Extracto
Antecedentes
desarrollo de anticuerpos terapéuticos es una de las áreas de mayor crecimiento de la industria farmacéutica. La generación de anticuerpos monoclonales de alta calidad frente a un objetivo terapéutico dado es crucial para el desarrollo de fármacos éxito. Sin embargo, debido a la tolerancia inmune, por lo que es difícil generar anticuerpos usando métodos convencionales.
Se utilizaron
Metodología /Hallazgos
Técnicas cuatro cáncer gástrico (CG) líneas celulares humanas como el inmunógeno en A /J ratones; dieciséis altamente Se seleccionaron las colonias de hibridoma positivos a través de células activadas por fluorescencia de alta detección rendimiento (FACS-HTS) usando un total de 20.000 colonias en el sesenta y siete placas de 96 pocillos en contra de células vivas (células GC humanos mixtos frente a los controles de PBMC humanos). MS17-57 y controlar comercial de fosfatasa alcalina (ALP) mAbs se utilizaron para confirmar los antígenos diana (AGS), que fueron identificados como ALPs expresan en la superficie celular GC a través de una combinación de transferencia de Western, inmunoprecipitación y espectrometría de masas (MS).
MS identificó los Ags reconocidos por MS17-57 ser dos variantes de un ALP secretada, PALP y IALP (ALP placentaria y intestinal). Estas proteínas pertenecen a una familia de enzimas hidrolasa responsable de la eliminación de grupos fosfato de muchos tipos de moléculas. La tinción de inmunofluorescencia usando MS17-57 demostró mayor tinción de los tejidos gastrointestinales (GI) de cáncer en comparación con los tejidos normales (GI
P Hotel & lt; 0,03), y confirmó la unión de MS17-57 a restringirse a un epítopo funcional expresado en la superficie de células de cáncer. Los ensayos de proliferación utilizando el PALP /IALP-líneas celulares que expresan GC demostraron que MS17-57 inhibió el crecimiento celular en un 32 ± 8%. ensayos de migración celular Transwell documentado que MS17-57 puede inhibir /IALP-expresión de GI migración celular de cáncer de PALP por 25 ± 5%. MS17-57 mAb inhibió el crecimiento del tumor en ratones desnudos.
Conclusiones
Nuestros hallazgos indican que PALP y IALP pueden expresarse de forma ectópica en la matriz extracelular de los cánceres gastrointestinales, y que MS17-57 dirigidos contra PALP /IALP GI puede inhibir las células cancerosas el crecimiento y la migración
en
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y
en
in vivo
. Esta investigación proporciona un ejemplo de la identificación de biomarcadores de cáncer que representan dianas terapéuticas prometedoras utilizando mAb genera a través de una nueva tecnología HTS
Visto:. Li M, Gao J, Feng R, Wang Y, Chen X, Sun J, et Alabama. (2013) Generación del anticuerpo monoclonal MS17-57 focalización secretadas fosfatasa alcalina ectópica expresado en la superficie de células de cáncer gastrointestinal. PLoS ONE 8 (10): e77398. doi: 10.1371 /journal.pone.0077398
Editor: Nikki Pui-Yue Lee, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 1 de mayo de 2013; Aceptado: 3 de septiembre de 2013; Publicado: 15 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (los números de subvención 81201596, 81101847, 81172324, 91229106, 31270963); Los proyectos clave de la Ciencia & amp Nacional; Programa de Tecnología Pilar de China (2011BA203191); Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (12XD1403700, 12PJ1406300); Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de Educación Superior de China, (20110073110071); Proyecto Clave del Comité de Educación de Shanghai (12ZZ105). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Todos los autores son inventores de una solicitud de patente pendiente con respecto a los ratones de inmunización, la preparación de MS17- 57 hibridoma y el uso de anticuerpo monoclonal MS17-57 para el tratamiento del cáncer. Los autores declaran que dos autores eran empleados de una empresa comercial, Shanghai MabStar, Inc. Los autores también declaran que MS17-57, así como el método de cribado se ha presentado para la solicitud de patente con el título de "Generación de anticuerpos anti-alcalina expresado ectópica fosfatasa mAb, su método y aplicaciones "(pendiente de patente), Oficina de propiedad Intelectual de la República Popular de China (CN201310090565.9). Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Los otros cuatro mAbs serán patentados y los resultados serán publicados también.
