Extracto
Los biomarcadores derivados de los datos de perfiles de expresión génica puede tener una alta tasa de falsos positivos y debe ser rigurosamente validado utilizando conjuntos de datos clínicos independientes, que no siempre están disponibles. Aunque los sistemas de modelos animales podrían proporcionar conjuntos de datos alternativos para formular hipótesis y limitar el número de firmas que ser probado en muestras clínicas, el poder predictivo de este tipo de enfoque no se ha probado. El presente estudio tiene como objetivo analizar las firmas moleculares de cáncer de hígado en un modelo de ratón c-MET-transgénico e investigar su relevancia pronóstica de carcinoma hepatocelular humano (HCC). Las muestras de tejido se obtuvieron de tumor (TU), adyacente no tumoral (AN) y hepática normal distante (DN) en Tet-operador regulado (TRE) c-MET ratones transgénicos humana (n = 21), así como de una cohorte chino de 272 VHB y 9 pacientes con HCC VHC asociada. Todo el genoma de perfiles de expresión de microarrays se realizó en Affymetrix chips de expresión de genes, y se evaluaron las significaciones de pronóstico de genes firmas de expresión a través de las dos especies. Nuestros datos revelan paralelismos entre el ratón y los tumores hepáticos humanos, incluyendo la baja regulación de las vías metabólicas y de regulación de los procesos del ciclo celular. Los tumores de ratón fueron más similares a un subconjunto de muestras de pacientes caracterizados por la activación de la vía de Wnt, pero distintivo en las señales de la vía de p53. Del potencial utilidad clínica, hemos identificado un conjunto de genes que se regulan a la baja en los dos tumores de ratón y humanos HCC tienen poder predictivo significativo en la supervivencia global y libre de enfermedad, que fueron altamente enriquecido para las funciones metabólicas. En conclusión, este estudio proporciona evidencia de que un modelo de enfermedad puede servir como una posible plataforma para la generación de hipótesis para ser probado en los tejidos humanos y pone de relieve un método eficiente para la generación de firmas de biomarcadores antes se han iniciado ensayos clínicos extensos.
Visto : Ivanovska I, Zhang C, Liu AM, Wong KF, Lee NP, Lewis P, et al. (2011) Las firmas gen derivado de un cáncer de hígado de ratón Modelo c-MET-Driven predecir la supervivencia de los pacientes con carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 6 (9): e24582. doi: 10.1371 /journal.pone.0024582
Editor: Wanjin Hong, Instituto de Biología Molecular y Celular, Singapur
Recibido: May 9, 2011; Aceptado: August 14, 2011; Publicado: 16 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Ivanovska et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. II, CZ, PL, UP, DB, CB, MS, mM, Mac, y HD se dedican a este trabajo como empleados de Merck & amp; Co., Inc., una compañía farmacéutica líder; aparte de eso, todos los demás autores describen intereses en competencia. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El carcinoma hepatocelular (HCC) es el quinto cáncer más común en todo el mundo, con más de 300.000 nuevos casos por año en china y con una incidencia creciente en los países occidentales [1]. La resección quirúrgica o trasplante de hígado son las únicas opciones de tratamiento para los pacientes con HCC que tiene una tasa de supervivencia a 5 años a 50-60 [2]%. Desafortunadamente, alrededor del 80% de los pacientes son diagnosticados en etapas avanzadas de presentación y son esencialmente inservibles y resistente a la mayoría de las quimioterapias convencionales [3]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar marcadores de pronóstico de HCC [4], [5], [6], [7], [8], [9] y el desarrollo de terapias dirigidas a través de inhibidores de moléculas pequeñas convencionales y /o RNAi terapéutica [10], [11], [12], [13], [14].
