Extracto
Las líneas celulares LNCaP y C4-2B forman un excelente modelo preclínico para estudiar el desarrollo del cáncer de próstata metastásico resistente a la castración, ya que las células C4-2B se derivaron de una metástasis ósea que creció en nude los ratones después de la inoculación con las células, C4-2 resistentes a la castración LNCaP derivados. secuenciación del exoma detectó 2188 y 3840 mutaciones en las células LNCaP y C4-2B, respectivamente, de los cuales 1.784 fueron encontradas en ambas líneas celulares. Sorprendentemente, las células LNCaP parentales tienen más de 400 mutaciones que no fueron encontrados en el genoma C4-2B. Más de la mitad de las mutaciones encontradas en los exomas se confirmaron mediante el análisis de los datos de RNA-seq, y se observó que los genes expresados son más propensas a las mutaciones que los genes no expresado. La transcriptomes también reveló que 457 genes muestran un aumento de la expresión de genes y 246 muestran una disminución de expresión en C4-2B comparación con las células LNCaP. Mediante la combinación de la lista de mutaciones-C4-2B específica con la lista de genes expresados diferencialmente, se han detectado cambios importantes en la adhesión y el ECM-receptores de las vías de interacción focales. La integración de estas vías converge en el gen de la cadena ligera de la miosina quinasa (MLCK) que podrían contribuir a la potencial metastásico de células C4-2B. En conclusión, ofrecemos amplias bases de datos de genes mutados y los genes expresados diferencialmente en las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y C4-2B. Estos pueden ser útiles para otros investigadores que utilizan estos modelos celulares
Visto:. Spans L, C Helsen, Clinckemalie L, Van den Broeck T, S Prekovic, Joniau S, et al. (2014) genómica comparativa y análisis Transcriptomic de LNCaP y cáncer de próstata C4-2B líneas celulares. PLoS ONE 9 (2): e90002. doi: 10.1371 /journal.pone.0090002
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de diciembre de 2013; Aceptado: 24 Enero 2014; Publicado: 28 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Tramos et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue posible gracias a becas de investigación de la FWO-Vlaanderen (G.0684.12N), por parte del gobierno federal belga (plan Nacional del cáncer KPC_29_023) y de la Universidad Católica de Lovaina (OT /11/081). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la tercera causa principal de muerte entre los hombres en Europa [1]. A pesar de su prevalencia, la mayoría de los hombres es diagnosticado con CaP localizado de bajo riesgo y nunca morir a causa de su cáncer cuando se deja sin tratamiento [2]. Sin embargo, los pacientes con alto riesgo y las enfermedades especialmente metastásico tienen un riesgo mucho mayor de morir de CaP con reportado tasas de mortalidad CaP específicos hasta el 28,8% para la enfermedad de alto riesgo y 66,1% para la enfermedad metastásica en el momento de 10-años de seguimiento [ ,,,0],3]. datos epidemiológicos recientes han demostrado que casi el 10% de todos los pacientes con CaP son metastásica en el momento del diagnóstico, lo que subraya la importancia clínica de desarrollar una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de CaP metastásico [4]. Los cambios genómicos y transcriptomic que acompañan a la transformación de la enfermedad localizada a CaP metastásico resistente a la castración se descubren, pero están obstruidos por las dificultades para obtener biopsias de las diferentes etapas de la enfermedad [5], [6].
como alternativa, las líneas celulares se puede usar como modelos para estudiar la transición a CaP metastásico resistente a la castración [7]. Una de las líneas de células de CaP mejor estudiados, sin duda, es la línea celular LNCaP. Esta línea celular se deriva de una biopsia con aguja tomado del ganglio linfático supraclavicular izquierda de un hombre de 50 años de edad, varón de raza blanca [8]. Este paciente sufría de un PCA que progresa rápidamente con una respuesta mínima y breve a la terapia hormonal y ninguna respuesta a la quimioterapia. Posteriormente, la sublínea C4-2 se derivó de un tumor que se desarrolló en ratones desnudos castrados inyectados con células LNCaP. Finalmente, la línea celular C4-2B se deriva de una metástasis ósea después de un trasplante ortotópico de células C4-2 en ratones desnudos [9], [10]. En otras palabras, C4-2B es un derivado metastásico de las células LNCaP. por lo tanto, el modelo de progresión LNCaP y C4-2B imita el avance de la enfermedad del mal tumorigénico, andrógeno-sensibles y no metastásico en LNCaP, para metastásico y andrógeno-insensible (o resistente a la castración) en C4-2B.