Introducción
gastrointestinal (GI), el cáncer es uno de los tumores malignos más comunes en los seres humanos con un alto riesgo de mortalidad en todo el mundo [1]. El desarrollo de anticuerpos terapéuticos para investigar, evaluar, prevenir y tratar el cáncer es una de las zonas de mayor crecimiento de la investigación, tanto en el ámbito académico y la industria farmacéutica [2]. La generación de anticuerpos monoclonales de alta calidad (mAbs) contra marcadores de cáncer como dianas terapéuticas es una vía importante para el desarrollo de fármacos clínicos. Se sabe que algunos marcadores de cáncer (por ejemplo, humano del factor de crecimiento epidérmico receptor 2 y el factor de crecimiento endotelial vascular) o están bien desarrollados, pero la mayoría son todavía desconocidos o sin desarrollar [3]. Por tanto, existe gran interés en la generación de mAb contra nuevos y desconocidos objetivos cancerosas. MAB contra objetivos específicos de tumores se pueden desarrollar e identificado usando una variedad de enfoques, incluyendo ligado a enzimas (ELISA) de cribado rendimiento -alta (HTS), células activadas por fluorescencia (FACS) -HTS, y
in vitro Opiniones y
in vivo
cribado.
identificación de nuevos biomarcadores de cáncer implicados en la tumorigénesis, el desarrollo del cáncer, o la prevención del cáncer sigue siendo de gran interés en todo el mundo [4,5]. Debido a los avances en la proteómica y otros aspectos de la biología molecular, tales investigaciones son cada vez más factible en época actual que en el pasado. De vanguardia tecnología HTS está relativamente bien desarrollada y es muy popular en muchos campos académicos [6,7].
Por lo cual hemos investigado la generación de anticuerpos monoclonales contra potencialmente nuevos Ags en la superficie de las células cancerosas usando un FACS- método HTS. En este estudio, se encontró que MS17-57 mAbs pudieron identificar placentaria y fosfatasas alcalina intestinal (PALP y IALP, respectivamente) como objetivos expresados en la membrana de células de cáncer. Nuestra estrategia era explotar un nuevo método de FACS-HTS y la tecnología de hibridoma usando una mezcla de 4 líneas celulares de cáncer GI vivos como inmunógeno [8], la hipótesis de que al menos algunos de los mAb producidos sería probable que se unen a epítopo conformacional (s ) en la superficie celular de células de cáncer GI. Los datos demostraron que MS17-57 podría unirse a PALP y IALP que se expresa de forma ectópica en la superficie celular, y podría neutralizar la actividad de ALP tanto
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. Estos resultados sugieren que PALP y IALP expresan en la superficie de tumores GI con el metabolismo celular de cáncer de aberrante y vía de señalización en los que pueden promover el crecimiento de células de cáncer y la metástasis. MS17-57 es un mAb con alta afinidad y especificidad, que representan potencialmente un reactivo útil y una base potencial para una nueva estrategia terapéutica en el desarrollo de fármacos contra el cáncer.
Nuestros estudios futuros se centrarán en el mecanismo molecular de MS17-57 inhibición de la proliferación y la migración de células de cáncer a través de la unión a PALP /IALP en la superficie de células de cáncer, y en aclarar las vías de señalización intracelulares afectados por la acción de este anticuerpo. Suponiendo que las investigaciones permitan confirmar los prometedores resultados descritos en estas investigaciones preliminares, la ingeniería de anticuerpos de MS17-57 como un anticuerpo quimérico o humanizado para la aplicación terapéutica podría ser perseguido.
Materiales y Métodos
Cultivos celulares
líneas celulares de cáncer gastrointestinal MKN45, BGC823, SGC7901, MKN28, AGS y GES-1 se adquirieron en el Instituto de Bioquímica y Biología Celular , Shanghai Institutos de Ciencias de la vida, de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y el Centro de bio Riken (Tsukuba, Japón). Las líneas celulares de cáncer gastrointestinal MKN-74 [9] y TMK-1 [9] fueron la cortesía del Dr. Gary K. Schwartz (Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering, Nueva York, NY, EE.UU.), y las células KKLS [10] se obtuvieron de Dr. Yukuta Takahashi (Instituto de Investigación del cáncer de la Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón). Las líneas celulares de cáncer gástrico ST-8 y ST-9 [11] fueron la cortesía de los Dres. Bradley McIntyre y Paul F. Mansfield, de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX, EE.UU.). Todas las demás líneas celulares (SP2 /0, etc.) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de un voluntario sano con el consentimiento informado.