Varios modelos de ratones transgénicos complejos de cáncer humano se han sugerido para imitar con precisión la fisiopatología y las características moleculares de los tumores malignos humanos [15], pero las comparaciones entre especies de expresión génica de los modelos animales de enfermedades humanas y no están disponibles para la validación [16]. HCC se desarrolla en el ser humano como una enfermedad progresiva de una predisposición cirrosis causada por la hepatitis B o infección por el virus C, alcoholismo crónico, o exposición a la aflatoxina. Como resultado, el tejido tumoral HCC humano está rodeado de tejido cirrótico premaligna [17]. Un modelo de ratón transgénico de HCC ha sido desarrollado por Bishop y sus colegas en el que los tumores son inducidos por la expresión específica del hígado, regulado por tetraciclina (TRE) de un transgén quinasa c-MET humano, una lesión genética comúnmente asociado con tumores de hígado humano [18 ]. Los tumores que surgen debido a c-MET sobre-expresión en el ratón se asemejan HCC humano a nivel de la histología [19]. La activación de mutaciones en β-catenina que conducen a la regulación positiva de la vía de señalización Wnt, otra característica común de HCC humano, se observan con frecuencia en estos tumores. Sin embargo, la información sobre supresor de tumores TP53 gen, que es comúnmente mutado en HCC humano [20], y otros objetivos de genes potenciales en este modelo de sistema no están disponibles. Por otra parte, el carácter molecular del tejido no maligno adyacente que rodea los tumores no está bien estudiado y caracterizado [21]. Una mejor comprensión de cómo el modelo de ratón se compara con la enfermedad humana a nivel molecular, por tanto, es crucial para el diseño y la interpretación de los estudios de eficacia de las terapias.
Los biomarcadores derivados de microarrays de expresión de perfiles de datos pueden estar sujetos a alta falsos tasa positiva debido a múltiples hipótesis pruebas inherente a trabajar con un gran número de genes y combinaciones de genes. Una firma biomarcador predictivo o conjunto de genes determina a partir de un conjunto dado de muestras (el conjunto de entrenamiento) debe ser validado con datos de muestras independientes (el conjunto de prueba /validación) [22], [23]. Para alcanzar este objetivo puede ser un reto como conjuntos de datos independientes, especialmente los de las muestras clínicas tratadas de una manera similar, son escasos o requiere inversión de tiempo para acumular. Una solución alternativa a esta limitación es formular y probar hipótesis utilizando datos de un modelo de sistema.
En este estudio, se realizó un perfil molecular de los tejidos normales y tumorales del hígado desde el modelo de ratón impulsada c-MET, a entender los cambios moleculares en estos ratones. Se determinó la bondad del modelo se aproxima a la enfermedad humana y confirmó la expresión de los objetivos específicos de cáncer. Se utilizaron los datos derivados del modelo de c-MET para generar firmas distintivas del tumor (TU) de no tumoral adyacente (AN) y de tipo salvaje (WT) los tejidos normales, y probó el poder pronóstico de estas firmas en un conjunto de datos de HCC humano.
Métodos
Ética
la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong /hospital de Hong Kong Autoridad West Cluster (HKU /HA HKW IRB) aprobó este estudio , y cada paciente dio su /su consentimiento informado por escrito en el uso de las muestras clínicas para la investigación. Todos los estudios con animales fueron totalmente aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Merck Boston (números de protocolo:#07-08-044 y 08-08-041 #) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de ética animal
El modelo de c-MET HCC ratón
Los ratones utilizados en este estudio se han descrito (tabla 1) [18], [24]. Todos los ratones fueron en un fondo genético FVB. Los ratones que sobreexpresan c-MET humana lleva una copia del transgén LAP-tTA (el promotor LAP específica del hígado conduciendo el transactivador Tet-VP16) y una copia del transgén TRE-c-MET (Tet-operador regulado gen c-MET humana ). La presencia de ambos transgenes resultados en la expresión del gen c-MET humano específicamente en y por todo el hígado (que se refiere de ahora en adelante como la cepa TRE-c-MET). Siete ratones de cada cepa fueron sacrificados a las seis (TRE-c-MET), siete (LAP-TTA) o 14 (TRE-c-MET) semanas de edad. Se recogieron hígado normal o tejido de tumor de hígado (dos por ratón) y se procesaron para perfiles de expresión génica en el Laboratorio de Expresión Génica Rosetta. Además, se recogió tejido hepático adyacente del tejido no involucrado junto a la frontera del tumor en el lóbulo hepático portadores de tumores. tejido hepático a distancia fue de un lóbulo del cojinete no tumoral o de áreas al menos 1 cm de distancia del tumor. trabajos con animales se realizaron en el laboratorio acreditado por la AALAC de acuerdo con las directrices institucionales de ética animal.
