Extracto
La arquitectura factor de transcripción HMGA2 se expresa abundantemente durante el desarrollo embrionario. En varias neoplasias malignas, incluyendo cáncer de próstata, de alta re-expresión de
HMGA2
se correlaciona con malignidad y mal pronóstico. El
let-7
familia miARN se describe para regular
HMGA2 de
negativamente. El saldo de
let-7
y
HMGA2
se discute a desempeñar un papel importante en la etiología del tumor. A fin de analizar el papel de HMGA2 en el cáncer de próstata de forma estable y altamente reproducible
in vitro
sistema de modelo in es condición previa. En esto hemos establecido una línea CT1258-EGFP-HMGA2 de células de cáncer de próstata canina que sobreexpresan de forma estable HMGA2 relacionado con EGFP y, además, la línea celular de referencia CT1258-EGFP expresar EGFP exclusivamente para excluir los efectos inducidos por EGFP. Ambas líneas celulares recombinantes se caracterizaron por microscopía de fluorescencia, citometría de flujo e inmunocitoquímica. El efecto proliferativo de HMGA2 ectópica sobreexpresa se determinó mediante ensayos de BrdU. cariotipo comparativo de los derivados y las líneas celulares CT1258 iniciales se realizó para analizar la consistencia cromosoma. El impacto de la ectópico
HMGA2
expresión de su regulador
let-7a
fue analizado por cuantitativa en tiempo real PCR. Microscopía de fluorescencia y inmunocitoquímica detectó la expresión exitosa de la proteína de fusión EGFP-HMGA2 acumular exclusivamente en el núcleo. Los análisis de la expresión génica confirmó
HMGA2
sobreexpresión en CT1258-EGFP-HMGA2 en comparación con CT1258-EGFP y células nativas. Significativamente mayor
let-7a se encontraron niveles de expresión en
CT1258-EGFP-HMGA2 y CT1258-EGFP. Los ensayos de BrdU detecte un aumento de la proliferación de células CT1258-HMGA2-EGFP en comparación con CT1258 CT1258-EGFP y nativa. Los análisis citogenéticos de CT1258-EGFP y CT1258-EGFP-HMGA2 resultaron en un cariotipo hiperdiploide comparable a la descrita para las células nativas CT1258. Para investigar más a fondo el impacto de HMGA2 sobreexpresada recombinante en células CT1258, otros objetivos seleccionados descritos que la base de la regulación HMGA2 se rastrearon además. La nueva línea celular CT1258-EGFP-HMGA2 fluorescente es una herramienta estable que permita un
in vitro
y
in vivo
análisis de los efectos HMGA2 mediada por células y en el desarrollo y la patogénesis del cáncer de próstata.
Visto: Willenbrock S, S Wagner, Reimann-Berg N, Moulay M, Hewicker-Trautwein M, Nolte I, et al. (2014) Generación y caracterización de un EGFP-HMGA2 cáncer de próstata canina
in vitro
Modelo. PLoS ONE 9 (6): e98788. doi: 10.1371 /journal.pone.0098788
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 17 Febrero, 2014; Aceptado: May 7, 2014; Publicado: 10 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Willenbrock et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Ningún tercero los fondos del partido apoyaron este estudio. El estudio fue financiado con el presupuesto interno de la Clínica de Pequeños Animales de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Con esto los autores confirman que Jörn Bullerdiek, un co-autor en publicaciones anteriores de colaboración, es un miembro de PLOS ONE Consejo Editorial. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas editoriales.
Introducción
De acuerdo con recientes estadísticas mundiales sobre el cáncer, el cáncer de próstata es la segunda causa más frecuente de cáncer diagnosticados y la sexta causa principal de muerte entre las los varones en los países económicamente desarrollados [1]. Además del hombre, el perro es la especie de mamíferos domesticados sólo se conoce en desarrollo del cáncer de próstata espontánea con un interés considerable [2].
A diferencia de la situación en los hombres, la incidencia de carcinomas de próstata canina es baja contable de 0,2 a 0,6% de neoplasias caninas [3]. Sin embargo, la enfermedad es localmente invasivo en ambas especies con una progresión similar, el patrón metastásico y la histopatología [2], [4].
