Extracto
gotita digital de PCR (ddPCR) se puede utilizar para detectar mutaciones de baja frecuencia en el pulmón oncogén impulsada cáncer. La gama de
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mutaciones puntuales observados en el CPNM requiere un enfoque múltiple que permita la detección de mutaciones en el ADN circulante eficaz. Aquí mostramos el diseño y optimización de los tres ensayos multiplex ddPCR discriminatorias que investigan nueve diferentes
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mutaciones utilizando PrimePCR ™ ddPCR ™ Mutación Los ensayos y el sistema de Bio-Rad QX100. En conjunto, estas mutaciones representan el 95% de los cambios de nucleótidos que se encuentran en
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en el cáncer humano. reacciones multiplex se optimizaron en el ADN genómico extraído de
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líneas celulares mutantes y probado en ADN extraído de tejido tumoral fijado a partir de una cohorte de pacientes con cáncer de pulmón sin el conocimiento previo de la específica
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genotipo. Los ensayos multiplex ddPCR tenían un límite de detección de 1 mutante mejor que
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molécula en 2000 de tipo salvaje
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moléculas, que se compara favorablemente con un límite de detección de 1 en 50 para el próximo secuenciación generación y 1 en 10 para la secuenciación de Sanger. Multiplex ddPCR unos ensayos de este modo proporcionar una metodología altamente eficiente para identificar
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mutaciones en adenocarcinoma de pulmón
Visto: Pender. A, García-Murillas I, Rana S, Cutts RJ, Kelly G, K Fenwick , et al. (2015) Genotipado eficiente de los
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mutante de células no pequeñas Cáncer de pulmón El uso de un enfoque de multiplexado de la gotita de PCR digital. PLoS ONE 10 (9): e0139074. doi: 10.1371 /journal.pone.0139074
Editor: Giuseppe Viglietto, UNIVERSIDAD Magna Grecia, Italia
Recibido: 12 de febrero de 2015; Aceptado: 9 de septiembre de 2015; Publicado: 28 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Pender et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:. los autores agradecen el apoyo de esta labor por el Servicio Nacional de Salud (Inglaterra), a través de fondos para el Instituto Nacional de la Salud Centro de Investigación Biomédica de Investigación la Royal Marsden hospital. También agradecen la financiación del Instituto de Investigación del Cáncer y el Cancer Research UK, Programa de Medicina estratificado. Esta investigación también fue financiada en parte por el Revere Charitable Trust, una donación educacional de Pierre Fabre-Ltd., el Consejo Europeo de Investigación Avanzada de Grant RASTARGET y el Premio Wellcome Trust Investigador Superior, 103799 /Z /14 /Z. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. La financiación proporcionada por Pierre-Fabre Ltd. no representa un interés en competencia para cualquier de los autores, y no hay otra declaración relevante en relación con el empleo, consultoría, patentes, se requiere que los productos en desarrollo o los productos comercializados. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
cáncer
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1] y más de 20 000 los casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) fueron diagnosticados en el Reino Unido en 2012 [2]. Los oncogenes mutados con mayor frecuencia en el adenocarcinoma de pulmón son los
RAS
GTPasas de la familia y
EGFR gratis (25% y 15%, respectivamente [3]). El conocimiento del perfil molecular de adenocarcinoma de pulmón avanzado es crítica para la toma de decisiones terapéuticas [4], en particular en el uso de inhibidores de tirosina quinasa de EGFR y ALK [5,6]. La presencia de un
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mutación puede también ser de relevancia terapéutica si inhibidores de MEK y taxanos combinaciones resultan eficaces en esta cohorte de pacientes [7]. La obtención de tejido tumoral adecuada para el genotipado concluyente en el cáncer de pulmón puede ser problemático, sin embargo [8]. Gotita PCR digital (ddPCR) es un método sensible de detección de la mutación cuantitativa [9,10] que tiene el potencial de determinar el genotipo de precisión de material derivado del paciente a partir de una pequeña cantidad de material de partida.