A excepción de las células de mieloma SP2 /0 y las células de hibridoma mAb, todas las células se cultivaron en MD6, un hecho en casa, medio libre de suero deriva a partir de medio de Dulbecco modificado de Eagle (Gibco BRL, Rockville, MD, EE.UU.) con suero bovino fetal inactivado por calor al 5% (FBS) (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 ug /mL estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células de mieloma y de hibridoma se cultivaron de manera similar pero sin suero bovino fetal. Las células de mieloma y de hibridoma se cultivaron en suspensión. Se hicieron crecer células de cáncer GI para adherirse a frascos de cultivo de tejidos con un 5% de SFB medio /MD6.
tejidos del paciente
muestras de tumores frescos y tejidos cancerosos adyacentes (mucosa) de siete pacientes fueron sometidos a cirugía de GC obtenido del Departamento de Cirugía del hospital Ruijing Shanghai en Shanghai, china. Estos pacientes no habían recibido quimioterapia citotóxica o radioterapia antes de la cirugía. Se observaron los protocolos de la Junta de Revisión Institucional, y la aprobación ética para el estudio fue concedida por el Comité de Ética de Investigación del Hospital Ruijing, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Consentimiento informado, había sido obtenida de todos los participantes (incluyendo los donantes voluntarios) que participan en el estudio.
tejidos frescos se tiñeron con MS17-57, así como mAb de control de isotipo. Las señales de enlace se amplificaron, marcado con isotiocianato de fluoresceína, y contados por FACS-HTS.
Ratones
ratones macho A /J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, EE.UU.) 6- se adquirieron 8 semanas de edad de la Nanjing Modelo Experimental Animal Center, Universidad de Nanjing, Nanjing, china, y se mantuvieron a las instalaciones de animales de Shanghai MabStar, Shanghai, china. El mantenimiento de los ratones A /J y procedimientos experimentales fueron aprobados por Shanghai Bienestar Animal y el Comité de Ética de Investigación, Comité de Ciencia y Tecnología del Gobierno Municipal de Shanghai, China y el número de licencia es SYXK (Hu) 2009-0087.
ratones desnudos masculinos JAX edades de 4-8 semanas se adquirieron de Shanghai Modelo Experimental Animal Center y se mantuvieron en el Centro de Experimentación Animal del hospital Ruijing Shanghai. Estos ratones desnudos fueron utilizados para experimentos con xenoinjertos de cáncer gástrico humano (GC) y los métodos son similares a grupo Sela se describe anteriormente [12]. El mantenimiento de JAX ratones desnudos y los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Tecnología de Shanghai Gobierno Municipal de Shanghai del Bienestar Animal y el Comité de Ética de Investigación, Ciencia y, China y el número de licencia es SYXK (Hu) 2.011-0.113.
Vivo Cancer Cell Inmunización
Cada a /J ratones se inyecta por vía subcutánea en 5-10 sitios, así como una vez por vía intraperitoneal (ip) con aproximadamente 5-10x10
6 celdas (cantidades iguales de MKN45, BGC823, SGC7901, y las células MKN28) en solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4). Tres ratones fueron asignados por lote experimental. Dos semanas más tarde, se inyectaron los ratones una vez más, para un total de tres inmunizaciones, más uno i.p. refuerzo de tres días antes del experimento de fusión
Tres días después del refuerzo, las células del bazo se recogieron mediante cirugía de un ratón inmunizado se sacrificaron por CO
2 inhalación y todos los esfuerzos fueron tomadas para reducir el sufrimiento animal.; las células de bazo se fusionaron con el mieloma SP2 /0 células [13,14] en solución de glicol (pH 7,4) de fusión de polietileno 50% para generar hibridomas de mAb. Las células de hibridoma fusionadas se mantuvieron en hipoxantina-aminopterina-timidina medio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), y /células bien fusionados 280 mu L (alrededor de 1-2 x 10
4 células de bazo /pocillo) se tomaron alícuotas en placas de cultivo sesenta y siete de 96 pocillos de fondo plano de tejido y se incubaron a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO
2 durante 10 días. Al mismo tiempo, las líneas celulares de cáncer de cuatro GI se cultivaron a granel en frascos múltiples.
