Extracto
Geranylated 4-phenylcoumarins, DMDP-1 & amp; -2 Aislado de elegans
Mesua
fueron investigados para el potencial anticáncer contra las células de cáncer de próstata humano. El tratamiento con DMDP-1 & amp; -2 Dado lugar a la muerte celular en un tiempo y dosis de manera dependiente en un ensayo de MTT en todas las líneas celulares de cáncer de prueba con la excepción de las células de adenocarcinoma de pulmón. DMDP-1 mostró mayor eficacia citotóxica en las células PC-3, mientras que DMDP-2 fue más potente en células DU 145. Citometría de flujo indicado que ambos cumarinas tuvieron éxito para inducir la muerte celular programada después de 24 h de tratamiento. Elucidación del modo de acción a través de matrices de proteínas y transferencia de Western demostró la muerte inducida sin ninguna expresión significativa de las caspasas, Bcl-2 de proteínas de la familia y de PARP escindida, lo que sugiere la implicación de las vías de caspasa-independiente. En la identificación de la autofagia, el análisis de GFP-LC3 mostró una mayor punteada en las células PC-3 pre-tratados con CQ y tratados con DMDP-1. En estas células disminución de la expresión de la proteína autofagosoma, p62 y catepsina B autofagia confirmado aún más. Por el contrario, las células DU 145 pre-tratados con CQ y se trató con DMDP-2 ha reducido punteada GFP-LC3 aunque el número de células con obvio puntos lagrimales GFP-LC3 fue significativamente mayor en las células tratados con inhibidor de. El nivel de aumento de p62 sugiere fugas de la catepsina B en el citosol para desencadenar potenciales mediadores de muerte aguas abajo. Esto correlaciona con aumento de la expresión de la catepsina B y la reducción de la expresión después de tratamiento con su inhibidor, CA074. También auto-degradación de la calpaína-2 tras el tratamiento con DMDP-1 & amp; -2 y su inhibidor solo, calpeptina en comparación con el tratamiento de combinación, la participación confirmado adicional de la calpaína-2 en PC-3 y DU 145 células. El tratamiento con DMDP-1 & amp; También -2 mostraron sobre regulación de los niveles totales y fosforilados p53 de una manera dependiente del tiempo. Por lo tanto, DMDP-1 & amp; -2 Mostró capacidad de activar múltiples vías de la muerte que implican la autofagia, lisosomal y las proteínas de muerte del retículo endoplásmico que potencialmente podría ser manipulado para desarrollar una terapia contra el cáncer en las células resistentes apoptosis
Visto:. Suparji NS, Chan G, H Sapili , Arshad NM, En LLA, Awang K, et al. (2016) Geranylated exhiben efectos anticancerosos 4-Phenylcoumarins contra las células de cáncer de próstata humano a través del mecanismo independiente de caspasas. PLoS ONE 11 (3): e0151472. doi: 10.1371 /journal.pone.0151472
Editor: Ilya Ulasov, Instituto Sueco de Neurociencia, Estados Unidos |
Recibido: 26 Agosto, 2015; Aceptado: 29 de febrero de 2016; Publicado: 14 de marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Suparji et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:.. Este estudio fue apoyado por la Universidad de Malasia de Investigación de posgrado Grant (PV043-2011A) y el Programa de Investigación de la Universidad de Malaya (RP001-2012A)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más común, así como la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres [1]. A pesar de la disponibilidad de múltiples opciones de tratamiento, actualmente no existen terapias eficaces disponibles para el tratamiento del cáncer de próstata independiente de andrógeno-apoptótica resistente que a menudo se presenta después de la terapia de privación o ablación hormonal [2]. fitocompuestos naturales se consideran como una fuente importante de quimiopreventivo del cáncer y los agentes quimioterapéuticos. Ejemplos destacados incluyen compuestos basados en la cumarina que se derivan de las frutas y tallo de piel de diferentes plantas, como
Casimora edulis
[3],
Calophyllum inophyllum
[4],
Mesua ferrea
[5] y
Mesua kunstleri
[6]. Las cumarinas se han reconocido poseer anti-inflamatorio, antioxidante, antialérgica, hepatoprotectora, antitrombótico, antimicrobianos, anti-arrythmic, anti-osteoporosis, antiviral, y las actividades anticancerígenas [7-11]. Yang y colegas, demostraron quince cumarinas isoprenylated aisladas de
Mammea americana
exhibían efectos citotóxicos significativos y alta actividad anti-oxidante en líneas celulares de cáncer de colon humano [12]. En un estudio con tanto cumarina y 7-hidroxicumarina, la inhibición del crecimiento celular en líneas celulares de carcinoma de pulmón mediante la inducción de G
detención del ciclo celular y la apoptosis 1 fase se demostró [13]. En otro informe, se observaron cumarinas geranylated para ejercer acciones anti-proliferativos a través de la muerte celular apoptótica en células de leucemia [14]
En este estudio, los dos principales geranylated 4-phenylcoumarins.; DMDP-1 & amp; -2 Aislado de la corteza del
Mesua elegans gratis (Clusiaceae), conocido localmente como "Pokok Penaga", fueron sometidos a diversos ensayos citotóxicos y apoptosis. Para el conocimiento de los autores, este es el primer informe sobre la inducción de la muerte celular múltiple caspasa-independiente programados "apoptosis similar" en las células de cáncer de próstata en un geranylated 4-phenylcoumarins.
