Extracto
IL-2 es el factor de crecimiento principal para promover la supervivencia y proliferación de células T activadas que se produce después el acoplamiento de la Janus quinasa (JAK) 1-3 /y transductor de señales y activador de la transcripción ( STAT) y la vía de señalización 5. STAT5 tiene dos isoformas: STAT5A y STAT5B (comúnmente conocidos como STAT5) que, en las células T, desempeñan funciones redundantes transcribir los genes del ciclo celular y la supervivencia. Como tal, la inhibición de STAT5 por una variedad de mecanismos puede inducir rápidamente la apoptosis en ciertas células tumorales linfoides, lo que sugiere que él y sus genes diana representan dianas terapéuticas para controlar ciertas enfermedades linfoides. Para buscar estas moléculas que se suman IL-2 genes regulados detectados por Affymetrix microarrays de expresión génica con el cistrome STAT5 identificado por análisis de chip-on-chip en una línea celular de leucemia humana IL-2-dependiente, Kit225. Seleccione la superposición de genes fueron validados utilizando Qrt
2PCR matrices de mediano rendimiento en PBMCs activadas con PHA humanos. De los 19 genes putativos, uno regulador clave de la señalización del receptor de células T, PDE4B, fue identificado como una nueva diana, que era fácilmente hasta reguladas a nivel de proteínas (3 h) en IL-2 estimuladas, las PBMC humanas activadas. Sorprendentemente, sólo CD8 purificado + células T primarias expresaron PDE4B, pero no las células CD4 +. Por otra parte, PDE4B se encontró que estaba altamente expresado en las células CD4 + células de cáncer linfoides, lo que sugiere que puede representar un papel fisiológico único para el CD8 + y las células de cáncer linfoides y por tanto, podría representar una diana para la intervención farmacéutica para ciertas enfermedades linfoides.
Visto: Nagy ZS, Ross JA, Rodríguez G, Balint BL, Szeles L, L Nagy, et al. (2013) Genome Mapping ancha revela PDE4B como IL-2 inducida por STAT5 objetivo de genes en PBMC humanas activadas y células de cáncer linfático. PLoS ONE 8 (2): e57326. doi: 10.1371 /journal.pone.0057326
Editor: Ramin Homayouni, Universidad de Memphis, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Septiembre, 2012; Aceptado: January 21, 2013; Publicado: 25 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Nagy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) de subvención número AI053566 a Rak y una subvención para el proyecto piloto para ZSN (programa SCORE NIGMS, conceder S06 GM008012-37), y hecha posible por número de concesión 5G12RR008124 del Centro Nacional de Recursos de Investigación, un componente del NIH. ZSN es el destinatario de la János Bolyai Investigación Felowship de la Academia de Ciencias de Hungría y es apoyado por el NKTH-OTKA-UE 7KP (acciones Marie Curie) Reintegración Grant (OTKA MB08C 84630). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El mamíferos transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) de la familia está compuesta por 7 miembros (1-4, 5a, 5b y 6). moléculas STAT ejercen un papel crítico en la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia (revisado en [1]). Originalmente, se creía que STAT ser factores latentes que residen en el citosol y sólo activan cuando las citocinas se unen a su receptor afín después de la activación de tirosina quinasas Janus (JAK). De hecho, el modelo central sugiere que JAKs fosforilan residuos de tirosina en el receptor de servir como sitios de atraque para moléculas de señalización que contienen el dominio SH2 tales como estadísticas. A raíz de acoplamiento a través de interacciones de fosfo-SH2, estadísticas mismos se convierten en tirosina fosforilada por JAK, desenganche del receptor y formar dímeros a través de las interacciones de dominio fosfotirosina-SH2 recíprocas. El dímero STAT es entonces transloca al núcleo para iniciar la transcripción de genes [2] - [3]. Sin embargo, ahora sabemos que pueden STATS dimerize y tetrámeros de formulario en la ausencia de fosforilación de la tirosina y ser localizados nuclear para controlar la regulación de genes en muchos aspectos únicos que son menos conocidos [4] - [5].