cohortes de pacientes y muestras clínicas
A todos los pacientes que se inscribieron en este estudio fueron sometidos a una hepatectomía curativo para CHC en el hospital Queen Mary, Pokfulam, Hong Kong entre 1993 y 2007 [3], [25]. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ética Humana y cada paciente dio su /su consentimiento informado por escrito sobre el uso de las muestras clínicas para la investigación. El tejido hepático que se obtuvo de los pacientes en el momento de la cirugía curativa fue inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su utilización.
Microarray y análisis
El ARN total fue extraídos y purificados a partir de las muestras de hígado clínicos (n = 272 tumor HBV-HCC (TU), 257 HBV-HCC-tumor adyacente normal (AN), 9 HCV-HCC tumor (TU).
9 VHC HCC tumor adyacente normal (AN)) utilizando el Sistema de Aislamiento de ARN total SV96 (Promega) de acuerdo con un protocolo personalizado automatizado. El ARN extraído se cuantificó usando RiboGreen RNA cuantificación reactivo (Invitrogen) y su calidad se evaluó utilizando RNA Agilent 6000 Pico Kit (Agilent, Santa Clara, CA) en un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Sólo aquellas muestras que pasan los umbrales mínimos de cantidad y calidad (RIN & gt; 6) fueron amplificados y marcados, utilizando el protocolo Ovation WB (NuGEN Technologies, San Carlos, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 50 ng de ARN total se amplificó usando la tecnología Ribo-SPIA (NuGEN Technologies), fragmentado y marcado con biotina usando el FL-Ovation cDNA biotina Módulo V2 (NuGEN Technologies). Los ARNc amplificados resultantes se hibridaron con Affymetrix chips de expresión génica (Rosetta humano encargo Affymetrix 1.0, Affymetrix, Santa Clara, CA) [26]. Las imágenes se analizaron utilizando el paquete estándar de Affymetrix GeneChip Software operativo (GCOS) (www.affymetrix.com/products/software/specific/gcos.affx) y eran más normalizado y se procesan para obtener las intensidades de secuencia basada utilizando el algoritmo de RMA como se aplica en Herramientas eléctricas Affymetrix (http://www.affymetrix.com/support/developer/powertools). Los datos utilizados para este análisis pasaron dos niveles de control de calidad (QCS) (nivel de matriz utilizando Affymetrix parámetros recomendados, y de proyecto en la exclusión de las matrices de valores atípicos y las matrices con los principales patrones asociados con los parámetros de procedimiento conocidas). Log10 (ratio) de cada gen en cada muestra se calcula restando media de log10 (intensidad) de ese gen en todas las muestras no tumorales adyacentes, para hacerlos comparables con los datos del modelo de ratón c-MET donde las referencias son la piscina de de tipo salvaje tejidos del hígado del ratón. los datos del perfil de expresión génica en bruto se depositaron al GEO con los siguientes números de acceso: GSE25142 (derivado del modelo de ratón c-Met) y GSE25097 (derivado de HCC humano)
Tumor firma de los perfiles de ratón
se utilizó un modelo lineal para definir la firma del tumor en ratones experimento c-MET, por ejemplo, para una comparación entre el TE vs. tumoral, se identificaron 6277 probesets ratón con ANOVA valor de p & lt; 0.001. La tasa de falso descubrimiento (FDR) que aquí se estima en 0.62% a partir de 1000 permutaciones. Entre los probesets firma, 3114 mostraron abajo tumor y 3163 regulaciones up-tumor en comparación con WT. entonces la firma de tumor de ratón fue asignada a probesets humanos en el chip Affymetrix humana. También se identificó la firma de tumor de ratón a partir de comparaciones de no tumoral adyacente vs. tumor y distante no tumoral vs tumor, mediante el análisis ANOVA.