celular activada por fluorescencia con la selección de alto rendimiento (FACS-HTS)
El sistema FACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) se utilizó para rastrear los hibridomas selectivos a partir de grandes cantidades de fusión células /colonias en las placas de fusión. Hasta 200 de selección de selección y contador (células de cáncer frente a células normales) placas podrían utilizarse en un ensayo de selección tal. Las células fueron cosechadas a partir de las cuatro líneas de GC, mezclan, y alícuotas (aproximadamente 1x10
6 células /pocillo) en placas de 96 pocillos de fondo en U (67 placas) .El mismo número de células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) a partir de un voluntario sano se separaron mediante el uso de la solución de linfocitos de separación humana Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, EE.UU.) y se dividió en alícuotas en 96 pocillos de fondo en U placas (placas de otros 67 para la detección de venta libre). El sobrenadante (80 l /pocillo) a partir de cada una de las placas de fusión 67 se transfirió a placas de células GC etiquetados 1 a 67 después de estas células habían sido bloqueados por el 2,0% de albúmina de suero bovino (BSA) /tampón de bloqueo PBS en las placas. El sobrenadante de las mismas placas de fusión se transfirieron de manera similar a las placas de PBMC. Después de la celda de GC y placas de PBMC se lavaron tres veces con tampón de bloqueo, el anticuerpo secundario [inmunoglobulina de cabra anti-ratón G (IgG) Fc conjugado con isotiocianato de fluoresceína] se dividió en alícuotas en ambas placas de las células de GC y las placas de PBMC (100 l /pocillo) y se incubaron en hielo o en un refrigerador a 4 ° C durante 30 minutos, y se lavaron de nuevo tres veces con tampón de bloqueo. Las células fluorescentes teñidas se fijaron en paraformaldehído al 1,5% /PBS. El porcentaje de cambio de pico célula teñida y la media de intensidad de fluorescencia (MFI) se monitorizaron de forma continua por el sistema FACS-HTS 134 para la detección y la lucha contra el cribado de placas de 96 pocillos de fondo en U. colonias de hibridoma que exhiben una fuerte unión y especificidad para las células GC (y no se une a PBMCs) fueron seleccionados para el crecimiento expansivo, destetados de medio condicionado, y se subclonó.
mAb Generación
Los sobrenadantes se recogieron de la clones de hibridoma seleccionadas y purificadas utilizando una proteína-Sepharose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Elegimos el mAb MS17-57 purificada para el análisis adicional, que se filtró a través de una membrana de 0,2-m, esterilizado, y dividió en alícuotas en criotubos se mantuvo a 4 ° C para su uso en cultivos celulares o
in vivo
estudios (descritos abajo). La mezcla de mAb en PBS y 50% de glicerol se congeló a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
Mouse IgG Isotipificación
Se utilizó un kit de mAb de ratón isotipificación (Isostrip, RochePharma AG , Reinach, Suiza) para caracterizar el isotipo del mAb MS17-57 ratón (IgG).
ADNc la secuenciación de la región variable de MS17-57
Se utilizó un kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) para aislar el ARN total a partir de células de hibridoma MS17-57. La biblioteca de ADNc MS17-57 fue creado a partir de ARNm en las reacciones de transcripción inversa con un kit de primera cadena superíndice III (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.). Las regiones variables MS17-57 IgG fragmento Fab Ag-unión se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con 21 pares de cadena pesada y la cadena ligera de cebadores, que se obtuvieron de la IgG de ratón Biblioteca Primer Set (Progen Biotechnik, Heidelberg, Alemania). Los productos de PCR se utilizaron para la secuenciación de ADN, que se realizó por el Lee & amp; Lu laboratorio en el Centro de Cáncer MD Anderson, Houston, TX, EE.UU.. regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones marco (FWRs) de MS17-57 se identificaron utilizando los recursos disponibles en el Centro Nacional de Biotecnología sitios web de información y la determinación de las alineaciones de ADNc y secuencias de aminoácidos [15-18].
