Extracto
Los cánceres se han revelado como muy heterogénea en cuanto a la frecuencia y tipos de mutaciones presentes en las células de diferentes tumores malignos. Por lo tanto, es probable que el tratamiento clínico uniforme no es óptimo para todos los pacientes, y que el desarrollo de los regímenes terapéuticos individualizados puede ser beneficioso. Se describe la generación de múltiples péptidos pequeños, únicos nueve a treinta y cuatro aminoácidos de longitud, que, cuando están marcados con el radioisótopo
32P, se unen con eficiencias muy diferentes a líneas celulares derivadas de diferentes adenocarcinomas de colon. Además, el más eficaz de estos péptidos transfiere de forma permanente el
32P radioisótopo a las proteínas celulares de cáncer colorrectal plazo de dos horas a una velocidad que es más de 150 veces mayor que en líneas celulares derivadas de otros tipos de cáncer o de los tejidos normales ensayados. Actualmente, los únicos dos agentes radioinmunoterapéutico aprobados por la FDA en el uso de ambos emplean anticuerpos dirigidos contra la CD20 marcador de células B para el tratamiento de linfoma no Hodgkin. Al utilizar el método descrito en el presente documento, un gran número de diferentes péptidos
32P-etiquetados pueden producirse fácilmente y se ensayaron contra un amplio espectro de tipos de cáncer. En este informe se propone el desarrollo y el uso de péptidos
32 P-etiquetados como posibles terapias péptido vinculante individualizadas para el tratamiento de pacientes con adenocarcinoma de colon
Visto:. Abraham JM, Cheng Y, Hamilton JP, Paun B, Jin Z, Agarwal R, et al. (2008) Generación de los Pequeños
32P-péptidos marcados como un posible enfoque para la terapia del cáncer colorrectal. PLoS ONE 3 (6): e2508. doi: 10.1371 /journal.pone.0002508
Editor: Edathara Abraham, Universidad de Arkansas, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2008; Aceptado: May 6, 2008; Publicado: 25 Junio 2008
Derechos de Autor © 2008 Abraham et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 y 7R21 /R33CA106763 del Instituto Nacional del cáncer
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los descubrimientos recientes han documentado señal convincente la amplia heterogeneidad genética entre los cánceres humanos, particularmente tumores colorrectales, mediante el establecimiento de la existencia de un pequeño número de genes "montañas" mutados con frecuencia y un número mucho mayor de genes "colinas" mutado a frecuencias mucho más bajas [1], [2]. Este alto grado de diversidad entre los cánceres colorrectales humanos sugiere que las estrategias de tratamiento individualizado son una gran promesa en la intervención clínica exitosa. Varios inmunoterapias contra el cáncer están actualmente en uso, incluyendo Herceptin, Rituxin, y Avastin, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) que está aprobado para el tratamiento del cáncer colorrectal [3] - [9].
La radioinmunoterapia (RIT) es una tecnología emergente con sólo dos protocolos hasta el momento aprobadas por la FDA, ambas dirigidas contra el linfoma no Hodgkin (LNH). Cada protocolo utiliza un anticuerpo monoclonal dirigido contra el marcador de células B CD20 y puede entregar
90Y (Zevalin) o
131I (Bexxar), cada uno de los cuales genera electrones (partículas beta) que dañan el ADN, lo que resulta en la muerte celular [10], [11]. Actualmente, sin embargo RIT ha sido aprobado para el tratamiento del cáncer colorrectal [12].
Recientemente hemos informado de un conjunto de nueve decapéptidos diferentes, cada uno que varía de los demás por uno a tres aminoácidos, que cuando se marcan con el emisor beta
32P, unido a y entregado de forma permanente, en diversos grados, este radioisótopo a líneas celulares derivadas de un panel de diferentes adenocarcinomas colorrectales [13]. El más eficiente decapéptido
32P marcado con resultó en la incorporación permanente de radioisótopo en las proteínas celulares de adenocarcinoma de colon a una velocidad de más de 100 veces mayor que en líneas celulares derivadas de una variedad de otros tipos de cáncer o de colon normal, los riñones o el esófago.