Materiales y Métodos
Colección de
Mesua elegans
La corteza de
Mesua elegans gratis (rey) Kosterm se recogió de Sungai Reserva Forestal Badak, Kedah, Malasia. La muestra fue identificado por el Sr. Teo Eng Leong y depositado en el Departamento de Química de la Facultad de Ciencias, Universidad de Malaya herbario (Ref. No: KL5232).
Extracción y purificación de análogos de cumarina
Dried corteza molida de
Mesua elegans gratis (1,5 kg) fue macerada con hexano (3 x 4 l, 48 h cada vez) a temperatura ambiente. El extracto se secó mediante evaporador rotatorio que daba un residuo gomoso amarillo (120,3 g). Una porción del hexano en bruto (13,0 g) se sometió a fraccionamiento cromatografía en columna sobre gel de sílice 60 (malla 230-400) y se eluyó con hexano-EtOAc (9,5-0) y EtOAc-MeOH (5-0) para dar fracciones AH. Fracción A se sometió a cromatografía de gel de sílice y se eluyó con hexano-EtOAc (9,7 a 9,5) para producir sub-fracciones A1-A4. Las observaciones de la separación de la fracción se realizaron utilizando TLC con gel de sílice 60 F
254 placas. Fracción A2 se sometió a análisis HPLC utilizando ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 mm de diámetro interno x 150 mm x 3,5 m columna de HPLC, y han separado con ZORBAX Eclipse Plus C18, 9,4 mm de diámetro interno x 250 mm x 3,5 m columna de HPLC para purificar isómeros DMDP-1 & amp; -2 (Fig 1). sistema de purificación de agua automático se utiliza para la separación por HPLC. Los espectros de RMN se obtuvieron utilizando JEOL LA400 FT-NMR y JEOL ECA400 sistema de espectrómetro FT-NMR (400 MHz) con CDCl
3 como disolvente. Los espectros de UV se registraron en un espectrofotómetro de registro Shimadzu UV-Visible el uso de etanol como disolvente con celda del espejo UV. Los espectros de IR se obtuvieron a través de Perkin Elmer FT-IR Espectrómetro Spectrum RX1 con CHCl
3 como disolvente. Los espectros de masas se llevó a cabo en 6530 Agilent Technologies de masa exacta de Q-TOF de LC-MS, con ZORBAX Eclipse XDB-C18 de resolución rápida de 4,6 mm de diámetro interno HT x 50 mm x 1,8 m de columna (S1 Tabla)
(A) Estructura química de DMDP-1 & amp.; -2. (B) (I) cromatograma HPLC de la fracción A2 con las siguientes condiciones experimentales (analítica): columna, ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 mm de diámetro interno x 150 mm x 3,5 m; fase móvil, dos disolventes: A, ácido fórmico al 0,1% en H
20 y B, ácido fórmico al 0,1% en MeOH; el programa de elución a 0,6 ml /min como isocrática con 90% de B (0-30 min) para proporcionar isómeros DMDP-1 & amp; -2. (II) cromatograma HPLC de la fracción A2 con las siguientes condiciones experimentales (semi-preparativa): columna, ZORBAX Eclipse Plus C18, 9,4 mm de diámetro interno x 250 mm x 3,5 m; fase móvil, dos disolventes: A, ácido fórmico al 0,1% en H
20 y B, ácido fórmico al 0,1% en MeOH; el programa de elución a 3,0 ml /min como isocrática con 90% de B (0-50 min) para proporcionar isómeros DMDP-1 & amp; -2
Líneas celulares y condiciones de cultivo