Para estas dos líneas celulares, los cambios en los números de cariotipo y de copia genómico, algunas mutaciones puntuales, inserciones y deleciones se han descrito, pero la comparación de las secuencias de exoma no se han reportado aún [9], [11]. El primer objetivo de este estudio fue, por tanto, para obtener datos completos exoma de las células LNCaP y C4-2B. Por supuesto, una comparación de estos paisajes mutacionales sólo tiene sentido en la presencia de información sobre la actividad de los genes afectados. Este último se obtuvo a partir del transcriptoma analiza.
Un primer paso para catalogar las mutaciones puntuales, inserciones y deleciones en las células LNCaP se informó en distancias> em> et al.
[12]. Aquí, se presenta en su conjunto y exoma secuenciación del transcriptoma estudio comparativo de ambas líneas celulares LNCaP y C4-2B. Para nuestro conocimiento, este es el primero comparación directa y completa de este tipo. Por otra parte, estas bases de datos pueden ser muy informativo para los estudios preclínicos para los que se están utilizando tanto las células LNCaP y C4-2B. También se pueden utilizar para generar hipótesis en el proceso metastásico, como se ejemplifica por la vía MLCK.
Materiales y Métodos
aislamiento de ADN
La línea celular LNCaP se obtuvo de la American Type Culture Collection, mientras que las células C4-2B eran una especie de regalo del doctor M. Stallcup (Norris Comprehensive Cancer Center de la Universidad del Sur de California, EE.UU.) [9]. Ambas líneas celulares se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI, Gibco, Invitrogen), que contiene 2 g /L de glucosa suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (FCS). El número de pases de las células LNCaP y C4-2B era 48 y 42 respectivamente. El ADN de alto peso molecular fue extraído de células cultivadas utilizando el kit GenElute mamíferos Genomic DNA Miniprep (Sigma-Aldrich). Después de la purificación mediante precipitación con etanol con acetato de amonio, la concentración se cuantificó utilizando un NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific) y Bioanalyzer (Agilent).
exoma secuenciación
Captura Total-exoma de las células LNCaP se realizó utilizando el Sistema SureSelect Human All Exon (Agilent) según las instrucciones del fabricante. -Extremo emparejado, 100 pb de longitud secuenciación lee se generaron utilizando el secuenciador GAIIx (iluminación). La captura del exoma de las células C4-2B se realizó utilizando la versión 2 kit EZ SeqCap Exoma (Roche Nimblegen) y de extremo emparejado 100 pb de longitud lecturas fueron generados usando el HiSeq2000 (iluminación). Se realizó
Control de calidad utilizando software FastQC (versión 0.10.1) (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) y Picard (versión 1.22) (http://picard.sourceforge.net/). Lecturas de secuenciación se alinea con la referencia del genoma humano (hg19, NCBI Build 37) usando BWA, donde dice estaban recorta cuando la calidad era inferior a 15 (versión 0.5.9) [13]. archivos de alineación se procesaron con el análisis del genoma Toolkit (GATK) antes de la variante llamada y se incluyen eliminación de duplicados, realineación indeles locales alrededor conocidos y recalibración de la calidad de base (versión 1.0.5777) [14]. Las muestras se cargaron individualmente al software GATK UnifiedGenotyper. Las mutaciones puntuales y los datos de expresión se representaron gráficamente usando el software Circos (versión 0.52) [15]. La comparación de las mutaciones puntuales se realizó utilizando (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html).
aislamiento de ARN
células
LNCaP y C4-2B Venny , con los números de paso de 30 y 43 respectivamente, se sembraron en placas de 6 pocillos (1,75 millones de células /pocillo) y se trató durante la noche (18 h) con 1 nM R1881 (Perkin Elmer). Las células se recogieron y se lavaron con PBS. El sedimento de células se utilizó para extraer el ARN total usando el kit RNeasy Mini de Qiagen. La calidad y pureza del ARN fue inspeccionado en un Nanodrop ND-1000 espectrofotómetro. La integridad del ARN se verificó en el BioAnalyzer en la Genómica de UZL.