Aquí, se presenta una clase de péptidos ligeramente más grandes (hasta 34 aminoácidos de longitud) que contienen secuencias de péptidos muy dispares, lo que resulta en una amplia gama de propiedades de captación celular de unión y de radioisótopos. Cada péptido de 34 aminoácidos contiene un núcleo de nueve aminoácidos en su extremo amino para permitir
32P etiquetado por la proteína quinasa A, un núcleo de ocho aminoácidos en su extremo carboxi, y hasta 17 aminoácidos adicionales que alteran drásticamente tanto su unión a las células y su incorporación permanente de radioisótopo en las proteínas celulares de cáncer de colon. Estos resultados apoyan una mayor exploración de esta estrategia para desarrollar posibles nuevos regímenes terapéuticos individualizados contra el cáncer de colon.
Resultados
Producción de péptidos
32 P-etiquetados y se unen a las células de adenocarcinoma de colon
Anteriormente, se informó del descubrimiento de nueve decapéptidos
32P marcados con diferentes, cada uno que varía una de otra por una a tres aminoácidos, que exhibe capacidades muy dispares de unirse y de transferencia de radioisótopo de forma permanente a las proteínas en líneas celulares establecida a partir de un panel de adenocarcinomas de colon. El más eficiente de estos decapéptidos
32P-marcados entregados de forma permanente de radioisótopos a las células de cáncer de colon más de 100 veces más eficiente que a líneas celulares derivadas de otros tipos de cáncer o de los tejidos normales ensayados. Aquí, se presenta la producción y la identificación de una nueva serie de péptidos, hasta 34 aminoácidos de longitud, cuyas secuencias de aminoácidos alteran drásticamente su capacidad para unirse a facilitar y permanentemente
incorporación de 32P en las células. La Figura 1 es una representación esquemática del diseño experimental, que ilustra la clonación de un fragmento de ADN que contiene 17 codones generados aleatoriamente en el sitio de la enzima de restricción BamHI de pGEX-2TK. Después de la transformación bacteriana, se seleccionaron clones individuales y se expande para producir un conjunto diverso de péptidos
32 P-etiquetados. Si no hay codones de parada estaban presentes en la secuencia de ADN al azar, a continuación, un péptido 34-residuo se genera, flanqueado en su extremo amino por la proteína de 9-quinasa A residuo motivo etiquetado y en su extremo carboxi por una secuencia de 8 residuos. Como era de esperar, en varios clones, se insertó un codón de parada, lo que resulta en péptidos truncados; Sin embargo, todos estos péptidos truncados contenían la proteína quinasa A resto sustrato. Estos diversos péptidos se incubaron con varias líneas de células diferentes durante dos horas, las células adherentes se lavaron tres veces, y la radiactividad restante unido a las células se ensayó inmediatamente o después de la incubación durante la noche en medio completo.
Un producto de PCR que contenía 17 codones aleatorios se insertó en el sitio BamHI del pGEX-2TK la producción de diversos proteínas de fusión glutatión-S-transferasa que se une a glutatión-sefarosa, y se marcaron con
32P usando proteína quinasa A. Después de lavar y trombina digestión, la etiqueta péptidos se incubaron con varias líneas de células diferentes y se ensayaron.
Figura 2 muestra la variación dramático en los niveles de permanente
32P incorporación en la línea de adenocarcinoma de colon Caco2 después del lavado y la incubación medio durante la noche. Anteriormente puso de manifiesto que las células decapéptidos con éxito la unión después de dos horas de incubación en libertad hasta el 88% de su principio con destino
32P en los medios de comunicación después de la incubación durante la noche, pero aún así la incorporación permanente de altos niveles de radioisótopos en sus proteínas. Los diecinueve péptidos diferentes en la figura 2 se designan MA (Modificado adyuvante) 10 a 28. Once de estos 19 contienen insertos de 17 residuos completos, con MA18 transferir de forma permanente
32P a las células Caco2 más de 37 veces más eficiente que MA26. El más eficiente incorporación de radioisótopos permanente en células Caco2 se produjo después de la incubación con MA27, que contiene sólo un aminoácido insertado al azar aguas arriba de un codón de parada. Los péptidos MA16 y MA17 fueron codificados por el vector de expresión recombinante original, dando lugar a bajos niveles de incorporación de radioisótopos.