anotación Biológica y el enriquecimiento geneset prueba
Hemos recopilado muchos bases de datos incluyen conjuntos de genes con funciones biológicas conocidas o propiedades de una variedad de públicos (IR componentes celulares, funciones moleculares, los procesos biológicos, KEGG vías, SwissProt Keywoards, etc.), con licencia (GeneGo, el ingenio biosets NextBio, etc.), y fuentes de propiedad (compuesto interna, siRNA, el cuerpo perfilado atlas, etc.). Estos conjuntos de genes anotados fueron utilizados en el ensayo de enriquecimiento. Los valores de p de enriquecimiento (la probabilidad posibilidad de observar la superposición de genes entre la entrada y la geneset geneset en la base de datos) se calcula utilizando la distribución hipergeométrica [27].
poder pronóstico de las firmas
para estimar el poder pronóstico de cada una de las firmas de ratón, la firma fue asignada a probesets humanos y luego se trata como un MetaGene [28], [29]. Es decir, el nivel de expresión de la MetaGene en muestras de HCC humanos se calcula promediando log (ratio) de todos los genes mapeados desde el ratón arriba-abajo o regulados firmas. Las muestras de HCC humanos fueron clasificados según el nivel de expresión de la MetaGene y luego se divide en dos grupos iguales por el valor de la mediana (para evitar el exceso de montaje, no optimizar el umbral). Los valores de P log-rank entre estos dos grupos se calcularon mediante la prueba de log-rank usando el tiempo de supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad, respectivamente.
Resultados
cambios en la expresión génica global del ratón y HCC humano
para determinar la expresión del gen específico de tumor en el modelo de ratón c-MET de HCC, se compararon los tejidos de ratones portadores de tumores a varios tejidos de control incluyendo el tejido hepático normal adyacente y distante de los ratones portadores de tumores, salvaje -type tejido del hígado y el tejido hepático a partir de dos líneas parentales de transgenes individuales (Tabla S1). Se utilizó tejido hepático de tipo salvaje (pool virtual a partir de 7 ratones) como línea de base y realizó la agrupación sin supervisión de los genes expresados diferencialmente. Se encontró que los tumores tenían un patrón de expresión distinto (Figura 1A). Para caracterizar la naturaleza molecular de los genes expresados diferencialmente, se realizó la ontología de genes anotación biológica [30] (véase la información complementaria) en cada conjunto de genes y se encontró que las reguladas por los genes fueron enriquecidos para los procesos metabólicos, mientras que los genes regulados fueron enriquecidos para el ciclo celular y términos relacionados con el citoesqueleto (Tabla S2). los cambios de expresión génica en humanos HCC mostraron GO anotaciones similares (Tabla S3), lo que indica que en un nivel de expresión génica global, el modelo de ratón c-MET se aproxima HCC humano.
(A) análisis de la expresión génica global reveló a tumores cambios de expresión génica específicos caracterizados por los genes regulados hacia abajo en los tumores que fueron enriquecidos para los procesos metabólicos (caja blanca) y los genes regulados hasta en los tumores que se enriquecieron durante el ciclo celular y el citoesqueleto de actina (amarillo). los tejidos no tumorales adyacentes a o distantes de los tumores mostraron patrones de expresión similares se fueron intercaladas en el mapa de calor generada por la agrupación sin supervisión, con las muestras de la misma agrupación de los animales juntos. Las barras verticales a la derecha de cada mapa de calor representan un código de colores de las muestras que corresponden a la leyenda en cada panel. (FVB-WT, púrpura) El tejido del hígado de los animales de control; (LAP-TTA, azul oscuro y TRE-c-MET, naranja) tejido hepático a partir de cepas parentales transgén único; (C-MET TU, verde) tejido tumoral de doble transgén, animales portadores de tumores; (C-MET AN, azul claro) tejido hepático no tumoral de doble transgén, animales portadores de tumores adyacentes al tumor; (C-MET DN, rojo) tejido hepático no tumoral de doble transgenes, los animales portadores de tumores distantes de tumor. El mapa de calor representa la agrupación sin supervisión de los genes expresados diferencialmente (doble cambio ≥1.25, p & lt; 0,01, Cluster Algoritmo: Aglomerativo, Similitud Medida: correlación coseno). (B) La mayoría de los genes del hígado enriquecida se redujeron regulado en los tumores c-MET, en consonancia con la pérdida de la función hepática. Para este análisis, se seleccionaron los 400 genes con el mayor factor de cambio de los genes del hígado enriquecida identificados por Su y sus colegas [18]. Un pequeño subconjunto de los genes que son regulados hasta (cajas amarillas) puede contener biomarcadores útiles de la presencia del tumor. leyenda de colores -0.5 & lt; log
10 (relación) & lt; 0,5. (C) Comparación de ratón c-MET y perfiles de tumores de HCC humanos. Humanos y de ratón muestras tumorales co-agrupados indicando los patrones de expresión de genes similares (recuadro rojo). Los genes expresados diferencialmente se pueden dividir en tres grupos sobre la base de sus patrones de regulación específicos (cajas amarillas) y GO anotación. (HCC Adj) no tumoral adyacente humano; (HCC TU) de tumor humano; (C-MET TU) de tumor de ratón; (C-MET Adj /Dis) del ratón adyacente y distante normal. El mapa de calor representa la agrupación sin supervisión de los genes expresados diferencialmente (doble cambio ≥1.25, p & lt; 0,01, Cluster Algoritmo: Aglomerativo, Similitud Medida: correlación coseno).