Lo que está claro es que STAT 1, 3, 5A y 5B son ampliamente utilizados por diversas citoquinas y son importantes para la regulación del crecimiento celular, la proliferación y la muerte, mientras que STAT 2, 4 y 6 promueven defensa viral y Th1 frente a Th2 diferenciación, respectivamente. Por otra parte, STAT3 y STAT5 se han encontrado para ser estrechamente relacionados y relevantes para la tumorigénesis (revisado en [1]). De hecho, las formas constitutivamente tirosina fosforilados de STAT5 se observan fácilmente en una variedad de células cancerosas y tejidos de distintos orígenes, como resultado de la translocación cromosómica, tirosina quinasas desreguladas y transformación viral (revisado en [1]).
La papel fisiológico de STAT5A y B se deriva en gran parte de
in vivo
estudios de Stat5a y B knockout animales. A partir de estos estudios, parece claro que STAT5A participa principalmente en el desarrollo de la glándula mamaria [6] y STAT5B es responsable de regular el crecimiento a través de la hormona del crecimiento señalización [7]. En los linfocitos T, sin embargo, tienen funciones de compensación: Los estudios de STAT5A /B doble ratones deficientes mostró que tienen funciones redundantes en la mediación de la progresión del ciclo celular de las células T activadas [8], [9]. Además, los estudios que emplean ratones nulos STAT5A /B indican que estas moléculas son importantes para el desarrollo de órganos linfoides como una deficiencia en estas proteínas puede dar lugar a graves fenotipo de inmunodeficiencia combinada [10]. Por otra parte, STAT5 parece actuar como un factor de supervivencia esencial para las células T, ya que constitutivamente activa (es decir, tirosina fosforilada) STAT5 está presente en linfoides y células cancerosas leucémicas entre otros tipos de tumores a menudo en comparación con las células normales, no transformadas (revisado En 1]). Además, el bloqueo de la expresión de STAT5 en células mononucleares de sangre periférica humana, así como las células de cáncer linfoides y leucémicas gravemente la viabilidad celular compromiso e inducir la muerte celular apoptótica [11]. La evidencia de muchos grupos sugiere que STAT3 desempeña un papel oncogénico similar a STAT5 y depende del tipo celular, uno puede ser más dominante [12]. Los nuevos resultados para esta familia de proteínas también sugieren que su supervivencia celular promoviendo características cuando está fosforilada por la ONU puede desempeñar un papel regulador de genes, así [4]. Estos datos ayudan a proporcionar nuevos modelos interesantes que sugieren que el desacoplamiento farmacológico de activado, así como STAT5 des-activado puede ser obligado a interrumpir sus genes diana para inducir la muerte de células cancerosas. Por lo tanto, la identificación de supervivencia de las células tumorales y relevante genes diana STAT5 es un objetivo importante para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer.
Un método que ha demostrado su eficacia en la identificación de nuevos genes diana es la inmunoprecipitación de la cromatina que puede revelar la transcripción directa interacciones de ADN del factor de [13] y permite la identificación de sitios de unión de factores de transcripción desconocido en nuevos genes diana mediante la generación de una biblioteca de todo el genoma que puede ser (i) secuenciado y se encuentra en el genoma humano, o (ii) se hibridaron a microarrays que representa regiones no codificantes del genoma. mapeo de todo el genoma de citoquinas inducida por los genes diana STAT5 se han realizado y publicado en diversos tipos de células (T-, pre-B-, las células tumorales de cáncer de mama y NK-como humanos) utilizando tecnologías de chip-clon o chip-Seq [4] [14] - [18]. En particular, la cartografía de IL-2 inducible STAT5 se han realizado y publicado por tanto de ratón [5] eventos y cambios de la transcripción en las células T primarias utilizando ChIP-Seq, microarrays de expresión génica, o la tecnología de RNA-Seq de unión [16], [19, ], [20] y humanos [16], [19] modelos. Estos estudios importantes se centraron principalmente en el papel de STAT5 en la diferenciación de la célula ayudante T y las respuestas inmunes fisiológicas.
El presente trabajo buscó identificar la supervivencia celular y los genes diana clave STAT5 relevantes tumorales en células de leucemia de IL-2 dependientes humanos usando la expresión de genes y los estudios de microarrays promotor. Los resultados de los que se alinean y una piscina de selección de objetivos candidatos fueron luego validados en PBMCs activados humanos normales. Fosfodiesterasa (PDE) 4B, un regulador de la señalización de AMP cíclico en las células T ha demostrado ser IL-2 regulada en PBMCs humanos cebados y células T purificadas CD8 +. Es interesante que esta molécula era expresa fuertemente sobre-en el tumor linfoide pero no imprimado células T CD4 + primarias.