diferentes péptidos
32P-marcadas se incubaron durante dos horas con 10.000 células Caco2, se lavó tres veces, y se incubaron en medio completo durante 24 horas. La cantidad de
radioisótopo 32P que quedó incorporado permanentemente en las proteínas celulares se muestra como un porcentaje de la absorción de la cantidad de péptido añadido a cada cultivo celular bien (media más una desviación estándar). El número de aminoácidos presentes en cada inserto se muestra y se varió de 0 a 17 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de cada inserto se muestra debajo del nivel de
incorporación de 32P atribuido a cada inserto.
visualización de
incorporación de 32P por autorradiografía del gel
Cuatro péptidos que muestra los niveles medios de la incorporación de radioisótopos fueron seleccionados para su estudio; ensayos por triplicado pocillos de estos péptidos se muestran en la Figura 3. inserto de péptido MA11 contenía tres residuos de aguas arriba de un codón de parada, lo que resulta en un péptido de sólo 12 aminoácidos de longitud. A pesar de su longitud relativamente corta, este péptido truncado transfiere
32P a las células Caco2 215 veces más eficiente que a la línea celular derivada de tumor cervical HeLa en dos horas. Después del lavado y la incubación durante la noche en medio, la radiactividad retenida por las células Caco2 era más de 150 veces mayor que la que tienen en células HeLa. Como se muestra en la Figura 3, la mayoría
32P unido a las células Caco2 estaba presente en un bajo peso molecular (LMW) componente (
negrita flecha
) a las 2 horas, pero a las 24 horas la mayor parte de esta radiactividad tenían ha incorporado en varios diferentes proteínas celulares.
Cuatro de la MA (Modificado adyuvante)
32P-péptidos que se muestran en la Figura 2 se incubaron con tres pozos de células HeLa o Caco2 durante dos horas. Después del lavado, se añadieron 100 l de tampón de carga de gel y el contenido se corrieron en SDS-geles de poliacrilamida (designado como "2 horas"). pozos idénticos habían medio completo añadido inmediatamente después de la etapa de lavado y se incubaron durante 24 horas adicionales, y el contenido así se ejecute en geles (designados como "24 horas"). La película fue desarrollado después de una exposición durante la noche que muestra la aparente incorporación permanente de
32P en las proteínas celulares a las 24 horas (marcado con * en el panel MA11). Péptido MA11 obligado 215 veces más ávidamente a las células Caco2 que a las células HeLa en dos horas, y 150 veces más ávidamente a las 24 horas. Péptido MA20 obligado así a ambas células Caco2 y HeLa en dos horas, pero sólo las células Caco2 parecía poseen la maquinaria celular necesaria para incorporar
32P en las proteínas celulares. La flecha fina muestra la posición del péptido
32 P-etiquetados, mientras que la flecha en negrita muestra la posición de un peso molecular relativamente bajo marcado intermedio que no se observó en las células HeLa.
Similar se observaron resultados para los péptidos MA15 y MA22, ambos de los cuales contenía insertos de 17 residuos de una longitud total de 34 aminoácidos, y ambos de los cuales incorporaron 23 veces más
32P en células Caco2 que en células HeLa después de la incubación durante la noche (figura 3). Una vez más, tanto MA15 y MA22 mostraron una banda de LMW intensamente radiactivos (
negrita flecha
) a las 2 horas que había desaparecido casi por completo a las 24 horas, con la incorporación de los restantes
32P en las proteínas celulares. Originalmente, se asumió que esta banda de BPM visto a las 2 horas (
negrita flecha
) representado péptido intacto unido
32 P-etiquetados. Sin embargo, los 34 péptidos de aminoácidos MA15 y MA22 identificaron estos intactas precursores de péptidos de 34 aa a diferencia de la banda MW más pequeño intensa (
flechas en negrita
El). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la banda más pequeña era una molécula pequeña intermedia rápidamente procesado, lo que disminuye en gran medida sobre los que garantizan 24 horas durante el cual el
32P se está incorporando en las proteínas celulares.