La edad media al diagnóstico en los perros es de diez años y, por tanto, que afecta principalmente a las personas mayores como también se informó en los hombres [5] - [7]. Teniendo en cuenta la edad fisiológica al momento del diagnóstico del cáncer de próstata, el tiempo de vida respectiva es similar entre las dos especies que muestran una mayor incidencia con la edad [6].
En los seres humanos, el cáncer de próstata es el cáncer más bien por lo general una evolución lenta, mientras que la próstata canina el cáncer está creciendo rápidamente, muy agresivo y menos diferenciados que presenta un mal pronóstico [3], [8]. El cáncer de la glándula prostática canina no responde a la terapia de privación de andrógenos parecido, sobre todo cáncer de próstata humano pobremente diferenciado de andrógenos refractaria [4], [9]. Debido a las similitudes relativas a la presentación de cáncer de próstata humana y canina, el perro últimamente se ha centrado como modelo animal complementaria natural útil para la evaluación de nuevos tratamientos contra el cáncer de próstata [10].
La detección temprana del cáncer de próstata en los hombres es Actualmente se está haciendo uso de marcadores moleculares bioquímicas tales como el antígeno prostático específico (PSA) y antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) con un éxito considerable establecida.
en comparación con la situación en los seres humanos, en el cáncer de próstata se diagnostica perros en una estadio de la enfermedad muy tarde debido a la ausencia de herramientas de marcadores fiables específico de la próstata bioquímicos pronóstico y el tratamiento sigue siendo paliativo ya que aún no existe un enfoque terapéutico estándar para el tratamiento del cáncer de próstata canina está disponible [11], [12]. Aunque varios estudios informan de inmunoreactividad para PSA humano en el cáncer de tejido de la próstata y la próstata no neoplásico canino, hasta ahora a PSA no se pudo encontrar en el plasma de cáncer de próstata que lleva perros [9], [12] - [16].
en consecuencia, la identificación de biomarcadores moleculares fiables, tales como PSA y PSMA en los hombres, lo que permite una detección temprana y el pronóstico fiable de cáncer de próstata canina sería de valor significativo para el desarrollo y la evaluación de estrategias terapéuticas futuro, así como la evaluación de la respuesta al tratamiento [2].
En este contexto, la proteína de alta movilidad-Grupo A2 (HMGA2) se ha descubierto recientemente para servir potencialmente como un marcador pronóstico de las neoplasias prostáticas caninas [17]. En este documento, el análisis de un subconjunto de diferentes muestras de tejido de próstata canina mostró claramente que la expresión de
HMGA2
aumenta significativamente en correlación con el grado maligna de las muestras de tejido [17]. Además,
HMGA2
se encontró para servir como un potencial marcador de diferenciación de T- maligno canino y linfoma de células B [18] y a ser fuertemente aumentada en carcinoma de células escamosas orales canino (datos no publicados).
en los seres humanos, una re-expresión de
HMGA2
también se constató en diversos tumores malignos tales como leucemia [19], [20], linfoma [18], de mama [21], páncreas [22] , no microcítico de pulmón de células [23], oral de células escamosas [24], y el carcinoma de tiroides [25] es un indicador de mal pronóstico. En un estudio reciente, la expresión de la proteína HMGA2 se demostró que era significativamente mayor en los tejidos tumorales en comparación con tejidos normales adyacentes [26]. Además, un
participación HMGA2
en la inducción de la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) en la línea celular de cáncer de próstata humano se encontró PC-3 [26].
Estos hallazgos sugieren HMGA2 que juega un papel central en diferentes entidades tumorales, incluyendo el cáncer de próstata en ambas especies apoyando fuertemente
HMGA2
re-expresión como marcador tumoral pronóstico.
en general, la proteína HMGA2 es muy conservadas en abundancia expresado durante el desarrollo embrionario de acción como un factor de transcripción de arquitectura en el núcleo [27], [28]. Dentro de este papel, se informó ampliamente HMGA2 estar implicado en una variedad de procesos celulares, tales como la expresión de genes, la inducción de la transformación neoplásica, y la promoción de metástasis [29], [30].