Detección de
KRAS mutaciones hotspot fotos: por ddPCR ha visto limitado por la variedad de alelos potenciales dentro de loci adyacentes, aunque algunos
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mutaciones ocurren con mayor frecuencia en el cáncer que otros (Tablas 1 y 2). Las cuatro mutaciones más comunes representan el 80% de todos los cambios KRAS nucleótidos que se encuentran en los cánceres humanos (85% de todos los cambios en NSCLC), mientras que los nueve mutaciones más comunes representan el 95% de todos los cambios y 97,5% de los cambios en NSCLC. sondas de PCR marcados con fluoróforo digitales complementan una secuencia de ADN mutante particular y por lo que sólo detectan uno específico
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mutación. El uso de estos ensayos in duplex con una sonda para detectar el alelo mutante y una sonda para detectar el alelo de tipo salvaje permiten calcular la fracción de alelo mutante para una mutación dada, pero este enfoque requiere potencialmente múltiples ensayos y el uso de más material antes de la identificación correcta de el genotipo. por lo tanto desarrollo de un ensayo multiplex combinando varias sondas mutantes diferentes en la misma reacción es una alternativa atractiva. Multiplex
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ensayos de PCR digitales se han descrito utilizando el sistema de gota de agua ™ PCR digital (RainDance Technologies, Billerica, Massachusetts, EE.UU.) en el cáncer colorrectal avanzado [11], pero no hasta el momento con el sistema Bio-Rad QX100, un sistema asequible digital de PCR con sondas disponibles en el mercado desde hace varios
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mutaciones, ni tiene una herramienta múltiplex ha utilizado en el cáncer de pulmón.
Nos propusimos diseñar múltiplex los ensayos de PCR digitales que identificar con precisión nueve
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mutaciones diferentes y para demostrar la aplicación de estos ensayos al material derivado del paciente usando el sistema Bio-Rad QX100.
materiales y Métodos
ensayos de sondas de PCR digital
Cada sonda de PCR digital es un oligonucleótido específico para la región de interés con un 5 'y un fluoróforo 3' extintor. El fluoróforo es HEX para sondas específicas para secuencias de tipo salvaje o mutantes FAM para las sondas.
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c.35G & gt; T (G12V;. Cat no dHsaCP2500592), c.35G & gt; A (G12D;. Cat no dHsaCP2500596), c.35G & gt; C (G12A;. Cat no dHsaCP2500586), c .34G & gt; A (G12S;. cat no dHsaCP2500588), c.34G & gt; C (G12R;. cat no dHsaCP2500590), c.34G & gt; T (G12C; dHsaCP2500584), c.37G & gt; T (G13C;. cat no dHsaCP2500595 ), c.38G & gt; a (G13D;. cat no dHsaCP2500598), c.183A & gt; C (Q61H;. cat no dHsaCP2000133), WT para c.35G & gt; T (WT para G12V;. cat no dHsaCP2500593), WT para c.35G & gt; a (WT para G12D;. cat no dHsaCP2000002), WT para c.35G & gt; C (WT para G12A;. cat no dHsaCP2000004), WT para c.34G & gt; a (WT para G12S;. cat no dHsaCP2000012 ), WT para c.34G & gt; C (WT para G12R;. cat no dHsaCP2000010), WT para c.34G & gt; T (WT para G12C;. cat no dHsaCP2000008), WT para c.37G & gt; T (WT para G13C; cat no dHsaCP2500595), WT para c.38G & gt;. a (WT para G13D;. cat no dHsaCP2000014) y WT para c.183A & gt; C (WT para Q61H;. cat no dHsaCP2000132) 20x PrimePCR ™ ddPCR ™ mutación ensayos (que contiene ambos cebadores y sondas ddPCR) se adquirieron de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EE.UU.) y se utilizaron en este estudio.