ARN secuenciación
Después de la selección de poliA + ARN, el ARN se convirtió en bibliotecas de ADNc utilizando el ARN de la muestra TruSeq kit de preparación (iluminación). Después de corta secuencia de extremo emparejado lee de 100 pb con la HiSeq2000 (iluminación), los valores del gen normalizados (fragmentos por Kilobase por millón de mapeado lee, FPKM) se calcula a través de la tubería del smoking (Tophat - Gemelos - CUMMERBUND) [16]. En resumen, los datos de RNA-seq fueron alineados al genoma de referencia utilizando TopHat (versión 2.0.6) que utiliza Bowtie como el núcleo algorítmica. El paquete Gemelos (versión 2.0.2) montado las transcripciones y detecta los genes y las transcripciones expresadas diferencialmente. CUMMERBUND (versión 2.0.0) se utiliza para visualizar los datos de expresión génica. Variant llamar utilizando los datos de RNA-seq se realizó con GATK (versión 2.2), después de la alineación con Tophat [14]. RNA-seq para las dos líneas celulares se realizó por triplicado, lo que permite la identificación de genes expresados diferencialmente. Para la variante de llamada, los triplicados fueron agregados para obtener una mayor cobertura. Camino-Express se utilizó para determinar, a partir de una lista de genes, ya sea en una vía específica más genes están involucrados de lo que cabría esperar por azar [17]
RT-PCR cuantitativa
ADNc. se generó a partir de ARN (1 g) con cebadores al azar hexamer y RevertAid transcriptasa inversa (Thermo Scientific). Quantitative PCR en tiempo real se realizó utilizando Platinum SYBR Green Supermix QPCR-UDG (Invitrogen). Los resultados fueron normalizados a la limpieza de genes β-actina y cada muestra se analizó por triplicado. La secuencia de los cebadores utilizados son: β-actina adelante 5'-ACCCAAGGCCAACCG-3 'y revertir 5'-TGTACGTTGCTATCCAGGCTGT-3', 5'-TMPRSS2 hacia adelante CCTGCATCAACCCCTCTAACTG-3 'y revertir 5'-AGGCGAACACACCGATTCTC-3', IGF1 hacia adelante 5'-TGGATGCTCTTCAGTTCGTG-3 'y revertir 5'-TCATCCACGATGCCTGTCT-3', 5'-IGF1R hacia adelante GTACAACTACCGCTGCTGGA-3 'y revertir 5'-TGGCAGCACTCATTGTTCTC-3'.
números
adhesión
Binary Sequence Alignment /mapa (BAM) archivos de conjunto de datos de secuenciación del exoma, así como datos de RNA-seq fueron depositados en la base de datos del Archivo Europeo de nucleótidos con el número de acceso PRJEB4877 y son accesibles a través de http://www.ebi.ac.uk /ENA /datos /view /PRJEB4877. Los números de acceso de la muestra son ERS363578 y ERS363580 de datos de secuenciación del exoma enteros de LNCaP y C4-2B respectivamente. Para la secuenciación de ARN, los números de acceso de la muestra son ERS363579 y ERS363581 para las células LNCaP y C4-2B respectivamente.
Confirmación de variantes no sinónimas
Las variantes de interés se confirmaron mediante secuenciación de Sanger de Los productos de PCR amplificados. Cebadores específicos para la región que contiene la variante a ensayar fueron diseñados utilizando el Primer NCBI-Blast (http://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) y la obtenida a partir de Integrated DNA Technologies. reacciones en cadena de la polimerasa se realizaron siguiendo los protocolos estándar utilizando Taq ADN polimerasa (Thermo Scientific). La amplificación de fragmentos de PCR específicos se confirmó por electroforesis en gel de agarosa. secuenciación de Sanger se realizó a LGC Genómica. archivos de seguimiento de secuencia se analizaron mediante Chromas Lite.