La expresión de
HMGA2
se regula a través de micro ARN (miARN) de la
let-7
familia mediante la unión a secuencias localizadas en la región no traducida 3 '(UTR) de la transcripción [31] - [35], todos los cuales se conservan en los roedores, perro, pollo y [36] - [38]. La unión de
let-7
miRNAs a secuencias complementarias regula post-transcripcionalmente la expresión de
HMGA página 2 de una manera negativa [31], [35], [39], [40]. Recientemente, un desregulado
let-7
expresión se asoció con cáncer de pulmón [41], [42], de mama [43] y el cáncer de próstata [44].
La próstata canina adenocarcinoma derivado CT1258 línea celular [45] - [47] utilizado en el presente estudio se analizaron también para
HMGA2
la expresión del marcador por nosotros revelando una fuerte sobreexpresión (datos no publicados). Este resultado permite a la hipótesis de que una sobreexpresión de este gen diana es probable que desempeñe un papel importante en el cáncer de próstata canina, la promoción de la proliferación de células tumorales.
Para verificar esta hipótesis, la disponibilidad de herramientas estables que permiten la evaluación de la descrito
HMGA2 CD -
let-7
eje en el cáncer de próstata
in vitro
y
in vivo
es condición previa. líneas celulares, por tanto, establecimos transfectadas de forma estable de CT1258 proporcionan un
in vitro
sistema fiable para analizar los aspectos clave de nuestra hipótesis.
Se analizaron los efectos proliferativos de abundantemente expresado recombinante
HMGA2
sobre las células CT1258. Por lo tanto, una línea celular estable que expresa CT1258 HMGA2 EGFP-etiquetados recombinante (CT1258-EGFP-HMGA2) se generó usando un constructo de vector de expresión que contiene la secuencia de codificación (CDS) del canino
HMGA2
gen que carece de la 5'UTR y 3'UTR y por lo tanto no subyacente a los mecanismos de regulación negativos directos por
let-7
[31].
para evaluar la funcionalidad del vector de expresión recombinante y HMGA2 para monitorear la actividad biológica de el recombinante expresada HMGA2, se añadió una etiqueta GFP a la
HMGA2
CDS generando una proteína de fusión GFP-HMGA2. Para excluir que la proteína GFP tiene un efecto sobre la proliferación de células, únicamente se generó una línea celular estable más CT1258 (CT1258-EGFP) que expresan GFP. El
HMGA2
y
let-7a
expresión se determinó a través cuantitativa en tiempo real PCR en CT1258-EGFP-HMGA2 y CT1258-EGFP en comparación con las células nativas CT1258.
Además, la expresión de HMGA2-objetivos directos e indirectos seleccionados, tales como
HMGA1
[48],
Snai1
[49],
SNAI2
y
CDH1
se analizó [49].
Para caracterizar la proliferación de las tres líneas celulares descritas, se realizaron ensayos de incorporación de BrdU. cariotipo análisis comparativos de los recién generados y las líneas celulares CT1258 iniciales se llevaron a cabo, además, para identificar los cambios citogenéticos posiblemente ocurren durante la integración del plásmido en el genoma de CT1258 durante el establecimiento de las líneas celulares recombinantes estables
.
En resumen, el nueva línea celular CT1258-EGFP-HMGA2 canina fluorescente proporciona una valiosa herramienta para futuras investigaciones sobre los efectos proliferativos HMGA2 mediada por mecanismos de regulación y HMGA2 que aclaren el desarrollo y la patogénesis del cáncer de próstata canina. A medida que el perro representa un modelo natural único para el cáncer de próstata humano, los conocimientos relativos a la participación de HMGA2 en el cáncer de próstata canina proporcionarán beneficios para ambos, los humanos y los perros, en relación con el desarrollo de estrategias terapéuticas y la evaluación del éxito del tratamiento.