optimización del ensayo y la cuantificación de ADN
ensayos de PCR digital fueron optimizados utilizando ADN genómico de la línea celular (ADNg) o los oligonucleótidos sintéticos según el caso. Las líneas celulares utilizadas para este estudio fueron autenticadas uso de perfiles de STR por la oficina de servicios celulares en el Reino Unido de Investigación del Instituto de Investigación del Cáncer de Londres y el Instituto de Investigación del Cáncer. Estos incluyen NCI-H727 (
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G12V, pulmón), NCI-H358 (
KRAS
G12C, pulmón), A549 (
KRAS
G12S, pulmón), SK LU-1 (
KRAS
G12D, pulmón), A427 (
KRAS
G12D, pulmón), HCT-116 (
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G13D, colon) y NCI-H1975 (
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WT, pulmón). Se proporcionaron todas las líneas celulares directamente por el Cancer Research UK Teléfonos Servicios con la excepción de HCT-116 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU., nº de catálogo ATCC
®CCL-247
TM.). Cell gDNA se extrajo utilizando el Kit de Sangre y Tejidos DNeasy ™ (Qiagen, Venlo, Limburg, Países Bajos) según las instrucciones del fabricante. Todos los ADN utilizado en reacciones de PCR posteriores digitales, excepto los oligonucleótidos sintéticos, se cuantificó en un sistema QX100 ddPCR utilizando TaqMan® Copia Ensayo humano RNasa P número de referencia (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California, EE.UU.). 1 l de eluato se añadió a una reacción de PCR digital que contiene 10 l ddPCR Supermix para sondas (Bio-Rad) y 1 l de TaqMan Copia Ensayo número de referencia, humano, RNasa P (Life Technologies) en un volumen total de 20 mL. La reacción se repartió en ~ 14.000 gotas por muestra en un generador de gotitas QX-100 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. reacciones emulsionada de PCR se llevaron a cabo en una placa de 96 pocillos (Eppendorf, Stevenage, Reino Unido) en un G-Tormenta GS4 termociclador (G-Storm, Somerton, Somerset, Reino Unido) incubar las placas a 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg y 60 ° C durante 60 seg, seguido por 10 min de incubación a 98 ° C. El incremento de rampa de temperatura era de 2,5 ° C /s para todos los pasos. Las placas se leyeron en un lector de gotita Bio-Rad QX-100 usando software v1.4.0.99 QuantaSoft (Bio-Rad). Al menos uno pocillos de control negativo sin ADN se incluyeron en cada ejecución. La cantidad de la RNasa P amplificable ADN se cuantificó a partir de la concentración proporcionada por el software. Después de la cuantificación, la línea celular de ADN fue digerido mediante enzimas de restricción ™ 3-HF Hind (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EE.UU.) a 37 ° C durante 1 hora.
gotita digital de PCR para la detección de mutaciones de KRAS
mezclas de reacción de PCR se prepararon en un volumen total de 20 l que contenía: 10 l 2x Supermix para sondas sin dUTP (Bio-Rad), ensayos de sondas de cebador pertinentes, DNA (volumen variable) y agua libre de nucleasa (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California, EE.UU.). Se utilizaron pocillos múltiples, si es necesario para analizar el eluato ADN necesario. Al menos 500 pg equivalente de eluido de ADN se analizó en cada ensayo multiplex para cada paciente. 20 l de mezcla de reacción PCR se transfirió a un pocillo de muestra en una casete de generador de gotas desechable (Bio-Rad). 70 l de aceite de gotita generación (Bio-Rad) y luego se cargó en el pozo de petróleo para cada canal y el casete cargado en un droplet Generador QX100 (Bio-Rad). Las gotitas se transfirieron entonces a una placa de PCR de 96 pocillos. reacciones emulsionado PCR se realizaron en un G-tormenta GS4 termociclador incubando las placas a 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 30 seg y 54 ° C durante 60 seg, seguido por 10 min de incubación a 98 ° DO. El incremento de rampa de temperatura era de 2,5 ° C /s para todos los pasos. Las placas se leyeron en un lector de gotita Bio-Rad QX-100 usando software v1.4.0.99 QuantaSoft de Bio-Rad. Por lo menos un pocillo de control negativo sin ADN se incluyeron en cada ejecución. Cada pocillo se leyó usando el lector de la gotita QX100 (Bio-Rad) y se analizaron las gotitas de emisión en el hexágono o FAM longitudes de onda. Diagramas de dos dimensiones de amplitud que muestran la amplitud HEX y FAM medido para cada gotita muestran cuatro principales poblaciones de gotas; gotitas que contienen no ADN amplificado, gotitas con sólo el ADN mutante y amplitud alta FAM, gotitas con sólo el ADN de tipo salvaje y amplitud alta HEX y gotas con tanto de tipo salvaje y mutante de ADN amplificado y alta FAM y HEX amplitud. Si varias copias de tipo salvaje y mutante de ADN están contenidas en la misma gotita, gotitas será leído con mayor FAM HEX y amplitud. Estas gotitas han sido excluidos de los análisis a lo largo de este estudio.
PCR Análisis digital
Para evaluar la fracción alelo mutante, la concentración de ADN mutante (copias de ADN mutante por gotitas) se estimó a partir la distribución de Poisson. Número de copias mutantes por gotita Mmu = ln (1- (NMU /n)), donde nmu = número de gotitas positivos para la sonda FAM mutante y n = número total de gotitas. La concentración de ADN en la reacción se estimó como sigue: MDNAconc = ln (1- (nDNAcon /n)), donde nDNAconc = número de gotitas positivos para la sonda mutante FAM y /o sonda HEX de tipo salvaje y n = número total de gotitas. La fracción de alelo mutante = Mmu /MDNAconc. La frecuencia del alelo mutante medido describe la fracción alelo mutante expresado como un porcentaje.