Resultados y Discusión
Un genoma enfoque para identificar genes específicos STAT5 mediadas por IL-2
STAT5 es un potente regulador de la supervivencia de las células T como sus resultados de agotamiento en la muerte celular masiva de T activadas y células tumorales linfoides [11] - [12]. Hasta la fecha, se han utilizado los estudios de genoma completo para identificar y localizar IL-2 regulados eventos de unión STAT5 y genes diana en el ratón normal [5], [16], [19], [20] y las células T humanas [16], [19] revisado en [21]. Sin embargo, en el presente estudio hemos tratado de identificar la IL-2 objetivos de genes mediada por STAT5 en todo el genoma de las células tumorales linfoides (Figura S1). Para asignar sistemáticamente los sitios de unión STAT5 en la escala genómica que definimos como la cistrome STAT5 [22] y la IL-2 mediada por cambios de expresión génica que empleamos microarrays. Para estos estudios se determinó en primer lugar el cistrome STAT5 utilizando chip-on-chip en las células IL-2 Kit225 dependiente que se dejaron un-estimulado o estimuladas con IL-2 durante 30 minutos, seguido de análisis de expresión génica posterior para detectar IL-2 mediada por mRNA cambia a las 3 horas. Los bancos de datos resultantes se analizaron estadísticamente y se alinean y un conjunto determinado de genes que albergaba sitios dentro de sus regiones promotoras de unión STAT5 se validaron utilizando el rendimiento medio QRT
matrices 2PCR.
Generación de una biblioteca de IL-2 reguladas Sitios de unión STAT5
en primer lugar, se realizaron tres repeticiones biológica de chIP utilizando una mezcla de anticuerpos dirigidos hacia el C-terminal de STAT5A y STAT5B en las células Kit225 estimuladas con IL-2 durante 30 min. El ensayo se validó mediante la medición del enriquecimiento inducida por IL-2 del potenciador IL2RA [23] elemento llamado Positive región reguladora (PRR) III (Figura 1A) a través de anticuerpos STAT5 en comparación con el suero de control. A continuación, el ADN capturado se amplificó tal como se describe en los Materiales y Métodos utilizando un protocolo de amplificación al azar. Para confirmar que las bibliotecas se mantuvieron enriquecido para el control positivo PRR elemento III post-amplificación, PRR III se midió utilizando qPCR (Figura 1B) a partir de todos los experimentos replicados. A continuación, el análisis de microarrays utilizando matrices 1.0R Affymetrix GeneChip humanos promotor se llevó a cabo empleando ADN genómico de entrada (como control) y la IL-2 estimulada muestras en tres repeticiones biológica como se describió anteriormente. Los "Cel archivos" resultantes se analizaron usando MAT (análisis basado en modelos de suelo de baldosas serie, [24]) que produjo "archivos" .bed con las coordenadas cromosómicas de todas las regiones, incluyendo el chip-p-valores, resultados MAT (a permitir el enriquecimiento en diferentes regiones de diferente longitud para ser comparado directamente), FDR (tasa de falso descubrimiento) de los cálculos y las banderas de repetición. elementos repetitivos de duplicación y segmentarios se retiraron y los 1581 golpes restantes fueron asignadas con CEAS (cis-regulador Sistema de Anotación Elemento) [25] a menos de 300 kb de regiones genómicas anotadas. Como se muestra en la figura 2A sólo alrededor del 17% de los genes candidatos se encuentran dentro de los promotores cercanos, mientras que alrededor del 25% y 42% se encuentran en potenciadores e intrones, respectivamente. Estos resultados están en buen acuerdo con los datos de otros que indican que la mayoría de los sitios de unión TF se encuentran en regiones intrónicas y intergénicas [26]. se volvieron a analizar para comparar nuestros resultados con los conjuntos de datos de chip-Seq publicados anteriormente, Stat5a y Stat5b sitios de unión derivan de las células T CD4 + humanas primarias (GSE27158, [16] utilizando un análisis de tuberías chip-Sec por Barta et al, [27 ]) y los picos resultantes se sometió a análisis CEAS. Los resultados resultantes para STAT5A y STAT5B distribución sitios fueron los siguientes: promotor ligado 21% y 19%, intrónica 34% y 35%, potenciador