Resultados
La detección de mutaciones puntuales con toda exoma secuenciación
Se realizó un estudio de re-secuenciación de todo el exoma para ambos LNCaP y C4 2B células utilizando 100 pares de bases, de extremo emparejado lee en la plataforma Illumina. Esto generó 49 y 80 millones de lecturas LNCaP y C4-2B respectivamente (Tabla S1); para las células LNCaP, el 74% del exoma estaba cubierto por lo menos 20 veces, frente al 88% para las células C4-2B. características de secuenciación y los datos de control de calidad son similares para ambos conjuntos de datos (Tabla S1 y Figura S1) guía
Las mutaciones puntuales en los exomas se detectaron utilizando la tubería GATK a la que se aplicó un filtrado adicional:. mutaciones que sólo tenían por lo menos 12 × cobertura y una frecuencia de mutación por encima del 30% se tuvieron en cuenta. Los datos también fueron filtradas por la ausencia del cambio de pares de bases en dbSNP130. Por otra parte, el capítulo sesgo fue eliminado de forma manual (Tabla S2). Esto dio lugar a listas de 2188 y 3840 mutaciones puntuales no sinónimos en las células LNCaP y C4-2B, respectivamente (Tabla S3-4). Sólo 1.784 mutaciones eran comunes entre ambas líneas celulares, lo que indica claramente la acumulación de más de 2000 mutaciones adicionales en el genoma C4-2B. Esta gran diferencia en la carga de mutación no se puede explicar por la cobertura ligeramente inferior de la exoma LNCaP. Lo más probable es que estas mutaciones adicionales C4-2B han surgido durante la progresión tumoral y la metástasis ósea.
La detección de mutaciones puntuales en el transcriptoma secuenciación
secuenciación del transcriptoma se realizó inicialmente para determinar la expresión diferencial de genes. Se aisló ARN de las células LNCaP y C4-2B que habían sido tratadas durante 18 horas con el metiltrienolona andrógeno sintético. Se obtuvieron 157 y 131 millones de 100 pares de bases, de extremo emparejado lee por células LNCaP y C4-2B. En estas lecturas, el porcentaje de ribosomal, bases intrónicas y intergénicas fue muy baja (1,6% en total), lo que resulta en un alto suministro de bases de ARNm (Tabla S1). Como una medida de la calidad de los datos del transcriptoma, la variación en la cobertura a lo largo de cada transcripción se muestra en la Figura S2. Esto muestra sesgo no 5 'o 3' aunque hay una cobertura algo más baja cerca de los extremos de las transcripciones.
El flujo de trabajo para la detección y la posterior filtración de mutaciones puntuales fue similar a la utilizada para la secuenciación del exoma descrito mayor. Encontramos 1505 y 1882 mutaciones en las células LNCaP y C4-2B respectivamente, de los cuales se detectaron 1,054 en ambas líneas celulares (Tabla S5); 451 eran específicas para LNCaP y 828 para C4-2B.
La comparación con los datos de secuenciación del exoma transcriptoma
Una comparación de los recuentos específicos de alelo de lectura de genoma y la secuenciación del transcriptoma de datos de todas las mutaciones puntuales detectadas se puede utilizar como una medida de la calidad de secuenciación. La mayoría de las mutaciones tienen una frecuencia alelo similar tanto en ADN y ARN de secuenciación (Figura 1A-B). Incluso los pocos mutaciones homocigóticas con frecuencia de los alelos cerca de 1 en los datos de exoma, tienen una frecuencia de alelo similar en los datos de secuenciación de RNA.
A-B. Comparación de la frecuencia variante alélica de mutaciones detectadas usando exoma conjunto y secuenciación del transcriptoma. Los puntos negros son mutaciones que se han encontrado tanto por secuenciación del exoma y secuenciación del transcriptoma; puntos rojos fueron detectados sólo por la secuenciación del exoma y puntos verdes sólo mediante la secuenciación de ARN. Para la variante llamada, se aplicó un valor de corte de 30% de frecuencia variante alélica. Junto al gráfico una figura muestra el número de mutaciones de la secuenciación del exoma, la secuenciación del transcriptoma y el número encontrado por ambos métodos. Los gráficos se muestran para LNCaP (A) y las células C4-2B (B), respectivamente. C. La superposición de todas las mutaciones observadas por exoma y secuenciación del transcriptoma en células LNCaP y C4-2B.