Acceso de ADN de tejidos FFPE y extracción
formol e parafina embebido fijo muestras (FFPE) de tumores de NSCLC en los pacientes excedentes a la atención clínica eran recopilada con el consentimiento escrito del paciente en el Royal Marsden NHS Foundation Trust. Se extrajo el tejido FFPE de ADN (después de macrodissection si es necesario para asegurar & gt; 10% de contenido de tumor) usando el kit de ADN de tejidos FFPE Qiagen (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ADN eluido se almacenó a -20 ° C.
Declaración de Ética
Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito para este estudio (la aprobación ética 13 /LO /1389, Comité NRES Londres-Central), que incorporado ADN somático excedente del Programa de Medicina estratificado Cancer Research UK (aprobación ética 11 /EE /0202, NRES Comité este de Inglaterra).
Sanger de secuenciación
la región de interés se amplificó utilizando 10 mu M hacia adelante (5'-TATTATAAGGCCTGCTGAAAATG-3 ') e inverso (3-5'-TTGGATCATATTCGTCCACAA') primers, 10 l AmpliTaq Gold ® PCR Master Mix (Life Technologies) y 3 ng de ADN FFPE derivados de plantilla o 5 ng gDNA. condiciones de PCR fueron según las recomendaciones del fabricante. Producto de PCR purificado a continuación, se sometió a un paso más allá PCR utilizando didesoxinucleótidos de terminación de cadena (BigDye® 1.0, Life Technologies) y la posterior secuencia de ADN se leyó en un secuenciador automático.
Ion Torrent protones secuenciación
Secuenciación bibliotecas se prepararon con el ion AmpliSeq ™ el cáncer hotspot Panel v2 (Life Technologies) utilizando el protocolo Ion AmpliSeq Biblioteca Preparación con 3-5ng de ADN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de códigos de barras, las bibliotecas se cuantificaron utilizando qPCR y se diluyeron a 100 pM. Bibliotecas fueron basados en plantillas con el sistema de Ion OneTouch2 (Life Technologies) y se secuenciaron en un chip de PI utilizando el Kit de Ion PI OT2 200 (Life Technologies), 520 flujos y una longitud promedio amplicón de 112 bases a una profundidad media de x2721307. La secuenciación dio lugar a 45272 a 11.767.856 lecturas por muestra.
Ion Torrent persona que llama variante v4.0-r73742 con ninguna región hotspot y configuración "Germen de línea de baja rigurosidad" se utiliza para llamar variantes. Leer los recuentos de todas las posiciones se calcularon utilizando cacharro (SAMtools v1.1 [12]) y se analizaron estos datos para posibles variantes que utilizan Perl y scripts de encargo R. Las variantes de & gt; 3% reportó por ambos métodos de análisis y no se informó en el año 1000 la base de datos del proyecto Genomas (www.1000genomes.org) fueron identificados como posibles mutaciones somáticas. Los datos se hace referencia cruzada en contra de la base de datos v70 cósmico (cancer.sanger.ac.uk) para identificar posibles mutaciones de punto de acceso.
El análisis estadístico
La regresión lineal se realizó mediante la fórmula r
2 = 1- (SS
reg /SS
tot), donde SS
reg refiere a la suma de los cuadrados de las distancias que mejor se adapta línea de regresión lineal y SS
tot se refiere a la suma de los cuadrados de las distancias verticales de la hipótesis nula (y = media de todos los valores de y) utilizando GraphPad Prism versión 6.0a (GraphPad Software, la Jolla, California, EE.UU.).
KRAS la especificidad del ensayo multiplex
92 pozos de
KRAS de tipo salvaje
ADNg se analizaron con cada múltiplex. El límite de detección fue de 0,05% para reflejar los resultados medidos con púas
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especies gDNA mutantes (Fig S8). gotitas individuales se agruparon en función de su amplitud HEX en dos grupos utilizando el algoritmo de KMeans. se estimó un umbral para los mutantes basado en 1,5 veces la mediana de los valores de FAM de esas gotas que pertenecen a la agrupación con categorías de mayor HEX. Falsos positivos 'gotas' mutantes se clasificaron en forma de gotitas que estaban en el grupo de menor HEX, pero cuyo valor supera el umbral FAM para reflejar las amplitudes FAM HEX y medidos para cualquiera de las especies mutantes KRAS probados en dicho ensayo multiplex. Un resultado falso positivo se definió como tres gotas de falsos positivos 'mutantes' de acuerdo con la mutación de Detección de Buenas Prácticas Directrices raras [13]. Para evaluar la especificidad, se calculó la probabilidad binomial de lograr menos de tres gotas de 'mutantes' por 6000 gotitas de tipo salvaje para cada ensayo multiplex.