unido a 38% y 39%, respectivamente, lo que indica que la STAT5 genómico patrón de unión de los actuales chip-on-chip conjuntos de datos concuerdan estrechamente con los resultados de chip-Seq por Liao y sus colegas [16]. Curiosamente sólo alrededor del 20% de los sitios de unión STAT5 se limita a promotores. A continuación, el enriquecimiento de los motivos de unión TF también se analizaron con base en el valor de cambio veces CEAS asignado que representa motivos enriquecido significativamente con & gt; 2 veces de cambio dentro de las regiones de chip en todo el genoma. Figura 2B mesa superior y el panel muestra que los motivos TF con los mayores cambios veces incluyen los motivos de unión STAT clásica TTCNNNGAA en diversas formas. El elemento de respuesta sensible interferón (ISRE) también fue significativamente enriquecido que sugiere que en ciertas células STAT5 puede también posiblemente unirse a estos motivos: ya sea directamente o por la ayuda de otra TF que se une ISRE. Figura 2B inferior y el panel de tabla representan los sitios de unión TF más enriquecido significativamente. Curiosamente estos son STAT TTC sitios de media. Tal vez en estos tipos de células STAT5 se puede unir sitios de media, directa o indirectamente, lo que sugiere una regulación anormal ya que este tipo de unión a ADN no se ha observado
in vitro
[28].
(A ) Kit225 IL-2 dependiente de células de leucemia humana se hicieron en reposo y después se estimularon con medio (-) o IL-2 (+) durante 30 min a 37 ° C, se fijaron con 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente y después de la cromatina inmunoprecipitaron con anticuerpos para C-terminal STAT5A mezcla /B o el control de IgG. El ADN eluido se amplificó con cebadores correspondientes a la humana IL2RA PRR III. se muestran los datos representativos de tres experimentos independientes. material de entrada representa el 5% de la cromatina inmunoprecipitada. control de los granos representa muestras en las que la inmunoprecipitación se realizó sin ningún tipo de anticuerpos pero por lo demás se administrará de forma idéntica. (B) Las células fueron tratadas como se describe arriba y luego por los experimentos de microarrays de ADN del chip-ed se amplificó al azar después de la ligadura de enlazadores como se describe en la sección Materiales y Métodos de tres experimentos independientes. Se utilizó el ADN amplificado como molde en las reacciones de qPCR para medir el enriquecimiento de la IL2RA PRR III.
(A) la distribución de todo el genoma de STAT5 sitios de unión (por ciento del número total de sitios). El chip-on-chip identifica los elementos que cayeron a menos de 300 kb de regiones codificantes fueron analizados en función de su distancia de los genes cercanos utilizando CEAS. El gráfico representa la distribución "%". (B) motivos con mayor factor de cambio (panel superior) y la más alta significación (panel inferior) de unión del factor de transcripción enriquecido. se muestran los sitios y sus matrices en el chip-on-chip identifica, analiza CEAS elementos reguladores de unión TF enriquecido.
La identificación de IL-2 genes regulados en células Kit225 El uso de análisis de expresión génica
a fin de identificar genes IL-2 mediadas en células Kit225, las células agotadas de IL-2 fueron tratados con IL-2 o control del vehículo durante 3 horas y se sometieron a análisis de microarrays de expresión génica en dos réplicas biológicas. A partir de este análisis, 469 genes cambian mayor que 2 veces, con 129 abajo y 340 genes regulados incluyendo varios IL-2 objetivos mediadas tales como CISH, SOCS1, OSM, PIM-1, BCL6 y BCL2. Esta lista de genes se analizó con el software basado en web Ingenuity Pathway Analysis, que confirmó además STAT5A y estado de activación STAT5B siguiente IL-2 de tratamiento (Figura S2) y las redes celulares identificados pertinentes para la función inmune celular incluyendo Development & amp; Ciclo Celular, hematológica Desarrollo & amp sistema; Función, Desarrollo Reproductiva & amp sistema; Función, así como Celular Movimiento, Crecimiento & amp; La proliferación significativamente sobrerrepresentados (Figura S3).