La combinación de ambos la secuenciación del exoma y transcriptoma dio lugar a un total de 2244 mutaciones comunes a ambas líneas celulares (Figura 1C). Por otra parte, el número de mutaciones-LNCaP específico (546) es mucho menor que la de C4-2B específicas de cambios (2129), indicando de nuevo que las mutaciones se han acumulado durante la progresión a C4-2B. RNA-secuenciación confirmó sólo el 41 y el 35% de las variantes exónicas identificados por secuenciación del exoma conjunto de LNCaP y C4-2B. Este número se elevó a 52% cuando sólo tomamos los genes expresados en cuenta (FPKM & gt; 1). Por el contrario, el 60 y el 71% de la LNCaP y C4-2B variantes identificadas por secuenciación del transcriptoma, respectivamente, fueron confirmados por secuenciación del exoma.
Las sustituciones de nucleótidos
Los diferentes tipos de transiciones y transversiones en los exomas y transcriptomes de líneas celulares LNCaP y C4-2B pueden dar una idea de los procesos mutacionales que tuvieron lugar durante el desarrollo de estas células. Hemos observado que las mutaciones predominantes (40-42%) en ambas líneas celulares eran G-a-A y C-a-T transiciones (Figura 2).
Porcentajes de mutaciones en cada uno de los seis posibles mutaciones las clases están representadas por los datos de secuenciación del exoma secuenciación del transcriptoma y de ambas células LNCaP y C4-2B.
el tipo más frecuente de la edición de ARN en eucariotas superiores es la conversión de la adenosina a inosina. Como inosina se lee como una guanina después de la secuenciación, este tipo de edición se manifiesta en el ARN-secuenciación como una sustitución de la A a la G [18]. Sin embargo, en nuestros conjuntos de datos, el número de transiciones de la A a la G en el exoma y los datos de secuenciación del transcriptoma es el argumento comparable frente a un papel importante de la edición de ARN (Figura 2).
Validación de mutaciones puntuales
en total, 80 mutaciones en los datos exoma de LNCaP (47) y C4-2B (33) fueron validados por el manual Sanger re-secuenciación (Figura 3). Los genes que fueron seleccionados para la validación fueron clasificados de alta en una priorización funcional de todos los genes mutados en la línea celular C4-2B (calculados como en [12]). Nueve de estas mutaciones (en PIK3R1, TP53BP1, PRKCQ, CHEK2, RIPK2 y KLK3) fueron detectados por secuenciación de ADN y ARN en ambas líneas celulares, y éstos fueron confirmados con la secuenciación de Sanger en el ADN genómico y complementaria de LNCaP y C4-2B. Cuando probamos siete de las mutaciones C4-2B exoma (PIAS1 P216S y K380M, mknk2 L229M y T244N, I85N STAT5A y A1571T MYO18A y Q646 *), que no fueron detectadas por secuenciación del exoma LNCaP, pero su presencia en el genoma LNCaP fue evidente en los datos de secuenciación de ARN y también confirmó mediante secuenciación de Sanger en el ADN genómico y complementaria.
la validación se realizó mediante PCR tanto en el ADN genómico y copia-ADN, seguido de secuenciación de Sanger convencional. La primera y la segunda columna representa el nombre del gen y la sustitución de aminoácido, respectivamente. La tercera, cuarta, séptima y octava columna representan los resultados de secuenciación de próxima generación para la secuenciación del exoma y transcriptoma, que luego son validados con la secuenciación de Sanger en el quinto sexto, columna, noveno y décimo. A + indica que se ha detectado la mutación, a - denota que no se detectó la mutación, mientras que 0 significa que no producto de PCR podría ser amplificada y /que esta posición no estaba cubierto de secuenciación de próxima generación
.
también detectado y confirmado mutaciones específicas C4-2B en CASP9, FLNB, POLR2A y STAT5A en el ADN genómico y ADNc de células de C4-2B, pero no en células LNCaP. Por último, las mutaciones en los genes que no se expresan en LNCaP o C4-2B (KIT y GRAP) sólo pudieron ser confirmados en el ADN genómico.