Resultados
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duplex mutación ddPCR
Hemos probado todos los
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ensayos ddPCR por separado a través de un gradiente de temperatura de hibridación para optimizar las condiciones de ciclos térmicos. Cada ensayo se probó con el ADNg u oligonucleótido apropiado solo y luego en dúplex con el tipo salvaje y
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ADN mutante y las dos sondas FAM HEX y relevantes presentes. La disminución de aumento de la temperatura de recocido amplitud FAM de la sonda mutante a una meseta a 54 ° C para
KRAS
G12V, D, A, S, R y C y G13C y 13D sondas (Figura 1). El
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sonda Q61H tuvieron un aumento mínimo en más de amplitud FAM a 53,4 ° C en comparación con 54 ° C. Todas las sondas ensayados mostraron una buena separación de los cuatro grupos diferentes de gotas a 54 ° C, lo que permite una clara identificación y cuantificación de las diferentes poblaciones de ADN.
poblaciones de las gotitas respiratorias observadas para cada ensayo duplex probado con los de tipo salvaje y mutante línea celular relevante gDNA u oligonucleótido a la temperatura óptima de recocido por ejemplo, G12V panel superior izquierdo muestra las poblaciones de gotas visto con el tiempo de ensayo G12V, ensayo G12V, NCI-H727 ADNg y NCI-H1975 ADNg presente. amplitud HEX es de hasta 6000 en el eje x y la amplitud FAM hasta 11.000 en el eje y de cada panel. Clave:. Negro drops- gotas vacías, la fiebre catarral gotitas positivos FAM ADN mutante, de tipo salvaje HEX ADN positivos gotitas de efecto invernadero, de tipo salvaje-marrón y las gotas de ADN mutante doble positivas
KRAS
múltiplex ddPCR diseño del ensayo
Hemos diseñado una herramienta basada en PCR multiplex digital para la detección de los más comunes
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mutaciones en adenocarcinoma de pulmón; G12C, G12D y G12V (http://www.sanger.co.uk/cosmic). ensayos de sondas de tipo silvestre para cada mutación se ensayaron en combinación con diferentes concentraciones de ensayos de sondas de mutantes, dando lugar a poblaciones de gotitas mutantes de amplitud variable FAM (Fig 2). Se encontró que la amplitud HEX de todos los ensayos de sondas de tipo silvestre que es muy similar y por lo que el WT para G12C, WT para G12V y WT se seleccionaron para ensayos de G12D como referencia para todos los
KRAS
G12 y G13 ensayos mutantes posteriores . De las diferentes combinaciones de ensayos de mutantes ensayados, el ensayo multiplex que dio mejor separación de las poblaciones de gotitas utiliza 900 nM primers y 500 de la sonda G12C nM, 562,5 cebadores nm y 312,5 sonda G12D nM y 225 nM primers y 125 de la sonda G12V nM (Fig 2 , el panel superior izquierdo).