ELISA indirecto
Ag (proteína) (0,2 g /ml en PBS) se revistió sobre Immulon II-HB placas de 96 pocillos de ELISA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y se incubó en un húmedo -box durante la noche a temperatura ambiente (RT). placas recubiertas con Ag se lavaron y se bloquearon por PBS-Tween 20 (PBST) de tampón /1,0% de BSA, y 100 l de anticuerpos primarios diluidos individualmente en 1,0% de BSA /PBST se añadieron a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a RT y se lavaron con PBST. Después del lavado, 100 l de diluido (1: 2500) peroxidasa de rábano (HRP) conjugado de cabra anti-ratón IgG Fc policlonal anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EE.UU.) se añadió a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a TA. Después de un lavado adicional con PBST, 150 l de sustrato de peroxidasa (tetrametilbencidina en 0,02 M [pH 6,0] citrato /tampón de acetato y 0,003% H
2O
2) se añadió a cada pocillo para desarrollar el color de unirse señales; desarrollo se detuvo mediante la adición de 50 l de 0,2 M H
2SO
4 a cada pocillo. La absorbancia (densidad óptica; OD) de las placas de reacción se leyó a 450 nm con la referencia turbidez fijado a 620 nm.
Análisis Immuocytochemical con Cytospin diapositivas
Para hacer 1x10
6 GC células en 50 l /cada una, agujeros de cámara Cytospin se centrifugaron sobre portaobjetos y se fijaron con paraformaldehído al 4% /solución de PBS, se deshidrataron con 70% de etanol y se secó al aire. Los portaobjetos se rehidrataron en PBST en una posición plana durante 5 minutos y después se incubó en 10% de suero de cabra /PBS. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos primarios a una dilución apropiada durante 1 hora a RT o durante la noche a 4 ° C, se enjuagaron en PBST dos veces durante 5 minutos /cada uno en una posición horizontal. Los portaobjetos se incubaron después con el anticuerpo marcado con HRP secundario (de cabra anti-ratón IgG Fc-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories) en dilución 1: 500 en PBS durante 30 minutos a TA. Detección de la tinción con mAb sobre las células cancerosas se realizó con 0,125% sustrato cromogénico aminoetilcarbazol durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, y los portaobjetos Cytospin mAb fueron teñidas contraste con hematoxilina de Gill (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.). Anti-fade medio de montaje (Vector Labs, Burlingame, CA, EE.UU.) se utilizó para montar las diapositivas.
Cancer Cell Proliferación Ensayo de inhibición
El ensayo de inhibición de la proliferación de células de cáncer se llevó a cabo utilizando Recuento celular kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Santa Clara, CA, USA) y se basan en la detección de la actividad deshidrogenasa en células viables. Un total de 5.000 células /150 l de seleccionado BGC823, MKN45, o ambos tipos de células de las líneas celulares de 4 GC utilizados en la inmunización, se dispensó en cada pocillo de placas de 96 pocillos para cada una de las condiciones de prueba cuadruplicado. Las placas se pre-incubaron durante 24 horas en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2. 50 mAbs mu l /pocillo de MS17-57 (8 y 2 mg /ml), un irrelevante (control de isotipo) (30 y 8 g /ml) y un medio solo (control blanco) se añadió a las placas de ensayo por cuadruplicado para reducir variación. Las placas de ensayo se incubaron con las mismas condiciones que la pre-incubación. solución de CCK-8 se añadió a las placas (10 l /pocillo), tomada como una placa por cada condición de ensayo por día de días 1 a 7. Las placas se incubaron durante 3 horas y la absorbancia a 450 nm se midió utilizando un VERSAmax lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
Cancer Cell migración ensayo de inhibición
la inhibición de la migración quimiotáctica de las células cancerosas se evaluó mediante el ensayo de 24 pocillos migración celular colorimétrico QCM ( Merck Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). A RT, (1,0 x 10
5 células /ml en MD6), con o sin cada 5, 10, y 20 mg /ml MS17-57 más mAbs irrelevantes añadido a cada inserto, se añadió 300 l de la suspensión celular a cada uno de los 24 pocillos de la cámara de la migración, y se añadió 500 l de MD6 con suero bovino fetal al 5% a cada pocillo de la cámara inferior. Las placas de ensayo se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C con 5% de CO
2 durante 24 horas, y las células no migran se retiraron suavemente desde el interior de los insertos con un hisopo de algodón. Las células en la superficie inferior de la membrana se tiñeron por inmersión de las piezas de inserción en violeta cristal (un colorante nucleico) solución de tinción (500 l /pocillo) durante 20 minutos. Los insertos se enjuagaron en agua varias veces, se dejó secar al aire, y se fotografiaron. Las células teñidas fueron alícuotas en placas de 96 pocillos y se contaron mediante lector de microplacas VERSAmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
crecimiento tumoral en ratones Balb /C ratones desnudos
La actividad antitumoral de la MS17-57 se estudió con xenoinjertos de GC humano en ratones desnudos Balb /C como se describe anteriormente [12]. Brevemente, 1 x 10 i.p.