Se realizó la agrupación sin supervisión y se encontró que la perfiles de expresión de muestras de tejidos normales adyacentes y distantes se intercalan, separado por el animal de la que se tomaron y distinto de los perfiles de tumor (Figura 1A). Este resultado indica que la proximidad del tumor no altera significativamente la expresión génica en el tejido hepático normal. Sin embargo, pueden existir diferencias sutiles entre las muestras adyacentes y distantes.
A pesar de que tanto VHC y VHB-infección se ha demostrado que causa HCC, infecciones por VHB fueron predominantes en esta cohorte (272 tumores de HCC-VHB y VHC 9 tumores -HCC). Para identificar las posibles diferencias moleculares entre VHC y HCC infectadas por el HBV, se analizaron todas las muestras de VHC disponibles en esta cohorte (nueve) y los compararon con un número igual de muestras de HBV seleccionados al azar (nueve). Las muestras de HBV fueron distribuidos al azar en un clúster sin supervisión de todas las muestras de tumor (datos no mostrados), indicando que no estaban sesgadas hacia un perfil molecular particular. No se observó ninguna diferencia molecular consistente entre estas muestras (datos no mostrados).
Para determinar si existen paralelismos entre HCC humanos y de ratón a nivel del gen, se realizó una comparación directa del ratón y perfiles de HCC humanos. Las muestras de ratón se normalizaron contra el tejido de tipo salvaje hígado (piscina virtual a partir de 7 ratones) y las muestras humanas se normalizaron frente a una media de todas las muestras no tumorales adyacentes. agrupamiento no supervisado de las muestras humanas y de ratón mostraron que los perfiles moleculares de los dos conjuntos de tumores estaban más estrechamente relacionados entre sí que a sus tejidos no tumorales adyacentes afines (Figura 1B, la caja roja), revelando una firma molecular específico de tumor.
Entre los genes expresados diferencialmente en la mayoría de los tumores de ratón y humanos, hemos identificado tres subconjuntos de genes con características distintas (Figura 1B, cajas amarillas). Dos grupos mostraron patrones de expresión similares en ambos tipos de tumores: genes regulados en ambos tipos de tumores fueron enriquecidos para los procesos metabólicos, mientras que los genes regulados hasta en ambos tipos de tumores fueron enriquecidos para los procesos del ciclo celular. Los genes regulados hacia abajo específicamente en los tumores humanos se enriquecieron durante los procesos de respuesta inmune, lo que refleja una distinción molecular que puede apuntar a diferencias en los mecanismos de progresión tumoral. En resumen, la comparación de los perfiles moleculares de HCC humanos y de ratón reveló amplias paralelos a nivel de la expresión génica. Sin embargo, cada conjunto de tumores también se caracteriza por patrones de expresión de genes específicos
.