KRAS
G12C poblaciones de gotas mutantes se indica mediante un cuadrado de trazos roja,
KRAS
G12D poblaciones mutantes por un cuadrado y azules discontinuas
KRAS
G12V poblaciones mutantes por una amarilla estrellados cuadrado. Cada ensayo múltiple, que combina todos los ensayos FAM HEX y pertinentes,
KRAS WT
ADNg y G12V, D y C mutante ADNg, se muestra en el panel superior. El ensayo dúplex correspondiente para cada mutación, usando la misma concentración FAM HEX y el ensayo con
KRAS
ADN WT y la adecuada
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ADN mutante está presente, se muestra en los paneles situados debajo de cada ensayo multiplex. Multiplex 1 (panel superior izquierdo) es una combinación de ensayo de 900 nM primers y 500 de la sonda G12C nm, 562,5 cebadores nm y 312,5 sonda G12D nM y 225 nM primers y 125 de la sonda G12V nm con 450 nM primers y 250 nM WT para la sonda G12C. Multiplex 2 utiliza la misma concentración de G12V y WT para el ensayo G12C como Multiplex 1, pero también contiene 450 nM primers y 250 nM de la sonda G12C y 675 nM primers y 375 de la sonda G12D nM. Multiplex 3 usa la misma concentración de
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ensayos de mutantes como en Multiplex 2 pero con el WT para G12V ensayo de sonda presente, que se utilizan en la misma concentración que el WT para el ensayo G12C en Multiplex 1. Multiplex 4 es un ensayo combinación del ensayo G12C como en Multiplex 2 con 225 nM primers y 125 nM de la sonda G12D y 675 nM primers y 375 nM de la sonda G12V con el WT para el ensayo G12D en la misma concentración que el WT para el ensayo G12C en Multiplex 1. clave: negro - Las gotas vacías, gotitas positivos mutante FAM ADN Blue-, de tipo salvaje HEX ADN positivos gotitas de efecto invernadero, de tipo salvaje-marrón y las gotas de ADN mutante doble positivas. La misma escala se utiliza para todos los paneles (amplitud HEX hasta 7000 y la amplitud FAM hasta 22000).
La capacidad de prueba para varios
KRAS mutaciones
ayudaría a detectar sub poblaciones -clonal por la aplicación del enfoque múltiple que permita muestras clínicas en el que el material de partida es escasa. Para modelar esto, se empleó la línea celular derivada ADNg de las tres mutaciones y probamos con cada sonda en dúplex para asegurar la especificidad (Fig S1). En presencia de la sonda mutante G12D y
KRAS
G12D, el ADN mutante V y C, una segunda población mutante de gotitas se identificó a menor amplitud FAM a la población de ADN mutante G12D (rojo recuadro rayado, a la izquierda del panel superior ). Esta población no se observó cuando cada especie de ADN mutante se ensayó en dúplex con la sonda G12D (segundo panel de la izquierda). Una segunda población mutante similar se observó con la sonda mutante G12V y las tres especies de DNA mutantes en comparación con cada ADN mutante en duplex (paneles inferiores izquierda). Esta segunda población, especialmente en lo que se ve con la sonda mutante G12D, puede caer en la amplitud FAM se espera de un
KRAS
mutación diferente en el ensayo múltiple y conducir a la detección de mutaciones de falsos positivos. Para estudiar más a esto, el tejido FFPE ADN de un individuo conocido por tener un
KRAS mutación
12/13 (F124), según lo verificado por cobas® prueba (cobas®
KRAS Mutation Test
, Roche molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, EE.UU.) fueron analizados (figura S1, paneles de la derecha). El ensayo multiplex identificó una población de gotitas mutante con amplitud FAM que se interpretó como una G12D o mutación G12V. Cuando la muestra se ensayó con cada ensayo duplex individualmente, no se observó población mutante, ya sea en G12V o G12C, mientras que una población con una amplitud FAM menor de lo esperado con el G12D se observó ensayo mutante. En la posterior secuenciación y posterior desarrollo del análisis de PCR digital del ADN del tejido, esta muestra fue identificado más tarde como
KRAS
mutante G12A (Tabla 3).
La reactividad cruzada de
KRAS
ensayos de sondas en combinación
Debido a la estrecha similitud entre las secuencias de ADN de los diferentes
KRAS
mutaciones, se observó reactividad cruzada significativa entre las sondas diseñadas para detectar mutaciones en el misma región. Esto fue particularmente evidente con sondas diseñadas para las sustituciones en el mismo nucleótido es decir,
KRAS
G12V, D y A y
KRAS
G12S, R y C. La reactividad cruzada del ensayo con la sonda ' no coincidente 'de ADN que lleva a resultados diferentes
KRAS mutación
(S2 y S3 figuras) en una población de gotas para distintas amplitudes FAM y VIC relativamente cerca de la población de gotas vacía y otra población cercana a la verdadera población de gotitas de tipo salvaje . La posición de estas poblaciones de gotas adicionales dicta el diseño de ensayos multiplex para reducir la posible mala interpretación de
KRAS
genotipos. Por lo tanto, tres ensayos multiplex se desarrollaron para cada combinan una sonda para una mutación en la posición del nucleótido 35, una sonda para una mutación en la posición 34 y una sonda para una mutación en cualquiera de las posiciones 37, 38 o 183.