Métodos
línea celular CT1258
las condiciones de cultivo celular, así como las características del carcinoma de próstata línea celular canina CT1258 se han descrito previamente por nosotros [45], [46 ].
pEGFP-C1
HMGA2
plásmido de expresión
la proteína de la secuencia de codificación del canino
HMGA2
fue amplificado por PCR utilizando el par de cebadores EcoRI_sA2_lo ( 5'-CGGAATTCCTAGTCCTCTTCGGCAGACT-3 '), BamHI_sA2_Up (5'-CGGGATCCCACCATGAGCGCACGCGGT-3'). Los productos de PCR obtenidos se separaron en un gel de agarosa al 1,5%, se recuperó con QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania), se ligaron en el pEGFP-C1 vector plásmido (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se secuenció para verificación. Transfección con el pEGFP-C1
HMGA2
construir conduce a la expresión de una proteína de fusión EGFP-HMGA2 recombinante que se espera que esté localizada en el núcleo.
Generación de líneas celulares fluorescente CT1258
la transfección de células CT1258.
se sembraron 300.000 células CT1258 nativas en placas de 6 pocillos 24 horas antes de la transfección y se cultiva en condiciones estándar utilizando medio 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemania) suplementado con 10% de FCS (PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Alemania), y 2% de penicilina /estreptomicina (Biochrom AG, Berlin, Alemania).
la transfección se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando 7,5 l Mirus TransIT-2020 reactivo (Mirusbio LLC, Madison, WI, EE.UU.) en 250 l medio Opti-MEM I reducida suero (Life Technologies, Darmstadt, Alemania) que contiene 2,5 g de pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) o plásmido pEGFPC1-HMGA2 recombinante. Después del tratamiento, las células se incubaron durante 24 horas en el medio de cultivo. La captación y la expresión de ADN se verificó mediante microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia Leica DMI 6000B (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Alemania).
ensayo de curva de muerte selectiva antibiótico G418.
Antes de la generación líneas de células fluorescentes CT1258, la valoración de la cantidad apropiada de la selectiva antibiótico G418 (geneticina; syn. Life Technologies, Darmstadt, Alemania) requeridos para la selección de células CT1258 se llevó a cabo con un ensayo de curva de muerte. Se aplicaron diferentes concentraciones de G418 (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 g /ml) en 100.000 células CT1258 nativas sembradas en los pocillos de una placa de 12 pocillos. Para la selección de células positivas después de la transfección se utilizó la concentración en la que ninguna célula sobrevivió a las condiciones superiores después de siete días.
selección de las células transfectadas positivamente CT1258.
variantes fluorescentes de la línea celular fueron CT1258 establecido para expresar constitutivamente la proteína verde fluorescente (EGFP) codificada por el plásmido vacío pEGFP-C1 y una proteína de fusión EGFP-HMGA2 por la expresión del recombinante pEGFP-C1
HMGA2
plásmido. Para establecer las líneas celulares estables CT1258, se seleccionaron las células transfectadas con el antibiótico G418 (Life Technologies, Darmstadt, Alemania).
Inicialmente una concentración de 400 mg de G418 /ml en el medio se utilizó en la selección para estable Células. Un día después de la transfección, el medio de cultivo 199 se reemplazó con medio 199 que contiene G418. Posteriormente, el medio de selección se cambió cada 24 a 48 horas para las dos primeras semanas que conduce a la selección de células que han incorporado de forma estable el plásmido GFP con el antibiótico neomicina codificada gen de resistencia para la selección en células de mamífero en su ADN genómico. Células que no expresan el constructo serán asesinados por G418. La concentración de G418 se redujo a 300 mg /ml al cabo de tres meses de selección consistente para el mantenimiento de las líneas de células fluorescentes generadas.
microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (FCM)
expresión de GFP de la líneas de células fluorescentes CT1258-EGFP y CT258-EGFP-HMGA2 se analizó después de G418-selección por microscopía de fluorescencia y se cuantificaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Alemania) con el canal de FL-1 para determinar el porcentaje de células positivas para GFP. Las células se tripsinizaron durante 3-5 minutos, se resuspendieron en BD FACSFlow fluido de funda (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) que contiene 1 M A-PRO-3 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemania), y en una se midió la cantidad total de 1 × 10
4 eventos para cada muestra mediante citometría de flujo. A-PRO-3 es una célula impermeant colorante de ácidos nucleicos rojo lejano medido en el canal de FL-4 que permite la detección ultrasensible de ADN de doble cadena de células muertas. El análisis de la citometría de flujo de datos se realizó utilizando el software Cell Quest (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.).
inmunocitoquímica
Incorporación de las líneas celulares.