Se utilizaron un total de diez líneas celulares de cáncer humano:. Ca esquí, HeLa, HepG2, A549, PC-3, DU 145, MCF7 (adquirido de ATCC), HSC4 (obtenido a partir de cáncer de la Fundación de Investigación Initiative, Malasia), MDA-MB-231 y SK-LU-1 (comprado de AseaCyte, Malasia). NP69, la línea celular normal fue un regalo del profesor GSW Tsao [15]. Cada línea celular se mantuvo con el medio de crecimiento apropiado (RPMI 1640: para las células A549, SK-LU-1, MDA-MB-231, PC-3, DU 145, MCF7) y (DMEM: para las células de Ca de esquí, HepG2, HeLa, HSC4) y (queratinocitos-SFM: NP69), que se complementa con 10% (v) de suero bovino v /fetal. Las células fueron cultivadas como monocapas a 37 ° C en atmósfera humidificada con 5% de CO
2/95% de aire
MTT ensayo
Los efectos citotóxicos de DMDP-1 & amp.; -2 Sobre el cáncer se determinaron las líneas celulares utilizando el ensayo MTT. Un total de 1,0 x 10
se sembraron 4 células (100 pl /pocillo) y se trató a concentraciones de 10 a 100 M durante 24 h con DMSO como control negativo. Se añadió solución de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo y se incubó a 37 ° C durante 1 h. Se midió la absorbancia a 560 nm usando un lector de microplacas (Tecan salida del sol
®, Suiza).
Live /Dead ensayo
Evaluación de la viabilidad celular después del tratamiento con ambos análogos se realizó usando el LIVE /DEAD
® /kit de citotoxicidad Viabilidad (Molecular Probes, Invitrogen, Nueva York, EE.UU.). Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio colocado en placas de 6 pocillos y se trató a IC
50 concentración durante 24 h. Las células se tiñeron utilizando un sistema de doble fluorescencia que consta de 150,0 l de calceína-AM (2,0 M) y homodímero de etidio (EthD) (4,0 M). Longitudes de onda de excitación y emisión se fijaron a 494/517 nm para calceína-AM y 528/617 nm para EthD respectivamente. La visualización de las muestras se realizó utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TS-100 (Nikon, Japón) bajo un aumento de 100x.
Flujo de citómetro de análisis
Detección de diversas etapas de la muerte celular se llevaron a cabo usando Anexina V Kit de detección de apoptosis FITC (Calbiochem, EE.UU.). Brevemente, 1,0 x 10
4 células tratadas y no tratadas se incubaron con anexina-V (200μg /ml). Las muestras se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de unión 1 × hielo frío con yoduro de propidio (PI). La detección y el análisis se llevó a cabo utilizando el flujo BD FACSCanto II ™ citómetro (Becton Dickenson, EE.UU.). Para el análisis del ciclo celular, 2,0 x 10
4 células tratadas y no tratadas se suspendieron en PI (50,0 mg /ml) y RNasa A (10,0 mg /ml). Estas células fueron fijadas en (v /v) de etanol 70.0% enfriado en hielo y se mantuvieron a -20 ° C durante la noche. la distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo y los porcentajes en diferentes fases se determinaron por el software de análisis del ciclo celular ModFit LT.
array de proteínas La apoptosis
Un total de 1,0 x 10
6 células eran sin tratar y tratados por 6 h. Los lisados celulares se normalizaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, EE.UU.) y se incubaron a 4 ° C durante la noche con Raybio
® diapositivas de matriz humana Apoptosis anticuerpo (RayBiotech Inc. EE.UU., GA). Todos los portaobjetos se lavaron y se usó un cóctel de combinación anticuerpo biotinilado para detectar proteínas relacionadas con la apoptosis. Después de la incubación con Hylate Plus ™ conjugado estreptavidina, se detectaron señales con un escáner de fluorescencia por AXON GenePix
® utilizando el canal Cy2. expresión de la proteína diana preseleccionado elegidos en base a un umbral veces el cambio de ≥ 1,5 o ≤ -1.5.