KRAS
múltiplex ddPCR optimización ensayo
un múltiplex es una combinación de ensayos FAM para
KRAS
G13C, G12C y G12V. Varias combinaciones diferentes de concentraciones de sonda mutantes se ensayaron y el uso de una sonda de tipo salvaje para G12C y G13C a diferentes concentraciones (S4 FIG). Hubo coincidencia significativa entre la amplitud HEX de las poblaciones de gotitas de tipo salvaje y debido a la proximidad de las bases de nucleótidos correspondientes y la duración estimada de la sonda, se consideró que 450 nM primers y 250 nM G12C, V o D silvestre tipo de sonda era adecuado para la cuantificación de las poblaciones tanto G12 y G13 de tipo salvaje. El ensayo multiplex óptima (Fig S4, panel superior izquierdo) comprendía 900 nM primers y 500 nm G13C sonda mutante, 450 nM primers y la sonda 250 G12C nM y 225 nM primers y 125 nM sonda G12V. Multiplex B es una combinación de ensayos FAM para
KRAS
G12S, G12D y G13D. De todas las concentraciones ensayadas, la combinación óptima de los ensayos con sondas mutantes era 675 nM primers y la sonda 375 G12S nM, 450 nM primers y la sonda 250 G12D nM y 225 nM primers y 125 nM sonda G13D (S5 figura, panel superior izquierdo). Multiplex C analiza
KRAS mutaciones en
G12R, G12A y Q61H. Se requiere una sonda de tipo salvaje, tanto para la posición G12 /13 y la posición Q61 para la cuantificación precisa de la frecuencia del alelo mutante. El ensayo se optimizó con 450 nM primers y 250 nM de la sonda G12C y 900 nM primers y 500 nM de la sonda Q61H como los ensayos de tipo salvaje. La mejor separación de las poblaciones de gotitas mutantes se logró utilizando cebadores 675 nM y 375 nM de la sonda G12R, 450 nM primers y 250 nM de la sonda G12A y 900 nM primers y 500 nM Q61H sonda mutante (Fig S6, panel superior izquierdo).
Todos los ensayos multiplex optimizados (figura 3) se ensayaron para determinar la reactividad cruzada con diversas especies de
KRAS
ADN mutante (figura S7). No existe solapamiento entre las poblaciones de gota deseados y las poblaciones de la otra
KRAS
especies de ADN mutantes en los tres multicines. Además, la posición de las poblaciones de gotitas debido a la reactividad cruzada es altamente reproducible y se puede utilizar para empezar a identificar que
KRAS
genotipo está presente en un ensayo multiplex que contiene otras sondas mutantes.
multiplex A (panel superior izquierdo) es una combinación de ensayo de 900 nM primers y 500 de la sonda G13C nm (discontinua roja cuadrada), 450 nM primers y 250 de la sonda G12C nm (azules discontinuas cuadrado) y 225 nM primers y 125 de la sonda G12V nM (amarillo cuadrado de trazos). Multiplex B (panel superior medio) es una combinación de ensayo de 675 nM primers y 375 de la sonda G12S nm (discontinua roja cuadrada), 450 nM primers y 250 de la sonda G12D nm (azules discontinuas cuadrado) y 225 nM primers y 125 de la sonda G13D nM (amarillo cuadrado de trazos). Multiplex C (panel superior derecho) es una combinación de ensayo de 675 nM primers y 375 de la sonda G12R nm (discontinua roja cuadrada), 450 nM primers y 250 de la sonda G12A nm (azules discontinuas cuadrado) y 900 nM primers y 500 de la sonda Q61H nM (amarillo cuadrado de trazos). Multiplex C dispone de 900 nM primers y 500 nM Q61H sonda de tipo salvaje, además de un ensayo de tipo salvaje G12C. Todas las demás poblaciones de gotitas de tipo salvaje que se muestran, excepto en el ensayo Q61H dúplex, son 450 nM primers y sondas de tipo silvestre de 250 nM G12C. Todos los paneles en las columnas izquierda y central muestran una amplitud FAM hasta 18000 y una amplitud HEX hasta 6000. Los paneles en la columna de la derecha tiene una amplitud FAM hasta 18000 y una amplitud HEX hasta 11000.