Las suspensiones celulares de líneas de células cultivadas fueron fijadas en formol al 4%. Los sedimentos celulares obtenidos por centrifugación se incluyeron en parafina y se cortan en rodajas de 3-4 micras para la tinción inmunocitoquímica.
inmunocitoquímica tinción.
Para la recuperación de antígenos, el calentamiento por microondas de las secciones de parafina en ácido cítrico 0,01 M tampón (pH 6,0 durante 20 min) (Quartett, Berlín, Alemania) se realizó. La inhibición de la actividad de peroxidasa endógena se logró mediante la inmersión en 0,5% H
2O (v /v)
2 en metanol (20 min). Después de drenar el suero de bloqueo, las secciones se incubaron con un anticuerpo policlonal de cabra anti-humano HMGA2 (I + amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) diluido 1:400 en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2, 0,15 M) aproximadamente 16-18 horas a 4 ° C. Después de lavar en PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo conjugado con biotina a IgG de cabra (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). El reactivo de avidina-biotina-peroxidasa (Vector Laboratories), se aplicó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cromógeno utilizado fue 3'3-diaminobencidina-tetrahidrocloruro (Sigma Aldrich, München, Alemania) 0,05% (w /v) con 0,03% H
2O
2 (v /v) como sustrato en 0,1 M Tris solución salina tamponada (Tris-hidroximetil-aminometano; Merck, Darmstadt, Alemania). Las secciones se counterstained Mayers con hematoxilina y montadas. Se realizaron controles negativos mediante la sustitución de los anticuerpos primarios por suero de cabra normal. Para el establecimiento de las reacciones de tinción inmunocitoquímica, se utilizaron secciones de parafina de un carcinoma oral de células escamosas canina.
El aislamiento de ARN y síntesis de ADNc de
El ARN total de la EGFP y EGFP-HMGA2 expresando así como nativo se aislaron células CT1258 usando el NucleoSpin miRNA (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante, incluyendo una en la columna DNasa digestión para eliminar posibles contaminaciones de ADN genómico.
las respectivas síntesis de ADNc con ARNm como plantilla se realizaron usando 250 ng de ARN total de cada muestra y el kit de transcripción inversa QuantiTect siguiendo el protocolo del fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania).
Para la transcripción inversa del miRNAs 30 ng de ARN total de cada muestra, el se utilizaron TaqMan MicroARN transcripción reversa kit y el cebador de transcripción inversa dotado de los ensayos TaqMan microARN. Todas las etapas se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania).
HMGA1, HMGA2, Snai1, SNAI2
y
CDH1
-PCR en tiempo real
Para la cuantificación relativa de la
HMGA2, HMGA1, Snai1, SNAI2 Opiniones y
CDH1
los niveles de transcripción en relación con el gen endógeno controles
GUSB
y
HPRT1
amplificaciones de PCR se llevaron a cabo usando el sistema de PCR en tiempo real realplex (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) Eppendorf Mastercycler ep.
se amplificaron 2 l de cada ADNc correspondiente a 25 ng de ARN total en un volumen total de 20 l utilizando el TaqMan PCR Master Mix universal (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) con 600 nM de cada cebador y 200 nM sonda fluorogénico para canina
HMGA1, HMGA2
análisis de la expresión génica (publicada anteriormente por nosotros en Joetzke et al. [18]. comercialmente disponibles ensayos de expresión génica TaqMan fueron utilizados para el análisis de los objetivos caninos
Snai1 gratis (Cf02705362_s1),
SNAI2 gratis (Cf02701218_u1) y
CDH1 gratis (Cf02697525_m1), así como para los controles endógenos, canino
GUSB gratis (Cf02622808_m1) y canina
HPRT1 gratis (Cf02626258_m1) (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania).
