, y su excelente trabajo en la recogida de muestras.