Western Blot
Nuclear y proteínas citoplasmáticas fueron extraídos de las líneas 145 células PC-3 y DU tratada con análogos de IC
50 valores de 6, 12, y 24 h utilizando la NE-PER
® nuclear y citoplasmática extracción kit (Pierce, EE.UU.). Las concentraciones se determinaron usando BCA kit de ensayo de proteínas (Pierce, EE.UU.). cantidades equivalentes de proteína (20 mg) de ambas células tratadas y no tratadas se separaron en 12% (w /v) SDS-geles de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, que se incubaron posteriormente con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con peroxidasa de rábano (HRP) -vinculada anticuerpos secundarios. 14 anticuerpos primarios de Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA contra GAPDH, caspasa-3, -8, -9, PARP, Bcl-2, Bax, asociada a los microtúbulos cadena ligera (LC3), granzima B, catepsina B, calpaína-2, se han usado p53, p53 y p62 fosfo /SQSTM1. Las bandas de proteínas se visualizaron mediante señales de aumento de quimioluminiscencia en películas de rayos-X. Intensidades de todas las bandas se cuantificaron utilizando el software de análisis de imágenes (NIH ImageJ v1.43, Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.). anticuerpos de control anti-GAPDH se utilizaron para la normalización de las intensidades de las bandas.
Análisis de GFP-LC3
PC-3 y DU 145 células se sembraron a una densidad de 4,0 x 10
4 células /pocillo en placas de 6 pocillos, y dejaron adherir durante la noche en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO
2. Todas las células fueron transducidas con el reactivo RFP-GFP-LC3B usando el kit disponible en el mercado RFP-GFP-LC3B sensor tándem Premo autofagia (Life Technologies, EE.UU.) durante 48 h. El día siguiente, las células se incubaron con 100 mM de cloroquina difosfato (CQ), y se trató con cualquiera DMDP-1, DMDP-2 o se deja sin tratar (control) durante 24 h. Las células se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Instruments, Japón) usando un filtro azul para detectar la acumulación de GFP-LC3 punteada con emisión de GFP.
El análisis estadístico
se expresaron Todos los resultados como media ± desviación estándar de los datos obtenidos a partir de al menos tres réplicas biológicas independientes. Utilizó un modelo lineal se utilizó para evaluar las diferencias significativas entre los controles y las muestras tratadas con un
p-valor umbral de
≤ 0,05.
Resultados
Caracterización de cumarina análogos
Tanto DMDP-1 & amp; -2 Fueron aislados del extracto de hexano de la corteza de los
Mesua elegans
con & gt; 98% de pureza (S1 figura). DMDP-1 se aisló como cristales de color blanco con un p.f. 90-92 ° C mientras que DMDP-2 como un aceite incoloro. HRESIMS reveló una [M + H]
pico + ion a m /z 475,2728 (calculado 475,5945), correspondiente a la fórmula molecular de C
30H
34o
5 para ambos análogos. RMN, los datos de IR y UV de estos compuestos han sido estudiados y en comparación con la literatura [5, 16], y las estructuras de estos compuestos se confirmaron como DMDP-1[5,7-dihydroxy-8-(2-methylbutanoyl)-6-[(
E
)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-4-phenyl-2
H
-chromen-2-one] y DMDP-2[5,7-dihydroxy-8-(3-methylbutanoyl)-6-[(
E
)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-4-phenyl-2
H
-chromen-2-one]
Cytotoxic efectos de cumarina análogos
Nuestros resultados demuestran la inducción de la citotoxicidad de una manera dependiente de la dosis y el tiempo después de 24 h de la exposición en las líneas celulares ensayadas. Sobre la base de IC
50 valores, DMDP-1 la muerte celular inducida con más eficacia en PC-3 células con un IC valor
50 de 9,0 M mientras DMDP-2 realiza mejor en DU 145 células con un valor de 24,0 M, indicando un efecto profundo en líneas celulares de cáncer de próstata (Tabla 1). La viabilidad de las células tratadas con DMSO solo se ve afectada de forma insignificante (≤2.0%) por lo tanto se descarta la participación de la citotoxicidad inducida por disolvente. Se llevaron a cabo ensayos de Live /Dead para confirmar sus efectos citotóxicos, la muerte celular se observó solamente en PC-3 y DU 145 células después del tratamiento, pero no en NP69 células en las que la viabilidad se mantuvo a 92,7%. Porcentaje de PC-3 de la viabilidad celular se redujo de 98,0% a 43,0%, mientras que la viabilidad de las células DU 145 se redujo de 95,0% a 38,0% (Fig 2A). Esto indicó que ambos compuestos causan un efecto citotóxico más gradual farmacocinético en las células normales de crecimiento lento en comparación con la rápida proliferación de las células cancerosas, lo cual es una característica común entre los fármacos quimioterapéuticos.
Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar de tres técnicos y tres repeticiones biológica
(A) ensayo Live /Dead después del tratamiento con DMDP-1 & amp.; -2 Para 24 h y DMSO como disolvente de control. fluorescencia verde indica células viables teñidas con calceína-AM, mientras que la fluorescencia roja representa las células muertas teñidas con homodímero de etidio. (B) Anexina V-FITC /PI análisis de citometría de flujo gráfico de puntos después del tratamiento durante 24 h. Porcentaje de muerte celular se calculó con base en la parte superior derecha e inferior derecha cuadrantes de un total de 1,0 x 10
4 células
DMDP-1 & amp.; -2 Induce la muerte celular
A raíz de los datos iniciales de citotoxicidad, decidimos enfocar este estudio sobre líneas celulares de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos. Anexina V-FITC /PI citometría de flujo se utilizaron ensayos para el modo de determinar la muerte celular. porcentaje de muerte celular se calculó con base en la parte superior derecha (células apoptóticas tarde) y los cuadrantes inferiores derechas (primeras células apoptóticas) de la citometría de flujo. La transferencia por puntos de un total de 1,0 x 10
4 PC-3 células después del tratamiento con CI
50 de DMDP-1 mostraron un aumento del 12,3% al 46,4%. Se observaron efectos similares en DMDP-2 células DU 145 tratados donde la población muerte celular aumentó de 3,1% a 49,7% (figura 2B). A pesar de que la muerte celular se observó también en células NP69, la población de la muerte celular se mantuvo por debajo de 10,4% después de 24 h de tratamiento
DMDP-1 & amp.; -2 Induce la caspasa-independiente de muerte celular
En nuestro intento por determinar si la muerte celular fue mediada por apoptosis, se utilizó una matriz de anticuerpos capaces de detectar 43 genes relacionados con la apoptosis implicados en ambas vías intrínseca y extrínseca. En la Tabla 2, el tratamiento de células PC-3 con DMDP-1 demostrado una expresión reducida de la survivina y la insulina-factor de crecimiento receptor-1 (IGF1R) acoplado con un mayor nivel de factor de crecimiento de insulina proteína-2 de unión (IGFBP-2) y proteína 27 de choque térmico (HSP-27). Mientras tanto, el tratamiento de DMDP-2 en células DU 145 reveló expresiones reduce de tres proteínas, es decir, CD40-ligando, factor de necrosis tumoral receptor 1 (sTNF-R1) y ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF-1 (TRAIL-1). Todas las demás proteínas de la prueba no mostró ningún cambio significativo (cambio & lt; 1,5 o & gt; -1.5) en la expresión, incluyendo los efectores prominentes apoptóticos como caspasas-8 y -3, así como Bcl-2 miembros como Bad, Bax , Bim y Bcl-2 en sí. Curiosamente, esto indicaba que la vía del receptor de muerte y la vía mitocondrial no se activaron siguiente DMDP-1 & amp; tratamientos -2, pero en vez sugirieron un modo independiente de caspasas de la muerte celular. Con el fin de investigar los mecanismos de caspasa-independiente que intervenga, análisis de transferencia Western de DMDP-1 & amp; -2 Tratados PC-3 y DU 145 células se llevó a cabo. Los resultados se encontró que era consistente con los datos obtenidos a partir de la matriz de proteína, en donde no se observó inducción de caspasas-3, -8 y -9 proteínas, mientras que el nivel de anti-apoptótica se encontró Bcl-2 para aumentar de forma concomitante con el cambio en Bax (figura 3a & amp; 3b). Esta observación es también coherente con el resultado negativo obtenido a partir de ensayos de fragmentación poli-ADP ribosa polimerasa (PARP) de escisión, la detención del ciclo celular y de ADN, donde se encuentra la activación de las caspasas estar ausente (Fig S2).
Un total de 42 proteínas relacionadas con la apoptosis se analizaron usando el RayBio
® humano apoptosis Anticuerpo matriz de proteína G Serie 1. media veces el cambio se calcularon en comparación con las células no tratadas a partir de cuatro réplicas biológicas.