6 fueron inyectados seleccionado BGC823 o células MKN45 en MD6 con o sin mAb MS17-57 más irrelevantes en cada ratón. Esta inyección produce tumores en todos los ratones por 6 semanas después de la implantación de células, y el peso del nódulo tumoral de cada era aproximadamente 0,3 a 1,0 gramos, que depende de cómo se inocularon muchas células iniciales. El tratamiento con MS17-57, mAbs irrelevantes, y PBS (como controles en blanco media) (todo ip) comenzó el día después de la inyección de células de cáncer (es decir, en el día 1) y se repitió al día 15 y 29. Cada grupo de tratamiento consistió en menos cuatro animales. Se contó el número de nódulos tumorales, y el diámetro nódulo se midió una vez. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO2 en el día 48 y se hicieron todos los esfuerzos para aliviar el sufrimiento del animal.
inmunoprecipitación (IP) y espectrometría de masas (MS) Análisis
Para IP indirecta, Dynabeads magnéticas recubiertas con proteína A (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) se incubaron con 50 g de MS17-57 durante 30 minutos a TA con agitación constante. A continuación, las perlas se lavaron y se incubaron con lisado de seleccionados BGC823 o MKN45 GC células, que se diluyeron apropiadamente los lisados. La incubación se produjo en presencia de 0,1% Triton X-100 en los extractos de ensayo de radioinmunoprecipitación (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). mAb contra anti-β-actina (alrededor de 42 kDa en sodio dodecil sulfato-poliacrilamida electroforesis en gel [SDS-PAGE] gel) fue utilizado como un estándar de calibración interna. El lisado se expuso sucesivamente a perlas recubiertas con MS17-57 durante 30 minutos con rotación. perlas unidas se lavaron con 0,5% Triton X-100, seguido de agua. Las muestras se eluyeron calentando en agua hervida con 50 l /cada eluato de Laemmli de desnaturalización tampón de muestra (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). A continuación, las muestras se cargaron y se separó en 10% Bis-Tris gel (Bio-Rad) en 1 × 2 - (
N
morfolino) tampón de ácido etanosulfónico y SDS-PAGE. El gel se tiñó con un kit de tinción de plata (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.). Las bandas objetivo marcadas se cortaron y se analizaron con un sistema de serie ProteinChip 4000 (Enterprise Edition) espectrómetro de masas (Bio-Rad).
IP directa se realizó utilizando el kit de acoplamiento de anticuerpos Dynabeads (Invitrogen, Grand Island, Nueva York, EE.UU.) para acoplar directamente las perlas con MS17-57. Los pasos restantes son los mismos que se describe para IP indirecta.
expresión de ARNm por transcripción inversa cuantitativa (QRT) Análisis -PCR
Extracción de ARN total de 10 líneas celulares de cáncer GI se realizó con TRIzol reactivo (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) [19]. RNA se cuantificó utilizando la relación de absorción A260 /A280 nm. Para convertir el ARN en ADNc, un 1 l de la muestra total de ARN se utiliza en una reacción de transcripción inversa con inhibidor de RNasa (Invitrogen), superíndice III transcriptasa inversa (Invitrogen), ditiotreitol, y tampón de primera cadena. Las mezclas de las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego a 42 ° C durante 50 minutos. La reacción se desactivó a 70 ° C durante 15 minutos.