Identificación de IL-2 genes regulados de la STAT5 Cistrome
Nuestro objetivo era descubrir un grupo de IL-2 genes de respuesta que contienen sitios de regulación STAT5. Por lo tanto, hemos creado de intersección de la cistrome STAT5 y las IL-2 genes de respuesta utilizando el Explorador de tablas UCSC. En primer lugar, el ID de Affymetrix de la piscina de la expresión génica se convirtieron en lugares del genoma (archivos .bed) que luego fueron alineados con los resultados de chip-on-chip. Estas piscinas se visualizaron en la escala genómica utilizando los "archivos" y .bed la Integrativa Genómica Visor (IGV, Figura 3). Desde la piscina de intersección comprendido de 106 genes, una lista de 57 genes que contenían los sitios de STAT5 de regulación dentro de su promotor proximal (30 genes), segmentos intermedios inmediatos del gen (7 genes), potenciador (14 genes) o primer exón (6 genes) se eligieron para la validación en PBMCs imprimados humanos (Figura 3 y en la Tabla S1) en el ARNm usando rendimiento medio QRT
2PCR de expresión génica arrays (descrito en los Materiales y Métodos y resultados estadísticamente significativos (p-valor. & lt; 0.05) se muestra en la Tabla 1). Las conocidas de IL-2 genes diana (indicados por asteriscos en la Tabla 1) BCL2, BCL6, CDK6 y IL2RA fueron identificados como IL-2 inducible genes con sitios de unión STAT5. Otros conocidos IL-2 genes diana tales como CISH, IFNG y FOXP3 también fueron identificados por GEA y por lo tanto se incluyeron como controles positivos en los arrays. Aunque se sabe que estos genes para ser regulada por STAT5, en las células Kit225 sus sitios de unión STAT5 no fueron identificados por el análisis de chip-on-chip, por lo que no podemos descartar un efecto específico del tipo celular. Para aclarar estos hallazgos, el IGV se utiliza para visualizar los lugares del genoma de conocida (Socs2, SOCS3, aRIL2, CISH, BCL2, BCL6 y CDK6 (Figura 4A) subrayadas son los identificados en nuestra pantalla) y 18 blanco desconocido IL-2 /STAT5 genes (Figura 4B). Entre éstos, por ejemplo, CD69 (hasta 2,3 veces) se ha demostrado que influyen en la diferenciación Th17, que es un proceso dependiente de STAT5 conocido [29]. CDKN2C, llamado de otra manera como p18 4c (tinta), es un conocido inhibidor de la iniciación del ciclo celular G1, que aquí es el regulado alrededor de 2 veces por IL-2. Proteína de linfocitos citosólica (LCP) 2 (1,7-plegar) es un objetivo para Zap70 quinasa en linfocitos T y su deficiencia se sabe que induce una ausencia de + timocitos doble positivos CD4 CD8 + y de las células T periféricas [30]. RAFTLIN (proteína balsa-linking) también se mostró a influir de células T respuestas inmunes mediadas y Th17 diferenciación [31]. STK17B es una quinasa serina también conocido como DRAK (DAP quinasa inductor de apoptosis relacionada con quinasa) 2 que se sabe que median la apoptosis inducida por IL-2 y regular la sensibilidad del receptor de células T en timocitos en desarrollo [32] - [33]. Fosfodiesterasa (PDE) 4 B es un tipo 4 PDE (hasta ~ 2 veces) que regula la señalización de TCR de un revenido el efecto negativo de cAMP [34] y en células T humanas CD4 + disminución de la expresión de PDE4B conduce a la reducción de la producción de IL-2 en contra CD3 /CD28 co-estimulación [35]. El sitio de unión STAT5 identificado chip-on-chip dentro del PDE4B se muestra en la Figura 4B, visualizada por el IGV. Curiosamente, la IL-2 aumenta el nivel de PDE4B, que contiene varios sitios de unión STAT5 intrónica, basado en estudios de células T murinas [5].
La visualización de los resultados obtenidos a partir de la identificación de todo el genoma de la IL-2 inducida por los genes y sitios de unión STAT5 (como se describe en la Fig. 1) utilizando el IGV.
(a) se muestra se conocen los genes diana STAT5 incluyendo Socs2, SOCS3, CISH y los que también identificado por chip-on -chip (IL2RA, BCL2, BCL6 y CDK6) y (B) 18 recién identificados promotor localizado genes visualizados por el uso de hg19 IGV.