(a ) El tratamiento con DMDP-1 & amp; -2 Mostró de cuerpo entero de los niveles de proteína y la ausencia de PARP escindida y las caspasas-9, -3 y -8. (B) Análisis de Bcl-2 y pro-apoptóticos los niveles de proteína Bax anti-apoptóticos. La cuantificación de la intensidad de la banda de proteína se determinó mediante análisis de densitometría y normalizado a GADPH utilizando el software ImageJ v1.43. Todos los resultados se presentan como media ± S.D. intensidad normalizada. . De tres experimentos independientes
DMDP-1 & amp; -2 Induce la muerte celular a través de múltiples vías
Con el fin de identificar los mecanismos de caspasa-independiente estuvieron involucrados, el Western Blot análisis de las células PC-3 y DU 145 tratados y no tratados se llevaron a cabo. En la figura 3, la ausencia de PARP escindida, las caspasas-3, -8 y -9, sobre regulación de Bcl-2 y la baja regulación de Bax confirmaron nuestra hipótesis sobre la posible implicación de las vías independiente de caspasas mediada por la autofagia u otro orgánulos, tales como lisosomas y retículo endoplásmico (ER), que libera y activa las proteínas de muerte, tales como las catepsinas, granzimas y calpaínas. datos occidentales (Fig 4) demostraron un aumento en los niveles de catepsina B en células DU 145 que indica que la DMDP-2 inducida por la activación de esta cisteína proteasa lisosomal en lugar de las caspasas. los niveles de calpaína-2, que son de auto-degradación al ser activado [17], se redujeron después del tratamiento por DMDP-1 & amp; -2. Este resultado fue validado con el tratamiento de combinación de cada análogo con el inhibidor de la calpaína-2, calpeptina por Western blot. Sin embargo, no parece granzima B a desempeñar un papel como sus niveles de proteína se redujo constantemente durante el transcurso de 24 h de tratamiento. Curiosamente, los resultados Western indicó que tras el tratamiento, los niveles totales y fosforilados p53 eran hasta reguladas de una manera dependiente del tiempo. La activación de p53 puede aumentar la selectividad y la seguridad del tratamiento con estos dos análogos de cumarina por la protección selectiva de las células y tejidos normales
Las células (A) se trataron con DMDP-1 & amp.; -2 Durante 24 h, seguido de un examen de las proteínas clave implicadas en el modo múltiple de la muerte celular por transferencia Western. (B) Cuantificación de las intensidades de banda se determinó por análisis densitométrico y se normalizó a GAPDH utilizando el software ImageJ v1.43. Todos los resultados se presentan como media ± S.D. intensidad normalizada. de tres experimentos independientes.
DMDP-1 induce la autofagia y activa calpaína-2 en células PC-3
Western Blot en el nivel de proteína LC3-I /II, que es un marcador estándar para la activación de la autofagia mostró conversiones de LC3-I a LC3-II después del tratamiento con DMDP-1 y el tratamiento combinado de DMDP-1 y el inhibidor de la autofagia temprano, 3MA en la línea celular PC-3. Sin embargo, no se observó conversión en las células no tratadas y tratadas con inhibidor. Además, el análisis del resultado de GFP-LC3 mostró un aumento punteada GFP-LC3 en células PC-3 pre-tratados con cloroquina (CQ) y se trató con DMDP-1, mientras que la GFP-LC3 se distribuye uniformemente a lo largo de las células en los pocillos de control, lo que sugiere una actividad de fusión para autofagosomas y lisosomas en las células tratadas DMDP-1. punteada GFP-LC3 era propenso a agruparse y co-localizar con lisosomas en las células tratadas con ambos CQ y DMDP-1. Esto es al contrario que la de las células DU 145 tratados con DMDP-2, en los que un mínimo de LC3-I /conversión y II reduce punteada GFP-LC3 a pesar de que el número de células con obvio puntos lagrimales GFP-LC3 fue significativamente mayor en las células tratadas con CQ ( Fig 5). La formación de autofagosoma también fue visto como un mayor número de vacuolas en las microfotografías (figura 6). En investigar más el efecto de la DMDP-1 & amp; -2 En la formación de autophagolysosome, los cambios en los niveles de p62, una proteína de unión de ubiquitina (también conocida como SQSTM1) que participan en la autofagia, lisosoma o se observó degradación de proteasoma dependiente de las proteínas. Como se muestra en la figura 7A, el tratamiento de DMDP-1 en las células PC-3 mostraron disminución de nivel de p62 a las 24 h, proporcionando evidencia adicional de que DMDP-1 induce la autofagia. Este resultado está de acuerdo con el patrón de expresión de la catepsina B, que disminuyó después del tratamiento con DMDP-1 a las 24 h (Fig 4). Mientras tanto, en células DU 145, el aumento del nivel de p62 y catepsina B sugirió que DMDP-2 media la permeabilidad lisosomal resulta en la fuga de la catepsina B en el citosol para desencadenar mediadores de muerte aguas abajo y no la fusión de autophagosome con lisosoma para inducir la autofagia. proteína muerte actividad retículo endoplasmático calpaína-2 en las células PC-3 se controló con tratamiento de combinación de su inhibidor, calpeptina y DMDP-1 por transferencia de western. La calpaína-2 expresión tratado con DMDP-1 es la más baja en las células PC-3 en comparación con las células sin tratar, tratamiento de combinación de DMDP-1 con calpeptina y el tratamiento con solamente calpeptina. El tratamiento con calpeptina sólo mostró la más alta calpaína-2 expresión como resultado de la inhibición de su auto-degradación, la validación de que la activación de la calpaína-2 en células PC-3 se tras el tratamiento con DMDP-1.