Los cebadores de avance y retroceso de IALP, PALP, y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (5'-TCCATCTTCGGGTTGGCCCCC-3 'y 5'-3-TCCGTGGGTCTCGGACGACAG '; 5' CCTGGGTGCTGCTCCTGCTGGG-3 'y 5'-CGTAGACACCCCCATCCCGTCAC-3'; y 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 'y 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3', respectivamente) fueron sintetizados y utilizados en un tiempo real de reacción de PCR con SYBR reactivos verdes (Life Science, Hercules, CA, EE.UU.) y se cargaron en una placa de 96 pocillos. La mezcla de las muestras se llevó a cabo en una PCR en tiempo real sistema de detección de CFX96 Touch (Bio-Rad) en las siguientes condiciones: 93 ° C durante 2 minutos para pre-desnaturalización, 93 ° C durante 1 min para la desnaturalización, 55 ° C durante 1 min para el recocido, 72 ° C durante 1 min para la extensión en 40 ciclos, y 72 ° C durante 7 min para la incubación final. Los datos fueron analizados utilizando el software Opticon Monitor (Life Science, Hercules, CA, EE.UU.).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS (IBM). Los datos se expresaron como medias ± error estándar de las medias. Las diferencias se analizaron mediante la prueba t de Student;
P
valores & lt; 0,05 se consideraron como significativos
Resultados
MS17-57 hibridoma se generó por inmunización con células de GC en directo
Siguiendo los principios. de la generación de mAb [10], se utilizó una mezcla de células MKN45, BGC823, SGC7901, y MKN28 GC vivo como inmunógeno para inmunizar ratones a /J tres veces. Antes del refuerzo final, se recogió el suero de un cola de purga de cada ratón inmunizado. SGC7901 células y BGC823 fueron seleccionados al azar de las cuatro líneas celulares de GC que se utilizaron en la inmunización de células vivas. PBMCs humanas aisladas de sangre entera de un donante sano fueron utilizados como un control no oncológico. GC células humanas y PBMCs fueron atados con suero de cada uno de los ratones inmunizados y no inmunizados con suero de ratón para el control (Figura 1). Los tres ratones en cada grupo línea celular exhibido señales a las líneas celulares de GC y PBMCs de unión, aunque PBMCs tenían señales relativamente débiles.
PBMCs humanos se aislaron de sangre entera de un donante sano seleccionado para el control normal de las células. Se han usado MKN45, BGC823, SGC7901, y MKN28 células en experimentos, pero las líneas celulares SGC7901 y BGC823 fueron seleccionados al azar como ejemplos en esta figura. El MFI fueron mayores en estas células que en PBMCs. Los tres ratones mostraron una fuerte respuesta inmune a las líneas de células de GC humanos.
células de bazo de cuatro líneas celulares humanas GC ratones inmunizados se fusionaron con células SP2 /0 de mieloma de ratón para generar el hibridoma de anticuerpos. FACS-HTS se utilizó para la detección de Ag más fuerte la unión de un gran número de carpetas (es decir, anticuerpos monoclonales) en el repertorio de hibridoma. Los mAbs une principalmente a los epítopos conformacionales en la superficie de las células cancerosas vivas. El uso de FACS-HTS, se seleccionaron colonias de hibridoma con fuertes señales de unión utilizando un total de 20.000 colonias en el sesenta y siete placas de 96 pocillos en contra de las células vivas GC mixtos y PBMCs humanos normales (células de detección de contador). Después de estas células de hibridoma se destetaron a partir del medio de selección, se seleccionaron los cinco hibridomas con las señales de unión más altas para la subclonación y la purificación de afinidad de anticuerpos. Elegimos el clon MS17-57 en estudio. (Los otros cuatro mAbs serán evaluados en una fecha posterior.)
MS17-57 Caracterización
Nos caracteriza MS17-57 mAb con una variedad de métodos. Información sobre IgG1 para la cadena pesada y κ para la cadena ligera se obtuvo de isotipificación de anticuerpo de ratón [20]. Las regiones variables (cadena ligera y cadena pesada) en el fragmento Fab de MS17-57 se secuenciaron para los ácidos ADN y aminoácidos (Figura 2). Las regiones únicas Ag-unión demostraron que las CDR entre las FWRs de las cadenas pesada y ligera estaban presentes en la región variable del fragmento Fab como la identidad MS17-57.
FWRs están situados entre CDRs.