Péptido MA20 también contenía una inserción de 17 residuos. Este péptido fue especialmente notable, ya que era la única prueba de que era capaz de unirse a una línea celular que no deriva de los adenocarcinomas de colon y proporcionó evidencia clave que sugiere un posible mecanismo de procesamiento celular. Como se muestra en la Figura 3, MA20 obligado a altos niveles a tanto Caco2 y a las células HeLa en dos horas. Sin embargo, la banda LMW (
negrita flecha
) visto con los otros tres péptidos en la Figura 3 sólo era visible con células Caco2, pero no con células HeLa. Después del lavado y la incubación durante la noche, las células Caco2 parecían haber procesado la banda intermedia de BPM (
negrita flecha
) en las proteínas celulares, mientras que las células HeLa no parecen tener la capacidad de completar este paso siguiente (
es decir
, se visualizaron las proteínas celulares no radiactivos en estas MW, y toda la radiactividad unida se HeLa todavía en el mismo peso molecular que el péptido unido originalmente
32P marcado con (
delgada flecha
)). Las dos bandas (
flechas delgadas
, primer carril de MA20 y MA22 geles) fueron el resultado de la incubación del péptido
32 P-etiquetados en medio que contiene suero durante dos horas a 37 ° C, y demostró aparente parcial proteolisis del péptido durante ese tiempo.
radiactividad Sólo las células de adenocarcinoma de colon procesan el ligados a las proteínas celulares
la figura 4 muestra los resultados de la incubación de péptidos MA11, MA20 y MA22 con siete líneas celulares de carcinoma en diferentes 2 horas y después de la incubación durante la noche. Péptidos MA11 y MA22 exhiben una fuerte transferencia de unión y de
32P sólo a las tres líneas de adenocarcinoma de colon (Caco2, HCT116 y HCT15) y no al cuello uterino (HeLa), fibrosarcoma (1080), las células de adenocarcinoma pancreático o de los pulmones. MA20, por el contrario, obligado ávidamente a las siete líneas de células, pero su radiactividad se procesó en la banda de LMW (
negrita flecha
) y más tarde en las proteínas celulares sólo por las líneas de adenocarcinoma de colon (Caco2 tres, HCT116, y HCT15). Las células HCT116 obligados constantemente, así como procesado en bandas más grandes MW, la radiactividad de los tres péptidos
32 P-etiquetados (MA11, MA20 y MA22) a una tasa mucho más baja que Caco2 y HCT15 células, pero su incorporación en HCT116 celular proteínas finalmente fue visible en exposiciones más largas (datos no mostrados).
Los péptidos
32 P-etiquetados MA11, MA20 y MA22 se incubaron con siete líneas celulares diferentes, como se describe en la Figura 3. MA11 y MA22 obligado a y había
32P radioisótopo incorporado permanentemente por las líneas celulares derivadas de tres de adenocarcinoma de colon. MA20 unen de forma significativa a los siete líneas de células, incluyendo uno derivado de un adenocarcinoma de páncreas y uno derivado de un adenocarcinoma de pulmón, pero tenía niveles significativos de
32P incorporado permanentemente en las proteínas celulares sólo por los tres adenocarcinomas de colon. El
flecha delgada
muestra la posición del péptido
32 P-etiquetados, mientras que el
negrita flecha
indica la posición de un peso molecular relativamente bajo marcado intermedio que sólo se ha visto en adenocarcinoma de colon las células.
no fosforilados péptido compite con el péptido
32P-marcado por la unión a las células Caco2
El péptido de 12 aa MA11 fue sintetizado químicamente, marcado con
32P, y se utiliza en un ensayo de unión competitiva con células Caco2 contra cantidades variables de péptido MA11 frío, no fosforilada. La Figura 5 ilustra que la fosforilación de este péptido no era necesaria para competir con éxito por la unión a las células Caco2, y que cantidades crecientes de competidor frío inhibió rápidamente la cantidad de péptido
32P marcado con que se unió a las células
.
en cada uno de las células que contienen Caco2 así se añadió 0,005 g de péptido MA11
32 P-etiquetados y la cantidad indicada de MA11 frío, no fosforilada. Después de una hora de incubación, las células adherentes se lavaron y los recuentos radiactivos consolidados determinados.