(A) imágenes de fluorescencia representativas que muestran la distribución puntiforme de GFP-LC3B en DMDP-1 & amp; -2 Células tratadas. PC-3 en DU 145 células fueron transducidas con RFP-GFP-LC3B 48 h antes del tratamiento de 9 DMDP1 mu M, 100 choloquine M o se deja sin tratar (control). Las células también se trataron previamente con 100 CQ mu M durante 4 h, seguido por 9 M de DMDP-1 & amp; tratamiento -2 24 h más tarde, la distribución puntiforme de GFP-LC3 se visualizó y se compara con la distribución difusa en las células control. El porcentaje de células PC-3 con la acumulación evidente de puntiforme GFP-LC3. Medios ± SD, n = 3. *: p ≤ 0,05. (B) Expresión de tratamiento LC3-I /II con ambos análogos con y sin inhibidores durante 24 h. La cuantificación de la intensidad de la banda se determinó mediante análisis de densitometría y normalizado a GADPH utilizando el software ImageJ v1.43. Todos los resultados se presentan como media ± S.D. intensidad normalizada. de tres experimentos independientes.
Todas las imágenes se muestran un aumento de 400x, y la formación de vacuolas se indican con flechas blancas.
(A) Expresión de los niveles de p62 tras el tratamiento con ambos análogos en PC-3 y DU 145 en 0-24 h. (B) Expresión de la catepsina B y el tratamiento de la calpaína-2 con dos análogos con y sin inhibidores de las 24h. La cuantificación de la intensidad de la banda se determinó mediante análisis de densitometría y normalizado a GADPH utilizando el software ImageJ v1.43. Todos los resultados se presentan como media ± S.D. intensidad normalizada. de tres experimentos independientes.
lisosomal y la actividad retículo endoplasmático (ER) está involucrado en DMDP-2 inducida por la muerte celular
transformación mínima de LC3-I /II y el aumento de la expresión de p62 , indica firmemente que DMDP-2 inhibe la autofagia una etapa tardía, particularmente en el punto de la actividad lisosomal. Como se muestra en la figura 7B, el tratamiento de DMDP-2 en DU 145 células durante 24 horas resultó en el aumento de expresión de la catepsina B. El tratamiento con su CA074 inhibidor solo en gran medida la reducción de expresión de catepsina B. Una combinación de tratamiento con su inhibidor, CA074 y DMDP-2 dio lugar a ningún cambio significativo de la expresión de catepsina B en comparación con las células tratadas, lo que confirma su participación en la muerte celular. Por otra parte, también se midió el cambio en la expresión del retículo endoplásmico muerte proteasa calpaína-2. Fig 7B muestra un nivel reducido de proteína de la calpaína-2 como resultado de la activación de la proteasa y la auto-degradación después del tratamiento con DMDP-2 en células DU 145. Un tratamiento de combinación de su inhibidor, calpeptina y DMDP-2 mostró una menor expresión de la calpaína-2 en comparación con las células no tratadas, pero más alta en las células tratadas con calpeptina solo, proporcionando evidencia adicional de DMDP-2 induce la muerte celular ER.
Discusión
En cuanto a su estructura química, tanto geranylated 4-phenylcoumarins posee el mismo anillo de cumarina característica exacta, con sólo una ligera variación; en DMDP-1, un resto 2-metilbutanoil está sustituido en la posición C-8, en el que un resto 3-methylbultanoyl en la posición C-8 en DMDP-2. La estructura-actividad comparación relación mostró que esta sustitución de metilo solo era capaz de alterar eficacias citotóxicos y preferencias hacia las líneas celulares particulares. Este estudio proporciona evidencia de que apoyó un informe anterior que las alteraciones en la estructura química de las cumarinas podrían mejorar sus propiedades citotóxicas [11].