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:. 2 min a 50 ° C y 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos con 15 s a 95 ° C y 1 min a 60 ° C
Todo muestras se midieron por triplicado y para cada uno de los controles no plantilla ejecutado y reacciones de control de la transcriptasa inversa no se incluyeron. Un análisis de la eficiencia precedente de todos los ensayos de PCR utilizados en este estudio se llevó a cabo mediante la aplicación de la misma plantilla en diferentes etapas de dilución que abarca una magnitud de cinco (ADNc correspondiente a 100 a 0,001 ng de ARN). Las reacciones de PCR de todos los genes diana analizados mostraron eficiencias comparables, lo que garantiza un análisis PCR en tiempo real relativa apropiada. Para el análisis basado en células nativas CT1258 método ΔΔCT se definieron como calibrador.
Let-7a
,
RNU6B
-PCR en tiempo real
Cuantificación relativa del canino
let-7a
y
RNU6B
los niveles de transcripción de los genes miARN se llevaron a cabo utilizando el ep Eppendorf Mastercycler realplex Sistema de PCR en tiempo real (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). 1,33 l de cada ADNc fueron amplificados en un volumen total de 20 l utilizando TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania), n AmpErase UNG y ensayos TaqMan microARN para
let-7a gratis (ensayo ID: 000377) y
RNU6B gratis (Ensayo Identificación:. 001.093) (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) |
Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos con 15 s a 95 ° C y 1 min a 60 ° C.
Todas las muestras se midieron por cuadruplicado y para cada plantilla controles no ejecutado y reacciones de control de la transcriptasa inversa no fueron incluidos.
análisis de la eficiencia de los ensayos precedentes miRNA PCR que fueron utilizados en este estudio se llevó a cabo mediante la aplicación de la misma plantilla en diferentes etapas de dilución, que muestra las eficiencias comparables. Para el análisis basado en el método ΔΔCT el grupo de control se define como la realización de calibrador relativa PCR en tiempo real con
let-7a
como gen diana.
Análisis estadístico de PCR en tiempo real
se realizó un análisis estadístico de los resultados relativos de PCR en tiempo real la aplicación de la prueba de hipótesis con el resto herramienta de software de 2009, la versión 2.0.13 (Qiagen, Hilden, Alemania) [50]. REST determina si existe una diferencia significativa entre las muestras y los controles, teniendo en cuenta la eficiencia de la reacción y el uso de técnicas de asignación al azar. Un valor de p de ≤0.05 se consideró estadísticamente significativo.
Ensayo de proliferación celular
La proliferación de las células nativas CT1258 en comparación con el CT1258 CT1258-EGFP y EGFP-HMGA2-fluorescente establecido líneas celulares se evaluó utilizando un colorimétrico proliferación de células BrdU ELISA (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Este ensayo mide la incorporación del análogo de timidina 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) en el ADN recién sintetizado de reproducción de las células por ELISA usando un anticuerpo monoclonal anti-BrdU.
Un total de 15.000 células /pocillo de cada línea celular se sembró en CT1258 ocho pozos diferentes y se cultivó a las condiciones anteriormente descritas. BrdU se añadió después de 24 h y se incubó durante dos horas. El ensayo de proliferación se llevó a cabo de acuerdo con (proliferación celular ELISA, colorimétrico, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) del fabricante de protocolo. Los productos de reacción se cuantificaron midiendo la absorbancia a 370 nm (longitud de onda de referencia 492 nm) con un máximo de 27 solo lee durante un período de tiempo de 30 min usando un espectrofotómetro de barrido de múltiples pocillos equipada con el software de análisis de Gen 5 (Synergy HT múltiples lector de microplacas -mode, BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichshall Alemania). Los resultados de absorbancia se correlaciona directamente con la cantidad de la síntesis de ADN y de esta manera el número de células en proliferación.