STAT5 ocupa un sitio de respuesta putativos GAS IL-2 dentro del PDE4B gen
in vivo
en PBMCs humano
para confirmar que STAT5 es capaz de unirse a un sitio putativo de gas dentro del gen PDE4B (localizado en el cromosoma 1, posiciones hG18 66.567.898 a 66573077) en de manera inducible IL-2, hemos realizado experimentos de chIP en PBMCs humanos quiescentes dejaron sin tratar (-) o tratadas con IL-2 durante 30 min (+) aislado a partir de tres donantes independientes. Como resultado se observó que STAT5 obligado PDE4B de una manera IL-2 dependiente y significativa (p & lt; 0,05) con un aumento de aproximadamente 1,7 veces en comparación con las células no tratadas (Figura 5A). El IL2RA PRR III se utilizó como control positivo (Figura 5B). Curiosamente, el gen PDE4B contenía tanto STAT5A y Stat5b IL-2 sitios de unión que responden investigados dentro de las células T humanas primarias [16] que se superponen con nuestra región chip-on-chip. Por otra parte, el aumento de la actividad de unión a ADN STAT5 siguiente IL-2 de tratamiento se correlacionó bien con el aumento de 2 veces la observada en los niveles de mRNA (Tabla 1).
ensayos de chip realizado con anticuerpos STAT5 o sueros de control (IgG) se llevaron en reposo (-) hPBMCs o IL-2 estimuladas (30 min, +) aislados a partir de tres donantes independientes para medir el enriquecimiento de la región PDE4B STAT5 putativo regulado (a) o el promotor de IL2RA PRR III (B) identificado por CHIP- en el chip. Las entradas representan el 1% de la cromatina utilizado en los ensayos de chip y las barras de error representan las desviaciones estándar. * Representa las diferencias estadísticamente significativas (p & lt; 0,05) guía empresas
Corto Plazo IL-2 Tratamiento (3 h) induce la expresión de la proteína PDE4B en PBMCs humanos activados por PHA y CD8 + pero no las células CD4 +
. p> a fin de validar que PDE4B está regulada por la IL-2, que también examinó los cambios del nivel de proteína en la ingenua (N), PHA-activa (a), en reposo (Q) e IL-2 estimulada PBMCs humanos a las 3 h (+) en dos donantes independientes (Figura 6A). El nivel de proteína PDE4B aumentó aproximadamente 2 veces (Figura S4, análisis de densitometría), que se correlaciona con el aumento ~1.7 veces en la actividad de unión al ADN de STAT5 y aumento de 2 veces en los niveles de mRNA (Figura 5A y en la Tabla 1, respectivamente) . humana primaria CD4 + o células T CD8 + también fueron probados (Figura 6B). YT células NK-como sirvieron como control positivo y ß-actina como control de carga. Tanto PHA-activación (72 h) y a corto plazo tratamiento con IL-2 inducida por la expresión de proteínas PDE4B en PBMCs y CD8 +, pero no las células T CD4 +. Sobre la base de estos datos, es interesante especular que PDE4B podría ser la primera "línea de defensa" en PBMCs y células T CD8 + contra la señalización cAMP elevada que se produce con la estimulación de las células T [36]. Se sabe que otro tipo 4 isoforma, PDE4D se expresa también en células T CD4 + [35], lo que nos lleva a especular un posible modelo donde hay templado constante de las vías de cAMP inducida en comparación con las células CD8 +. Otra posibilidad podría ser que el retrasado hasta regulación de PDE4B en las células CD4 + es de regular a la baja cAMP en estas células en un punto distal del tiempo. Las pruebas de CD4 + frente a las células CD8 + se realizó a partir de un solo donante y creemos que ofrece nuevas oportunidades para investigar el posible papel de PDE4B en estos tipos de subconjuntos de células T.
PBMC humanas normales de tres donantes independientes (que se muestran son 2 los resultados representativos) se quedaron des-activado (N, ingenuo) o se activaron con PHA (a, Q, +) y luego hizo reposo después de 72 horas de activación de PHA por CO
2 de extracción como se describe en la sección Materiales y Métodos (Q ), luego estimuladas con IL-2 durante 3 h (+). Las células se recogieron y luego a transferencia Western con anticuerpos frente a PDE4B o ß-actina como se indica a la derecha. marcadores de peso molecular se muestran a la izquierda. En el panel inferior inmediatamente después del aislamiento PBMC CD4 + (carriles fi) o CD8 + (carriles sean) las células se seleccionaron negativamente como se describe en la sección Materiales y Métodos El uso de perlas magnéticas, y luego se activa con PHA, hechas de reposo, estimulado con IL-2 y transferencia Western para PDE4B y ß-actina como se describe anteriormente. células YT sirvieron como controles positivos para la expresión de PDE4B. (C) PDE4B se expresa en líneas de células tumorales linfoides CD4 +. Kit225, líneas de células linfoides H9, Molt3, MT2, HUT102 CD4 + y NK-YT como se lisaron y cantidades iguales de proteína de transferencia Western para PDE4B y ß-actina como se describe para la Figura 6A. se presentan los datos representativos de dos experimentos independientes.