En conclusión, el UnifiedGenotyper GATK para la variante de llamadas, que combinamos con nuestra amplia filtrado generados pocos falsos positivos. Resultados similares fueron presentados recientemente por Liu
et al.
comparando con GATK SAMtools, Atlas 2 y glftools [19]. Por otra parte, cabe señalar que nuestras validaciones indicaron que el exoma análisis no reveló todas las mutaciones, pero las variaciones que fueron descubiertos más probable es que son auténticos mutaciones.
Expresión
génica diferencial entre células LNCaP y C4-2B
a continuación queríamos buscar genes expresados diferencialmente entre las dos líneas celulares, ya que éstos podrían proporcionar pistas sobre los mecanismos que subyacen a la evolución de las células LNCaP en células C4-2B. Expresión diferencial fue llamado por el algoritmo de Tuxedo en base a datos de RNA-seq de los triplicados para cada línea celular, con un filtrado adicional de log 2 veces el cambio & gt; 2 y valor de q & lt; 0,001. Todas las réplicas fueron muy similares, como puede verse en la figura S3. Por otra parte, el coeficiente de variación cuadrado, que es una medida normalizada de la variabilidad cruzada de duplicados, es inferior a 0,05 para los genes expresados
.
Nuestro análisis resultó en la identificación de 703 genes expresados diferencialmente (Tabla S6), de los cuales 457 genes se expresan en mayor C4-2B y 246 son superiores expresados en las células LNCaP (Figura S2). Una visión general de la localización de los genes expresados diferencialmente en todo el genoma se puede encontrar en la Figura 4, junto con la frecuencia de mutaciones puntuales detectados en ambas líneas celulares, en las células C4-2B solamente, o en las células LNCaP solamente. RT-PCR cuantitativa en cinco genes expresados diferencialmente confirmó los datos de RNA-seq (datos no mostrados).
ideogramas de cromosomas se muestran alrededor del anillo exterior y orientadas PTER-qter en una dirección hacia la derecha con centrómeros indicados en rojo. El anillo externo representa la expresión diferencial de genes: 457 genes con una mayor expresión en C4-2B (puntos rojos) y 246 genes con mayor expresión en LNCaP (puntos azules). Otras pistas contienen (de fuera hacia dentro): 2244 mutaciones en común entre las células LNCaP y C4-2B, 2129 mutaciones específicas para las células C4-2B y 546 mutaciones específicas para las células LNCaP se muestra por la densidad por cada 10 megabases
.
fu
et al.
ya se ha descrito algunos genes expresados diferencialmente entre LNCaP y C4-2B, pero ninguno de los genes que se expresan diferencialmente detectados en nuestros datos [20]. Proponemos que las condiciones de cultivo y las diferencias entre las plataformas de detección más probable explicar esta discrepancia. Por otra parte, existe una considerable superposición de los conjuntos de datos con los de otros estudios que comparó LNCaP y C4-2 transcriptomes [21] - [25].
Pathway análisis de conjuntos de datos genómicos y transcriptomic
células LNCaP y C4-2B se siguen utilizando en la investigación básica y preclínica. Proponemos nuestras bases de datos de mutaciones y genes expresados diferencialmente como una importante fuente de inspiración para otros proyectos de investigación. Además, estas bases de datos pueden ahora ser revisados en busca de mutaciones específicas antes de que se empiezan a aprovechar estas células para estudiar cualquier vía específica relacionada con CaP.
Este párrafo es un ejemplo de una hipótesis basada en
in silico
análisis de nuestros datos. análisis de vías-Express de las mutaciones específicas C4-2B combinados con los 703 genes expresados diferencialmente entre células LNCaP y C4-2B indicó que se encontraron los cambios más significativos en la vía de la interacción del receptor de ECM y de adhesión focal. Ambas vías convergen en la expresión regulada por incremento de la cadena ligera de la miosina quinasa (MLCK) gen (Figura 5).