Los resultados se expresan como valores medios de absorbancia expresadas como Max V [delta 370-492] y presentados como media ± desviación estándar . Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software OriginPro 8 (Origin Corporation, Northampton, EE.UU.). Se aplicó el test de Shapiro-Wilk para comprobar si los datos se distribuyen normalmente. Sobre la base de los resultados de la prueba de Shapiro-Wilk, se realizó una prueba t de muestras pareadas para evaluar la significación de las diferencias entre proliferativas CT1258-EGFP, CT1258-EGFP-HMGA2 y células CT1258 nativas. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativos para p = 0.05 *, ** p≤0.001 a 0,01 y *** p & lt;. 0.001
Cromosoma Preparación
Para la preparación del cromosoma CT1258-EGFP y CT1258- se añadieron células EGFP-HMGA2 colcemid (Biochrom AG, Berlín, Alemania) a una concentración final de 0,1 mg /ml para 90 min antes de la cosecha. Posteriormente, se incubaron las células durante 20 min en medio hipotónico (1: 6; medio 199: H
2O; (medio 199: Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemania)) y finalmente fija con ácido acético metanol /glacial (3 :1) siguientes métodos de rutina [51]. La suspensión se dejó caer sobre portaobjetos enfriado con hielo y se secó durante 5 días a 37 ° C, seguido de GTG-bandas, que se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente por [52]. Los resultados se procesan y se registran con BandView, 6.0, de múltiples especies, Applied sistema de imágenes espectrales, Israel. Descripción Cariotipo siguió a la nomenclatura propuesta por Reimann et al. [53].
Resultados
microscopía de fluorescencia y FCM
La microscopia de fluorescencia.
CT258 células transfectadas con el vector de expresión pEGFP-C1 no recombinante mostraron fluorescencia verde en todo el citoplasma debido a la expresión de EGFP (Fig. 1B) mientras que las células nativas no modificadas CT1258 no mostró fluorescencia EGFP (Fig. 1A)
a:. Transmitido imagen luminosa del patrón de crecimiento característico de las células nativas CT1258 . B: imagen combinada de células que expresan EGFP CT1258-EGFP; EGFP se localiza en el citoplasma. C: imagen combinada de las células CT1258-EGFP-HMGA2 que expresan la proteína de fusión EGFP-HMGA2 localizada en el núcleo. D-F: análisis de citometría de flujo de la expresión de EGFP en las tres líneas celulares de CT1258 representados en punto-gráficas que muestran la dispersión lateral (SSC) frente a EGFP fluorescencia. Sin fluorescencia de GFP se puede detectar en las células nativas CT1258 (D), el 84,1% de las células EGFP-positivas están presentes en la línea celular CT1258-EGFP y (F) 97,0% de células EGFP-positivas en CT1258-EGFP-HMGA2. Por muestra 1 × 10
se analizaron 4 eventos.
La transfección de CT1258 con pEGFPC1-HMGA2 dio lugar a la expresión de una proteína de fusión EGFP-HMGA2 canino recombinante que únicamente podría ser detectado en el núcleo de las células transfectadas (Fig. 1C).
FCM.
para la determinación de EGFP células positivas por FCM, ambas líneas celulares fluorescentes se compararon con células nativas no transfectadas CT1258 (Fig. 1D ). Muerto, TO-PRO-3 células positivas fueron eliminados colocando puertas antes del análisis EGFP positividad. Se midieron las células para CT1258 en el paso 319a, para CT1258-EGFP en el pasaje 27a, y para CT1258-EGFP-HMGA2 en el paso 113a.
La vitalidad de las líneas de células varió de 85% a 93 % (datos no mostrados). A media del porcentaje de células positivas 84,1% EGFP de la población total de células de la G418 selecciona la línea CT1258-EGFP de células (Fig. 1E) y 97,0% EGFP células positivas para la línea celular CT1258-EGFP-HMGA2 (Fig. 1F) se determinó .
inmunocitoquímica
Aproximadamente el 50% de la línea celular CT1258-EGFP tenía etiquetado nuclear para HMGA2 (Fig. 2B). En aproximadamente el 70-80% de las células CT1258-EGFP-HMGA2 se detectó fuerte de etiquetado para HMGA2, que era exclusivamente presentes en el núcleo (Fig 2C).