KRAS
múltiplex ddPCR ensayo de caracterización
cantidades decrecientes de NCI-H358 (
KRAS
G12C) y A549 (
KRAS
G12S) ADNg se enriquecieron en
KRAS de tipo salvaje
ADNg (NCI-H1975) y se ensayaron en el apropiado
KRAS
ensayo multiplex. El límite de detección para
KRAS
ADN mutante G12C en multiplex A fue 0,03% y
KRAS
ADN G12S en multiplex B fue 0,045% (Fig S8, paneles superiores) La frecuencia del alelo mutante medido correlaciona bien con cantidades decrecientes de pinchos
KRAS
ADNg mutante en multicines a y B (r2 = 0,9992 y 0,0998, respectivamente), lo que demuestra la linealidad de la detección de mutaciones en los ensayos multiplex. frecuencia de los alelos mutantes mostraron poca variabilidad intra-bien para ninguno de los ensayos multiplex y alta reproducibilidad entre dos operadores diferentes en tres días alternos para un rango de frecuencias de los alelos (S8 figura, medio y paneles inferiores).
similares
se observó KRAS
frecuencia de los alelos usando ensayos multiplex o dúplex, tanto en la línea celular de ADN (una sola especie
KRAS
ADNg mutante y combinaciones de
KRAS
ADNg mutante en diferentes frecuencias de los alelos) u oligonucleótidos y ADN de tejidos FFPE (figura 4; R2 = 0,9302 y 0,9542, respectivamente) guía empresas
Se analizaron varios pozos de NCI-H1975
KRAS de tipo salvaje
ADNg con cada uno de los tres
KRAS
ensayos multiplex y calculan la probabilidad de detección de mutaciones de falsos positivos, estableciendo el límite de detección de 0,05% para reflejar los resultados medidos con púas
KRAS
especies gDNA mutantes (Fig S8). La especificidad de cada múltiplex es 99,99995%, 99.99857 99.85578% y% de multicines A, B y C, respectivamente (Tabla S1).
Comparación de los
KRAS
multiplex de detección mutante de ensayo con la secuenciación de Sanger
Una serie de muestras que contienen cantidades decrecientes de NCI-H358 (
KRAS
G12C) o A549 (
KRAS
G12S) ADNg de pinchos en
KRAS de tipo salvaje
tipo de ADN (NCI-H1975) fueron simultáneamente analizó mediante secuenciación de PCR y Sanger digital.
KRAS
mutante G12C ADN se detectó utilizando el multiplex Un abajo a una frecuencia del alelo mutante del 0,2%, mientras que el pico en el cromatograma mutante sólo es visible a una frecuencia del alelo mutante del 31,5% y no inferior al 10% (S9 Fig, paneles superiores).
KRAS
ADN mutante G12S sigue siendo detectable por PCR multiplex digital utilizando B a una frecuencia del alelo mutante del 0,1%, pero sólo es visible mediante secuenciación de Sanger en un 17%. (S9 figura, paneles inferiores).
Detección de
KRAS
mutaciones en el ADN de tejidos FFPE
ADN de tejidos FFPE analizaron 11 casos de avanzada
KRAS
mutante NSCLC (S2 Tabla) se analizó usando cada ensayo multiplex. La presencia de un
KRAS
12/13 mutación se conoce a partir de las pruebas antes cobas® (cobas®
KRAS Mutation Test
, Roche), pero los investigadores estaban cegados a la específica
KRAS
genotipo. Al menos un
se detectó la mutación KRAS
en cada caso y dos casos tenían dos detectable
KRAS
clones (Figura 5). Las mutaciones se confirmaron con el ensayo duplex apropiado. La mutación G12D baja frecuencia en el caso S011 puede representar FFPE artefacto debido a la desaminación frecuente de nucleótidos de guanina durante el proceso de conservación del tejido [14]. La mutación G12F en S018 se identificó mediante secuenciación posterior de la muestra de tejido después de la observación de la población de gotas de reactividad cruzada en todos los ensayos múltiplex. Además, dos especies de KRAS mutado ADNg se enriquecieron en un fondo de
KRAS
ADN de tipo salvaje (NCI-H1975) ADNg para crear tres muestras que contienen un clon de mayor y menor KRAS; C1 es una combinación de NCI-H358 (
KRAS
G12C) y A549 (
KRAS
G12S) ADNg, C2 es una combinación de NCI-H358 (
KRAS
G12C) y A427 (
KRAS
G12D) ADNg y C3 es una combinación de A427 (
KRAS
G12D) y A549 (
KRAS
G12S) gDNA. Todas las especies KRAS fueron detectables usando los ensayos multiplex KRAS, incluidos los clones de menor importancia a una frecuencia del alelo mutante de 0,3% medido para el
KRAS
ADN mutante G12D en la muestra C3 (Fig 6).