Las alteraciones se definen por tener un mayor (rojo) o disminución de la expresión (azul) en comparación con C4-2B LNCaP o por mutaciones somáticas en células C4-2B sólo (líneas negras gruesas). La sobreexpresión de la cadena ligera de la miosina cinasa en las células C4-2B podría distinguirlas de las células LNCaP en la migración celular y las características de adhesión focal.
Discusión
Una alta tasa de mutación en LNCaP y C4- 2B células
células
C4-2B se derivan de una metástasis ósea en ratones desnudos inoculados con células procedentes de los xenoinjertos de LNCaP derivados, resistentes a la castración llamados C4-2. Ellos se consideran un modelo preclínico útil para metastásico, resistente a la castración y el receptor de andrógenos positivo CaP. Aquí, proporcionamos a los mapas comparativos primera vez de las mutaciones puntuales detectadas en las células LNCaP y C4-2B. Además, aunque los análisis del transcriptoma de LNCaP y C4-2 se han reportado, hasta donde sabemos, este es el primer análisis del transcriptoma de células C4-2B.
C4-2B células, así como las células LNCaP tienen una sorprendente elevado número de mutaciones puntuales: 4373 y 2790 respectivamente mutaciones. Al igual que en el CaP primaria y muestras de CaP resistentes a la castración, el espectro mutacional está dominado por G-a-A y C-a-T transiciones [26] - [28]. Se sabe que los defectos de reparación de genes causan mutaciones de transición, particularmente G-a-A y sustituciones-C-a T [29]. Por lo tanto, la mayoría de las mutaciones pueden ser causadas por el sistema de reparación de genes defectuosos en las células LNCaP, debido a la deleción homocigota del extremo 3 'del gen MSH2 [30]. Chen
et al.
Ya se ha descrito una correlación alta inestabilidad del ADN satélite en las células LNCaP [31].
El número de mutaciones puntuales en nuestras líneas celulares es mucho más alto que el promedio 16-33 mutaciones detectadas en exomas enteros de muestras de CaP [26], [32] - [34]. Estas líneas celulares son por lo tanto atípica, pero podrían ser considerados como un modelo para los casos de CaP en la que desajuste de reparación es defectuosa como se describe, por ejemplo, de Barbieri
et al.
, Donde un solo tumor CaP albergaba una mutación del marco de la gen MSH6 entre otras mutaciones 996 [32]. Obviamente, una tasa de mutación más altas que explicaría el número aún mayor de mutaciones que encontramos en C4-2B comparación con LNCaP. Desafortunadamente, esto también va a oscurecer las mutaciones del conductor que pueden haber conferido una ventaja de supervivencia durante el proceso metastásico.
Relación entre las tasas de mutación y expresión
Tanto para el LNCaP y línea celular C4-2B, vemos que contienen genes altamente expresados más frecuentemente mutaciones puntuales que los genes no transcritas (p & lt; 0,0001, test de Chi cuadrado, para el más alto frente a bajo tercil expresado). Esto contradice el vínculo entre la organización general de la heterocromatina y las tasas de mutación regionales más altos en las células de cáncer humano [35]. Posiblemente, en estas líneas celulares, la cromatina abierta y la transcripción ligado induce más desajustes que normalmente se corrigen de manera eficiente, pero no en el caso de un desajuste de reparación deficiente.
Comparación de mutaciones LNCaP y C4-2B
No se detectaron mutaciones compartidas por 1784 en los exomas de LNCaP y C4-2B, y cambios C4-2B 2056-específicos, lo cual tiene sentido ya que las células C4-2B se derivan de las células LNCaP. Sin embargo, también se detectó 404 cambios LNCaP-específica, muchos de los cuales fueron confirmados por nuestros secuencias transcriptoma. Obviamente, las células LNCaP que analizamos se han desviado de las células LNCaP que se utilizaron originalmente para el desarrollo de las células C4-2B [9]. De hecho, hemos demostrado anteriormente que incluso las células LNCaP de diferentes laboratorios son genéticamente diferentes y mientras nuestras células se obtuvieron de ATCC (paso 48), el C4-2B fueron más probable derivan de un paso mucho más temprano de las células LNCaP en 1994 [9] , [12].