El descenso de regulación de genes implicados en los procesos metabólicos en los tumores sugiere que las funciones hepáticas se disminuyen o se haya deteriorado. Para explorar la identidad del hígado en estos tumores más, se analizó la expresión de los genes del hígado enriquecido en [31], [32], [33] y se encontró que estaban regulados hacia abajo en las muestras tumorales (Figura 1C), en consonancia con la pérdida de la identidad y la función del hígado con la progresión tumoral.
actividad de las vías de oncología en el CHC
para obtener una mejor comprensión de la actividad de las vías de señalización relacionadas con la oncología en el modelo c-MET de HCC, nos análisis específico realizado de la expresión cambia el uso de firmas vía definidas previamente. La firma /β-catenina vía consiste en genes-y abajo-regulados por siRNAs β-catenina en LDN-1 células de carcinoma de colon [34]. Hemos encontrado actividad elevada Wnt vía (figura 2A), consistente con las mutaciones activadoras de β-catenina detectado con frecuencia en estos tumores y la activación de la vía de Wnt en un tercio de los HCC [35]. agrupamiento no supervisado de las muestras de ratón y humanos mostró una relación entre un subconjunto de perfiles de HCC humanos y las muestras tumorales de ratón (Figura 2B), lo que indica que el ratón c-MET puede ser un modelo útil para el estudio de pacientes con HCC con la señalización de Wnt activada. Curiosamente, los perfiles de todo el genoma de los tumores de ratón y el subconjunto de HCC humano con expresión de la vía Wnt hasta reguladas no se correlacionaron (correlación = 0,07). Esto está en contraste con la correlación significativa observada para el centrado conjunto de genes vía de señalización Wnt, lo que indica que las similitudes se limitan a vías específicas.
(A) la vía Wnt /β-catenina fue hasta reguladas en el tumores de ratón, medidas por el /β-catenina gen firma Wnt [34]. Los genes en cada firma se indican en la parte superior de cada mapa de calor. Las muestras están en el eje Y y su tejido de origen se indica en la barra de un código de colores vertical a la derecha de cada mapa de calor. leyenda codificados por colores para los paneles A y C se encuentra entre los paneles. Todas las abreviaturas son como en la Figura 1. (B) El /β-catenina vía Wnt fue hasta reguladas en un subgrupo de pacientes con HCC humanos como lo ilustran las tres muestras humanas (HCC TU, púrpura) que co-racimo con el ratón HCC muestras (c-MET TU, amarillo). leyenda codificados por colores para los paneles B y D se encuentra entre los paneles. (C) La vía de TP53 fue hasta reguladas en los tumores de ratón (c-MET TU, verde). (D) Sobre regulación de la vía de TP53 era específico para el modelo de ratón (c-MET TU, amarillo) y no se observó en humanos HCC (HCC TU, púrpura).
actividad de la vía de p53 en el modelo de ratón HCC es de interés como
TP53
mutaciones son comunes (en ~27% de los casos) en humanos HCC [20]. Se utilizó una firma vía de p53 [36] y se observó la regulación de la vía de p53 en los tumores de HCC ratón, lo que demuestra una diferencia de HCC humano (Figura 2C). En contraste, las muestras de HCC humanos no mostraron vía de p53 sobre regulación (Figura 2D), presumiblemente debido a mutaciones o otros mecanismos de p53-inactivación. Estos resultados indican que, aunque el modelo de c-MET ratón puede replicar un subconjunto de los HCC humanos en varios aspectos, existen diferencias moleculares y deben tenerse en cuenta cuando se analizan los datos obtenidos a partir de este modelo, en particular para los objetivos de la vía p53. Esto se debe en gran parte a la situación de tipo silvestre del gen p53 en el modelo de ratón. Por lo tanto, especial atención y consideración deben ser pagados cuando se compara el modelo de la enfermedad humana de especies cruzadas. La vía de señalización de Wnt y de la vía de p53 son muy comunes en el desarrollo del cáncer. la expresión génica firmas de ambas vías en el modelo de tumor de ratón y humanos HCC se presentan en la Figura S2.
derivadas de ratón genes firmas tienen poder predictivo para la supervivencia de los pacientes con HCC humanos
Se identificaron genes de las firmas en los tumores de ratón comparando el patrón de expresión del gen del tumor de los tres tejidos no tumorales indicadas en la Tabla S1 (de tipo salvaje (WT), no tumoral adyacente (AN) y el hígado distante normal (DN)). Se utilizó el adyacente vs. firma tumor debido a que es más análoga a la comparación de las muestras clínicas en nuestro estudio. El distante frente a la firma del tumor proporciona más información acerca de cualquier efecto que la proximidad del tumor puede ejercer sobre el tejido adyacente. Por último, dado que tanto la adyacente y los tejidos distantes también expresan el transgén c-MET, se incluyeron las de tipo salvaje frente a la firma tumor para identificar cualquier cambio de expresión de genes conducidos-c-MET.