PDE4B se expresa en las células CD4 + linfoides líneas celulares tumorales
Desde que se encontró PDE4B anormalmente expresado en grandes muestras de linfoma difuso de células B [35] se plantea la cuestión de lo que podría ser el estado de expresión PDE4B en varios CD4 + y otras líneas celulares de cáncer linfoides. Por lo tanto, un conjunto de líneas celulares de tumores linfoides CD4 + humanas y una línea de células NK-como, YT, se examinaron mediante transferencia Western que mostraron altamente expresado proteína PDE4B presente en estas células (Figura 6C). vía de señalización STAT5 es pertinente para varias de estas líneas celulares: MT2 humana y HUT102 y mostrar vía STAT5 hiperactivo [37], mientras que YT y las células Kit225 experimentan apoptosis cuando se agota STAT5 [11], [38]. Curiosamente, PDE4B se encontró sobreexpresado en la fracción de grandes muestras de linfoma difuso de células B que fueron refractarios a la quimioterapia [39]. Sería, por tanto, interesante investigar si el destino celular PDE4B se podría agotar de manera efectiva y si puede producir la muerte.
En su conjunto, es plausible postular que la sobreexpresión de PDE4B podría ser el resultado de la unión de STAT5 ADN genómico anormal que podría contribuir posteriormente al fenotipo tumorigénico de estas líneas celulares. Prueba de esta hipótesis requiere más investigación.
Conclusiones
En conclusión, la utilización de un enfoque sistemático que combina la determinación de la inducida por análisis cistrome STAT5 y la expresión génica de IL-2 en un modelo celular de leucemia humana ; y con la ontología de genes de seguimiento, así como la validación de expresión transcripción rendimiento medio en PBMCs humanos primarios que hemos identificado 19 nuevos genes diana STAT5, algunos con funciones todavía-a-ser determinada y algunas de ellas con relevancia a las células inmunes. También se validó un nuevo gen candidato objetivo, PDE4B a nivel de proteínas en PBMCs y lo encontramos expresado excesivamente en líneas tumorales linfoides CD4 +. Estos datos también sugieren que las células tumorales de origen linfoide podrían tener sitios de unión STAT5 genómicas asimétricos y por lo tanto los genes objetivo en comparación con células linfoides normales (como se sugiere por la comparación de nuestros datos con los datos ya existentes en la literatura por Liao et al [16] ); Por lo tanto, la búsqueda de objetivos específicos para erradicar ellas pueden requerir la cartografía de todo el genoma de los grandes conjuntos de muestras de tumores primarios del mismo origen. Si las células linfoides con una vía STAT5 hiperactiva podrían ser sensibles a los inhibidores de PDE4B y un mecanismo para controlar ciertos tumores será objeto de futuros estudios.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamiento
La línea celular de linfoma humano YT [40], las líneas de células T humanas CD4 + Hut-102 [41] y MT-2 [42], la línea de células derivadas del timo CD4 + T-linfocitos Molt-3 [43], CD4 + T-línea celular H9 [44] y la línea celular de leucemia humana de células CD4 + IL-2 dependiente de Kit225 [45] (amablemente proporcionado por el Dr. J. Johnston, de la Universidad de Queens, Reino Unido) se cultivaron como se describe [4], [38]. IL-2 se obtuvo de la NCI preclínicos repositorio. células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se aislaron, activadas con PHA y se mantuvo como se describe [46]. Las células T CD4 + o CD8 + se aislaron por selección negativa usando CD4 DynabeadsR Original ™ Humano Células T (Cat. no. 113.46D) o células CD8 T humana (Cat. no. 113.48D) kits, respectivamente.