sugerencia de un papel de MLCK en el proceso metastásico
Nuestros datos pueden conducir claramente a la hipótesis en el proceso metastásico que tuvo lugar durante la conversión de LNCaP a C4- 2B células. Esto se ejemplifica por la convergencia de una serie de vías afectadas a una regulación al alza de MLCK. De hecho, hay varios enlaces publicados entre MLCK y el proceso metastásico. El análisis discriminante de los microarrays identificado el gen MLCK como el gen más informativo para el proceso de génesis CaP [36], y la inhibición de MLCK en ratas con CaP células da como resultado la reducción de la capacidad de invasión, lo que se debió principalmente a la alteración de la motilidad celular [37]. La inhibición de MLCK en fibrosarcoma, células de cáncer de mama y cáncer de páncreas también se traduce en disminución de la adhesión, la migración y la invasión y aumento de la apoptosis [38] - [41]. Por el contrario, la activación de MLCK conduce a un aumento en la invasión en las células de cáncer de mama y un aumento del potencial metastásico en el cáncer de pulmón de células no pequeñas [42], [43]. Por consiguiente, la expresión diferencial del gen MLCK en las dos líneas celulares investigados aquí podría correlacionarse con la mayor capacidad metastásica de las células C4-2B.
Conclusión
En conclusión, nuestros datos muestran claramente que existen grandes diferencias en el número y distribución de las mutaciones y la expresión de genes entre células LNCaP y C4-2B. Desde estas líneas celulares se utilizan universalmente para estudiar la progresión de no metastásico de CaP metastásico, estos datos son cruciales para que los investigadores interpretan correctamente sus resultados cuando se utilizan estas líneas celulares. Por otra parte, nuestras bases de datos serán muy útiles en el desarrollo de nuevas ideas de investigación.
Información de Apoyo
figura S1.
FastQC resultados de control de calidad de la base de por cualidades. resultados de la salida del software de control de calidad FastQC (versión 0.10.1) se muestran aquí para exoma secuenciación y transcriptoma de células LNCaP y C4-2B
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s001 gratis (TIF)
figura S2.
cobertura normalizado por la posición. La cobertura relativa media se muestra en cada posición relativa a lo largo de la longitud de la transcripción. LNCaP se representa en verde, mientras que C4-2B se representa en rojo. El eje x representa la longitud de genes normalizado al 100%, donde 0 es 'final de cada transcripción y 100 el 3' del extremo 5
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s002 gratis (TIF )
Figura S3.
mapa de calor de 703 genes expresados diferencialmente. El mapa de calor muestra los tres réplicas de cada línea celular, que son muy similares. Todos los genes expresados diferencialmente se detectaron utilizando el algoritmo de smoking, con q & lt; 0,001 y log 2 veces el cambio & gt; 2 como puntos de corte. Está claro que la mayoría de los genes está regulada positivamente en C4-2B en comparación con LNCaP, mientras que un grupo más pequeño de genes se downregulated en C4-2B
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s003
(TIF )
Tabla S1. .
Características de secuenciación
doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s004 gratis (XLSX)
Tabla S2. .
Los filtros utilizados para identificar mutaciones puntuales en los exomas de células LNCaP y C4-2B
doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s005 gratis (XLSX) sobre Table S3. List de mutaciones puntuales identificadas en el exoma de las células LNCaP
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s006 gratis (XLSX) sobre Table S4. List de mutaciones puntuales identificadas en el exoma de las células C4-2B
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s007 gratis (XLSX) sobre Table S5. .
Los filtros utilizados para identificar mutaciones puntuales en los transcriptomes de células LNCaP y C4-2B
doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s008 gratis (XLSX) sobre Table S6. List de 703 genes que se expresan diferencialmente entre células LNCaP y C4-2B
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s009 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos a Rita Bollen y Hilde de Bruyn por su excelente asistencia técnica. Agradecemos a nuestros colegas en el Laboratorio de Endocrinología Molecular útil para los debates.