Para cada par comparación de tejido -wise, se identificaron grupos de genes que estaban abajo o hasta reguladas en el tumor y generamos mapas de calor que utilizan estos genes y el tumor de ratón c-MET y de tipo salvaje muestras FVB-WT que se muestran en la figura 3A y la figura S1 . a continuación, proyectamos esas firmas a los datos de HCC humanos y se determinó su capacidad de predicción de supervivencia y su patrón de expresión. se utilizó toda la cohorte de pacientes en este análisis y las muestras humanas fueron divididos en dos grupos basados en el registro de promedio (relación) de todos los genes en la firma como se describe en los Materiales y Métodos
.
(A) tumor de ratón de expresión génica firmas. mapas de calor muestran la expresión de los genes que son expresados diferencialmente entre el tejido tumoral y el tipo salvaje o tejidos normales adyacentes en el ratón. firmas de tumores (B) El ratón se dividieron en hasta reguladas y las reguladas juegos y gráficos de Kaplan-Meier se generaron para cada conjunto de genes para poner a prueba la capacidad de predicción de la supervivencia global del paciente.
Curiosamente, Se encontró que para todas las comparaciones, los genes regulados en los tumores tenían un poder altamente predictivo de supervivencia de los pacientes (Tabla 1) y la supervivencia libre de enfermedad (Tabla S4). Como se indica anteriormente, estos genes fueron enriquecidos para los procesos metabólicos tanto en seres humanos y ratón. Por el contrario, la firma-up regulado, enriquecida para los procesos del ciclo celular, no tenía poder de predicción muy alta para la supervivencia (Tabla 1) o la supervivencia libre de enfermedad (Tabla S4). La figura 3B y la figura S1 muestran los gráficos de Kaplan-Meier para estos datos. Sugerimos que los procesos del ciclo celular regulados hasta carecen de capacidad de predicción, ya que representan eventos en general tumorales, mientras que la pérdida de propiedades metabólicas significa pérdida específica de las propiedades funcionales de las células hepáticas que pueden ser perjudiciales para la supervivencia del paciente.
Para determinar si el poder predictivo de las firmas derivadas de ratón es específico para el modelo de c-MET, se analizó el poder predictivo de una firma derivado de modelos de ratones independientes [37] y se encontró que una parte significativa de los genes tenía poder de predicción (Figura S3). Estos resultados indican que el poder predictivo de los genes derivados de ratón viene de las propiedades de las muestras de tumor de ratón y sugiere una utilidad general de los modelos tumorales de ratón para la identificación de genes firmas predictivo de los resultados en los tumores humanos
.
Siguiente , se analizó el patrón de expresión de los genes de las firmas del ratón en las muestras humanas y se encontró que los genes identificados en el modelo de ratón mostraron cambios significativos de expresión en los tumores humanos (mapas de calor de representación en la Figura 4.) Para determinar si los cambios de expresión estaban en la misma dirección en el ratón y humano, se calculó el promedio de expresión de cada gen en los tumores humanos en comparación con no tumoral adyacente. Se encontró que cada uno de los seis firmas ratón contenían genes cuya expresión cambiado en los tumores humanos, tanto en la misma y en la dirección opuesta. Por ejemplo, entre los genes regulados en los tumores de ratones WT en comparación con el tejido (Figura 4A-B), un subconjunto fue también el regulado en los tumores humanos (Figura 4A) mientras que un subconjunto fue hasta reguladas en los tumores humanos en comparación con adyacentes los tejidos no tumorales (Figura 4B). Del mismo modo, entre los genes que son regulados hasta en los tumores de ratones WT vs. tejido, un subconjunto de genes se redujo reguladas en los tumores humanos y un subconjunto estaba regulado hasta-(datos no mostrados).