inmunoprecipitación de cromatina
inmunoprecipitaciones cromatina se realizaron a partir de aproximadamente 5 x 10
7 células Kit225 como se describe [4] con anticuerpos anti-STAT5A /B (mezcla sc-1081 y SC-835 (STAT5A C-terminal y anticuerpos Stat5b, respectivamente)) o suero normal de conejo (control IgG) durante 3 horas a 4 ° C. Para confirmar que los ensayos tuvieron éxito, la amplificación por PCR del sitio de unión STAT5 conocido situado 5 'al gen IL2RA humano dentro de la positiva de regulación de la Región III [23] (adelante: 5'-ACG TCT AGA AAG AAA GTG GTC-3' Reverse : 5'-CTG TCC CTG GAT GAA CCT AGT-3 ') se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. [4] Los valores de transcripciones en muestras desconocidas se obtuvieron por interpolación (ciclos de PCR a) umbral Ct valores en una curva estándar. Las curvas estándar se prepararon a partir de cantidades conocidas de ADN purificado, amplificado por PCR. Chip qPCR ensayos de cebadores para la validación PDE4B chip se encargaron a SABiosciences, una empresa Qiagen (Cat#GPH900044 (-) 01A), proporcionando posiciones cromosómicas de los 250 pb que rodea el sitio putativo GAS (chr1:66569949-66570198, hg18). reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando 2 × SYBR Green Mastermix de BioRad y un termociclador BioRad iQ5 por triplicado. unidades arbitrarias definidos como "la unión al ADN, (Db)" se obtuvo mediante 2∧ (-averageCt) y la desviación estándar como ln SD ≈ (2) * DESVEST (averageCt) * Db.
Random amplificación de la cromatina inmunoprecipitada ADN
Para generar bibliotecas de ADN chip-ed, amplificación al azar se llevó a cabo como se describe en http://research.stowers-institute.org/gertonlab/protocols/RandomPCRamplification.pdf por el laboratorio DeRisi en la UC San Francisco. Brevemente, las muestras de ADN chip-ed fueron amplificados con una versión modificada de un protocolo de PCR aleatorio [47]. ADN se hibrida con el cebador A (5 'GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN), y la síntesis de ADN de segunda hebra se llevó a cabo con Sequenase (US Biochemical). Este material se utilizó como plantilla para 35 ciclos de PCR con el cebador B (5'-GTTTCCCAGTAGGTCTC) utilizando el siguiente perfil: 30 s a 94 ° C, 30 sa 40 ° C, 30 sa 50 ° C, 60 s a 72 ° C y una mezcla de dNTP que contiene dUTP. Los productos se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAGEN, cuantificado y correr en un gel de agarosa al 1% para comprobar el tamaño del fragmento, entonces probado para el enriquecimiento de la positiva de regulación de la Región III como se describe anteriormente.
In Silico Análisis FODA
chip-on-chip resultados fueron analizados con MAT (análisis basado en modelos de suelo de baldosas serie, [24] http://liulab.dfci.harvard.edu/MAT/) por el Liu Lab en el Departamento de Bioestadística y Biología Computacional en el Instituto de cáncer Dana-Farber, Escuela de Salud Pública de Harvard. mapeo de genes proximal de las secuencias genómicas de hasta 300 kb se realizó mediante el sistema de elementos de anotación cis-regulador (CEAS http://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/). Los resultados se visualizaron por el IGV. La conversión de coordenadas del genoma y los archivos de anotación del genoma de diferentes versiones de los conjuntos de genoma humano se ha realizado mediante la herramienta UCSC Genoma liftover en http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver.
Aislamiento de ARN y Síntesis de ADNc
el ARN total se aisló usando el kit RNeasy (QIAGEN). cDNA fue sintetizado con el Kit de Síntesis de ADNc iScript BioRad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de microarrays
Análisis de la expresión génica utilizando Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 microarrays se llevaron a cabo en el Centro de Microarray Core, Baylor Facultad de Medicina, Houston, TX. El análisis estadístico se realizó mediante GeneSpring GX en la Universidad de Debrecen. Affymetrix GeneChip humanos promotor matrices 1.0R interrogan regiones proximales de los sitios de inicio de transcripción y contienen sondas de aproximadamente el 59 por ciento de las islas CpG. Estas matrices contienen 4,6 millones de sondas de azulejos a través de más de 25.500 regiones promotoras humanos con una resolución promedio de 35 pb.