La activación de las caspasas han sido frecuentemente visto como sinónimo de muerte celular por apoptosis [18]. Sin embargo, la muerte celular independiente de las vías de caspasas también son importantes como mecanismos de salvaguarda para proteger el organismo contra el daño no deseado y potencial cuando caspasa mediada por rutas fallan, y se pueden activar en respuesta a agentes citotóxicos u otros estímulos de muerte. Al igual que la forma en las mitocondrias desempeñan un papel clave en la apoptosis, otros orgánulos tales como lisosomas y retículo endoplásmico también juegan un papel igualmente importante en la liberación y activación de factores de muerte tales como catepsinas, calpaínas, y otras proteasas [19-22]. Dependiente de caspasa y apoptosis -independiente son altamente formas de muerte celular programada regulados y juegan un papel crucial en los procesos fisiológicos tales como el desarrollo de tejidos, la homeostasis y la eliminación de células no deseadas [23]. vía dependiente de caspasa incluye las vías mitocondrias intrínsecos y extrínsecos, mientras que la caspasa-independiente, incluye la apoptosis similar, la autofagia y necrosis celulares muertes-como mediadas por lisosomas y ER [18, 19]. Durante la apoptosis, los niveles de proteína caspasa no aumentarán, pero serán procesados por escisión para la activación, mientras que proteínas Bcl-2 serán trasladadas a las mitocondrias. Informe en 2000 por Saeki y sus colegas demostraron que los mecanismos distintos de la apoptosis causaron la muerte celular en células Bcl-2 abajo reguladas. Su hallazgo indicó que el factor inductor de apoptosis (AIF) no se translocan al núcleo como en el caso de la apoptosis, sino que más bien se mantuvo dentro de la mitocondria a través del curso de la autofagia. [24].
A veces los esfuerzos para clasificar inducción de la muerte celular programada específica, es difícil, ya que más de un programa de muerte puede ser activado al mismo tiempo [25]. Como se evidencia en este estudio, un modo de caspasa-independiente de muerte celular es inducida por el tratamiento con los análogos de cumarina, y hay indicios de la participación de no uno, sino la muerte múltiple apoptosis similar a celular programada, es decir, la autofagia, lisosoma (catepsina B) y retículo endoplásmico (calpaína-2).
Los medicamentos que inducen la muerte a través de lisosomas y retículo endoplásmico son prometedores como blancos y los mediadores de la señalización apoptótica que pueden ser menos afectados por el mecanismo de resistencia intrínseca o inducida por la quimioterapia [26]. lisosomas de células cancerosas contienen niveles de catepsinas aumentaron, y la liberación de estas enzimas en el citosol se considera que es la etapa de activación clave de la vía lisosomal la muerte [27]. No lisosomal cisteína proteasa dependiente de calcio (calpaína-2) se conoce como marcador de la muerte celular ER. Aproximadamente 50 micras de iones de calcio (Ca
2 +) se requiere para su actividad óptima en las células. expresión calpaína-2 se reducirá como consecuencia de la auto-degradación a partir de su activación. Las células cancerosas a menudo muestran evidencia de estrés ER constitutiva, posiblemente debido a la hipoxia y el agotamiento de la glucosa que conduce a la entrada de calcio en las células [26]. Varios fármacos anti-cáncer, incluyendo cisplatino [28] y los inhibidores del proteasoma [29], se ha demostrado para inducir estrés ER.
mayoría de los agentes citotóxicos desencadenar solamente la vía de las mitocondrias, sin embargo diversos agentes tales como paclitaxel [22] , camptotecina [30], estaurosporina [31, 32], también indujo la muerte celular independiente de caspasas mediada a través de la catepsina B /D y doxorrubicina a través de las calpaínas [33]. Por lo tanto la respuesta de muerte celular provocada por compuestos citotóxicos no sólo puede implicar caspasas pero proteasas de otros orgánulos que pueden actuar independientemente o en colaboración con otros. Por ejemplo se ha informado de una "cascada de calpaína-catepsina", en el que activan las calpaínas inducen liberación de las catepsinas y posterior muerte celular [34, 35].
Este estudio también demostró que DMDP-1 induce la autofagia, mientras DMDP- -2.