Gene firmas generadas en los tejidos de ratón se proyectan sobre el conjunto de datos HKU HCC humano. La escala de color es como en la Figura 1 (-0,5 a 0,5). La media de los niveles de expresión se representan a la derecha de cada mapa de calor para ilustrar la asociación entre la expresión y el pronóstico. Las curvas de KM se dan debajo de cada mapa de calor.
Para entender la diferencia entre los genes regulados en la misma o en la dirección opuesta en el ratón y los tumores humanos, se analizaron por separado para cada subconjunto su poder para predecir la supervivencia (Tabla 2), la supervivencia libre de enfermedad (Tabla S5) y para el enriquecimiento de las vías biológicas (Tabla 2). Se encontró que los genes regulados hacia abajo tanto en el ratón y los tumores humanos (Tabla S6) conservan un poder predictivo altamente significativa para la supervivencia y el enriquecimiento de los procesos metabólicos. Por el contrario, el subconjunto de genes que se redujeron reguladas en los tumores de ratón pero hasta reguladas en tumores humanos no tenía poder predictivo y enriquecimiento significativo para todos los procesos biológicos. Entre los genes regulados hasta en los tumores de ratón, los que se redujeron reguladas en los tumores humanos no tenían ningún poder predictivo para la supervivencia o anotación biológica significativa (enriquecimiento significativo de las vías biológicas, medida por hipergeométrica P-valor). Curiosamente, mientras que el conjunto completo de genes hasta reguladas en los tumores de ratón no tenía un poder predictivo (véase más arriba, la Tabla 1 y Tabla S4), el subconjunto de genes que son regulados hasta en tanto tumores de ratón y humanos mostraron marginalmente significativa capacidad de predicción (Tabla 2, Tabla S7). Este resultado indica que el filtrado de los genes discordante regulados a través de un sistema de modelo y de muestras clínicas y retener sólo aquellos que son regulados de manera similar en tanto puede revelar conjuntos con capacidad de predicción que no se pueden detectar cuando cualquiera de las firmas globales de cualquiera de los sistemas se consideran por separado.
Desde los HCC ratón fueron inducidos por c-MET, repetimos el análisis anterior en el CHC humana, centrándose en aquellos pacientes con alta c-MET (pacientes con HCC c-MET expresión & gt; mediana de expresión de la población) para definir las firmas en la misma u opuesta dirección entre ratón y humano. Similar a la Figura 4 A & amp; B, hemos identificado 775 genes tanto hacia abajo regulados en el ratón y humano c-MET-alta HCC, y 612 genes en la dirección opuesta. Entre éstos, 749 se superponen con 800 mismos genes dirección utilizando todas las muestras de HCC (96,7% de solapamiento, hipergeométrica valor P 0) y 562 se superponen con 587 genes dirección contraria utilizando todas las muestras de HCC (95,7% de solapamiento, hipergeométrica P-valor 0). Análogos a la figura 4 y en la Tabla 2, también comprueban el poder pronóstico de estas dos firmas, los valores de p log-rank para la supervivencia global son 2,2 x 10-6 y 0.78, respectivamente, el poder predictivo muy similar a la del caso en el que todo el HCC pacientes se utilizaron para asignar las firmas de solapamiento (Tabla 2). Ontología de genes de estos genes se solapan se llevó a cabo para revelar las vías biológicas asociadas con diferentes conjuntos de genes al comparar los tumores de hígado de ratón c-MET impulsadas y el c-MET-alta HCC humano (Tabla S8).
Discusión
el presente estudio muestra que el modelo de tumor de ratón c-MET tiene similitudes con HCC humano a nivel molecular, incluyendo la baja regulación de los procesos metabólicos y sobre regulación de los genes del ciclo celular. firmas de genes específicos de tumores derivados en el modelo de ratón pueden distinguir tumor de tejido no tumoral en HCC humano. Los genes regulados en el tumor en comparación con el tejido no tumoral adyacente, tanto en el ratón y muestras humanas tenían un poder predictivo significativo en la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad en pacientes con CHC.