A:. Native células CT1258, B: CT1258-EGFP células, C: células CT1258-EGFP-HMGA2. Aproximadamente el 50% de la línea celular nativo y CT1258 CT1258 de las células-EGFP mostró un marcaje nuclear HMGA2-positivo. En aproximadamente el 70-80% de las células-HMGA2 CT1258-EGFP, un fuerte marcaje y exclusivamente nuclear para HMGA2 era detectable.
relativa
en tiempo real HMGA2
PCR Expresión Análisis
Todos los resultados de la PCR en tiempo real se analizaron con base en el método de ΔΔCT. La relación de expresión de
HMGA2
mRNA en células CT1258-EGFP se encontró que era 0,88 /0,92 en relación con
HPRT1 /GUSB
expresión en comparación con el nivel observado en las células CT1258 nativas (Fig. 3 ). En contraste, la
HMGA2
expresión en células-HMGA2 CT1258-EGFP fue 7,0 /8,0 veces mayor (con relación a
HPRT1 /GUSB
) cuando se compara con la expresión correspondiente en las células nativas CT1258 (Fig . 3).
relativa
HMGA2 /HPRT1 Opiniones y
GUSB
de expresión en células CT1258 nativa, HMGA2 /CT1258 CT1258-EGFP y EGFP-HMGA2-. Las barras de error son desviaciones estándar. * P = 0.05 indica una estadística desregulación expresión significativa de
HMGA2 Hoteles en células CT1258-HMGA2-EGFP en comparación con CT1258 nativa.
relativa
Let-7a
Análisis de expresión de PCR en tiempo real
El
let-7a
nivel de expresión en CT1258-EGFP y células CT1258-EGFP-HMGA2 fue de 2,0 y 3,1 veces mayor (en relación con
RNU6B
) cuando se compara con la expresión detectado en las células nativas CT1258 (Fig. 4).
relativa
let-7a
expresión /RNU6B en CT1258 nativa, CT1258 CT1258-EGFP y EGFP-HMGA2- Células. Las barras de error son desviaciones estándar. Ninguna expresión estadística significativa desregulación de los
let-7a Hoteles en CT1258 CT1258-EGFP y EGFP-HMGA2-fue detectado en comparación con las células nativas CT1258. valor de p estadísticamente significativa se definió como ≤0.05.
relativa
en tiempo real HMGA1
Análisis de Expresión PCR
El
nivel HMGA1
fue de 1,5 y 1,7 veces mayor (en relación con
HPRT1
y
GUSB
) en CT1258-EGFP-HMGA2. En las células CT1258-EGFP un incremento en la expresión similar no se pudo detectar (1.0 /1.0 en relación con
HPRT1
y
GUSB
) en comparación con las células nativas (Fig. 5).
relativa
HMGA1 /HPRT1 Opiniones y
GUSB
expresión en CT1258 nativa, células HMGA1 /CT1258 CT1258-EGFP y EGFP-HMGA2-. Las barras de error son desviaciones estándar. * P = 0.05 indica un incremento en la expresión estadística significativa de
HMGA1 Hoteles en células CT1258-HMGA2-EGFP en comparación con CT1258 CT1258-natal y EGFP.
relativa
Snai1, SNAI2
y
CDH1
Análisis de expresión de PCR en tiempo real
relativa
Snai1
la expresión de los genes de limpieza
HPRT1 /GUSB
se encontró que se 0,8 /0,8, respectivamente, en CT1258-EGFP y 1 /1,2 en el CT1258-EGFP-HMGA2 en comparación con las células nativas CT1258 (Figura S1).
relativa
SNAI2
expresión (en relación con
HPRT1 /GUSB
) se encontró 1.5 /1.6 en células CT1258-EGFP y 1,4 /1,6 en células CT1258-EGFP-HMGA2 en comparación con CT1258 (figura S2).
CDH1
apenas se expresó en todas las líneas celulares con Ct valores superiores a 36, por lo que un análisis por el método ΔΔCT no era posible.
-PCR en tiempo real análisis estadístico
la prueba de hipótesis de la relación en tiempo real los resultados de la PCR se realizó utilizando la herramienta de software REST de 2009, la versión 2.0.13 (Qiagen, Hilden, Alemania) [50]. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo por separado para el CT1258-EGFP y células CT1258-EGFP-HMGA2 en comparación con CT1258 nativa.