MS17-57 la unión a los lisados de las células del cáncer GI
para definir algunas de las características biológicas de MS17-57 mAb, lisados de MKN45, BGC823, y líneas celulares GES-1 (este último genera y inmortalizada de las células normales de la mucosa del estómago y transformada con virus Simian 40) [21] fueron recubiertas individualmente sobre placas de ELISA. El MS17-57 purificado añadió en el plato, más secundaria de anticuerpos HRP-amplificado las señales de unión (Figura 3). Este ELISA indirecto demostró que MS17-57 todavía podía unirse específicamente a la diana desnaturalizado (s) de la proteína de membrana de la célula de los lisados celulares de cáncer. MKN45 células expresan el objetivo MS17-57 a un nivel más alto que BGC823 o GES-1 en las células hizo, lo que indica que los niveles de expresión de destino pueden diferir entre las líneas celulares. Se utilizaron
células MKN45, BGC823, SGC7901, y MKN28 en experimentos, pero las líneas celulares MKN45 y BGC823 fueron seleccionados al azar como ejemplos en esta figura. MS17-57 expresó fuertes señales de unión a las células MKN45 y las señales de unión moderada a BGC823 células y GES-1 en las células. Los lisados celulares se recubrieron con 1,0 mg /ml PBS en Immulon II-HB placas de 96 pocillos de ELISA (100 l /pocillo). Las concentraciones de proteína de estos lisados celulares fueron equilibrados, pero no para los objetivos vinculantes (AGS) que podrían ser una gran variación. Irrelevantes mAb se utilizó como control de isotipo.
Localización de Objetivos MS17-57 sobre las células cancerosas
MS17-57 ligado a todas las líneas celulares de cuatro GC utilizados para la inmunización, aunque la unión señales no fueron de igual intensidad (Figura 4A). El nivel de expresión de MS17-57 objetivo fue mayor en células MKN45 y la más baja en las células SGC7901. Al igual que en los resultados del contador de detección, MS17-57 mAb no se unió a las PBMC humanas. Se se unió a algunos otros tipos de células GC (Figura 4B), pero no a las células GI (Figura 4C). Por lo tanto, el objetivo (s) de MS17-57 no se expresan universalmente, aunque parecen ser más comunes en las células de GC que las células gastrointestinales.
A.MS17-57 ligado a todas las líneas celulares que eran cuatro GC utilizado para la inmunización de células vivas. B. MS17-57 exhibió fuertes señales de unión en las células AGS GES-1 y pero no hay señal de unión en PBMCs humanos. C. MS17-57 no se unió a las PBMC humanas ni ninguno de los cinco células tumorales GI. Irrelevante mAb se utilizó como control de isotipo mAb.
tejidos tumorales frescas y tejidos cancerosos adyacentes de seis pacientes con cáncer gástrico se tiñeron para MS17-57 y mAb de control de isotipo y luego se cuantificó con la unión de FACS-HTS dependiente de la dosis. En general, la señal de unión de MS17-57 era más fuerte en los tejidos tumorales que en los tejidos no cancerosos (
P
& lt; 0,03) (Tabla 1 y Figura 5). Este experimento demostró que MS17-57 puede unirse a sus objetivos en su forma nativa en la superficie de las muestras tumorales frescas.
GC paciente
Tissue
mAb
MFI
% teñido pico
sustraído IMF
2
normalizado IMF
3
paciente-1TumorIsotype Ctrl6.150.5113.0611.56MS17-5719.2118.23NormalIsotype Ctrl11.620.3215.898.76MS17-5727.5111.58Patient-2TumorIsotype Ctrl10.962.836.155.78MS17- 5717.1111.94NormalIsotype Ctrl28.3110.48-12.592.06MS17-5715.728.26Patient-3 * TumorIsotype Ctrl ---- MS17-57 - NormalIsotype Ctrl ---- MS17-57 - paciente-4TumorIsotype Ctrl3.760.18.2711.83MS17-5712.0313 NormalIsotype Ctrl4.90.861.294.67MS17-576.193.82Patient-5TumorIsotype Ctrl8.583.2-0.53.48MS17-578.084.02NormalIsotype Ctrl9.515.32-4.651.89MS17-574.861.08Patient-6TumorIsotype Ctrl7.95.488.317.59MS17-5716.217.63NormalIsotype Ctrl10.3310.213 pylori
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