Discusión
Diecinueve diferentes péptidos pequeños de hasta 34 aminoácidos de longitud se han producido de forma recombinante, cada contiene una inserción de hasta 17 residuos de longitud, que puede ser marcado en un sustrato de nueve aminoácidos conservados utilizando
32P y la proteína quinasa A. Estas
32P marcado con péptidos se unen con afinidades únicas a líneas celulares establecidas a partir de diferentes adenocarcinomas de colon y transferir de forma permanente de radioisótopos a las proteínas celulares después de dos horas de incubación. Los más eficiente de unión resultados de péptidos en la captación permanente de
32P por las células de cáncer de colon más de 150 veces mayor que por las líneas celulares derivadas de otros tipos de cáncer o tejidos normales. Además, un péptido
32P marcado con obligado a todas las líneas celulares ensayadas, pero
32P se procesó y permanentemente incorporado solamente por líneas celulares derivadas de adenocarcinomas de colon, lo que implica que sólo este tipo de célula de cáncer posee la maquinaria necesaria para esta etapa de procesamiento. Las diecinueve péptidos diferentes que se muestran en la Figura 2 se seleccionaron de un panel de selección inicial que contiene sólo 25 péptidos. Esta sorprendentemente alta tasa de obtención de los péptidos de éxito aumenta la probabilidad de que esta estrategia para el desarrollo de la terapia individualizada será factible. Finalmente, un ensayo de unión competitiva usando péptido sintético MA11 y marcado con 32P
frío demostró que el péptido no fosforilado compite de manera muy eficiente para la unión a las células Caco2.
La mayoría Actualmente regímenes inmunoterapéuticos cáncer aprobado el uso de un anticuerpo dirigido contra una molécula celular conocido y también puede estar acoplado a un agente de ablación de tumor, tal como un radioisótopo o una toxina [14] - [18]. Sólo dos tratamientos (RIT) radioinmunoterapéutico están actualmente aprobados por la FDA; ambas son dirigidas contra el linfoma no Hodgkin utilizando
131I (Bexxar) o
90Y (Zevalin) a través de la actividad que mata las células de los electrones emitidos.
radioisótopo 32P es un emisor beta puro, y como se muestra en la Tabla 1, que tiene muchas propiedades que se comparan favorablemente a
131I y
90Y, además de ser fácilmente disponible y relativamente barato. Una ventaja de usar partículas beta para matar las células tumorales es que su gama camino de hasta 5 resultados mm en un gran número de células que están siendo penetrado por cada electrón, dando lugar a un "efecto espectador" acumulativo debido a fuego cruzado de células marcadas vecino.
un área muy activa de investigación biomédica se centra en el acoplamiento de radioisótopo a péptidos, así como su uso en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas [19] - [22]. Nuestra propuesta de aplicación de péptidos pequeños
32P-etiquetados en la terapia de unión al péptido sugiere una serie de ventajas con respecto a RIT tradicional basado en anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se espera que las moléculas terapéuticas más pequeñas para proporcionar una mejor penetración en el tumor, y el peso molecular del péptido pequeño promedio de menos de 4000 Da es menor que 3% del tamaño de una molécula de anticuerpo [23]. halógenos radiactivos tales como
131I puede ser procesado y liberado prematuramente por las células, mientras que el
32P entregada por estos péptidos pequeños se incorpora permanentemente en proteínas de las células del cáncer [24]. Un pequeño péptido es menos probable que incite del tipo de huésped respuesta anti-proteína que puede desarrollar cuando se utilizan los anticuerpos mucho más grandes, y la ausencia de un fragmento Fc de inmunoglobulina debe resultar en una menor unión no específica por el hígado. El radioisótopo
32P tiene una larga historia de uso clínico que data de la década de 1930, mientras que hoy todavía se utiliza para tratar la policitemia y la trombocitopenia esencial [25]. Existe una clara necesidad para el desarrollo de nuevos tratamientos eficaces para el cáncer colorrectal [26]. Nuestro trabajo sugiere que un muy gran biblioteca de diferentes péptidos pequeños, cada uno con unión y
capacidades de transferencia de 32P único, se puede producir fácilmente, ya sea química o biológicamente, lo que aumenta la posibilidad de desarrollar regímenes de tratamiento individualizados para los distintos pacientes. El cáncer se ha demostrado que es una enfermedad muy heterogénea, por lo tanto el desarrollo de estos péptidos de unión única terapias podrían facilitar enormemente tratamientos individualizados del paciente.
Materiales y Métodos
Producción del recombinante
32P péptidos marcado con
Como se describe en la Figura 1, generado por PCR productos constituidos por los 17 codones aleatorios flanqueados por sitios BamHI se clonaron en el sitio BamHI del pGEX-2TK (GE Healthcare). Después de la transformación en bacterias DH5a, los clones aislados se cultivaron durante la noche en caldo LB-amp, se diluyó 1/10 en la misma, que se cultiva durante dos horas, IPTG añadido a 1 mM, y se cultivó a 37 ° C durante cinco horas. Se centrifugaron diez ml de cultivo y se resuspendieron en 1 ml de 1 x TBS que contiene 100 mg /ml de lisozima. Después de dos ciclos de congelación-descongelación, el lisado se centrifugó y se mezcla con 100 l de Sepharose-glutatión durante una hora, se lavaron tres veces con 1 x TBS, y las proteínas de fusión recombinantes marcado unido usando quinasa
32P-γ-ATP y proteínas a de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma, St. Louis, Mo.). El sedimento se lavó tres veces con 1 x PBS y el péptido marcado se escinde y se libera en el sobrenadante utilizando trombina (GE Healthcare). Para cada péptido recombinante producida y se ensayó, se determinó la secuencia de ADN del inserto en el plásmido de expresión.
Ensayo de la unión de péptidos
32P-marcados a líneas celulares
Las líneas celulares fueron cultivadas en medio completo que contenía suero fetal bovino inactivado por calor al 10%. En cada pocillo de una placa de 96 pocillos, 10.000 células de diversas líneas celulares se cultivaron durante la noche. Se añadieron diez l de péptido
32P marcado con en 1 × PBS y 90 l de medio completo a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante dos horas. El péptido-medio se retiró y uno l añadido a tampón de carga de gel de 100 l para el recuento de centelleo para la cuantificación de la sonda o ejecuta en un -20% en gel de poliacrilamida-SDS al 10% (Biorad). Las células adherentes fueron brevemente y se lavan suavemente con medio completo tres veces y algunos pozos se analizaron inmediatamente mediante la adición de 100 l de tampón de carga de gel a cada pocillo y se ejecutan en un gel o se contaron en un contador de centelleo. Otros pocillos tratados idénticamente había añadido 200 l de medio completo y se incubaron a 37 ° C durante 24 horas adicionales. El medio se retiró y se añadieron 100 l de tampón de carga de gel y las muestras en un gel o cuenta como se describe anteriormente.
Producción de péptido sintético
32P marcado con
El ácido 12 amino péptido MA11 se sintetizó químicamente y 0,2 g se marcó como se ha descrito anteriormente usando 300 Ci de
32P-γ-ATP y 30 unidades de la proteína quinasa A. Después de una reacción de marcaje 5 horas, la mezcla se microcentrifugación a través de una unidad de Microcon-10 para eliminar la enzima a partir de ensayos de unión posteriores. Para el ensayo de unión competitiva, 0,005 g de péptido
32P marcado con MA11 se añadió a un pocillo que contiene 10.000 células Caco2 y una cantidad designada de MA11 frío, no fosforilada. Después de la incubación durante una hora, las células adherentes se lavaron suavemente y el contenido así contados.