Extracto
El pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario sigue siendo pobre debido principalmente a la progresión del cáncer agresivo. Desde la transición epitelial-mesenquimal (EMT) es un mecanismo importante que media la invasión y la metástasis de las células cancerosas, la orientación del proceso de EMT con compuestos más eficaces y menos tóxicos para inhibir la metástasis es de gran valor terapéutico para el tratamiento de cáncer de ovario. Hemos encontrado por primera vez que la ginsenosides 20 (S) -Rg3, un componente farmacológicamente activo de la hierba china tradicional
Panax ginseng
, potentemente bloques EMT inducida por hipoxia de las células de cáncer de ovario
in vitro Opiniones y
in vivo
. Estudios mecanicistas confirman el modo de acción de 20 (S) -Rg3, lo que reduce la expresión de factor de 1α inducible por hipoxia (HIF-1α) mediante la activación de la vía de la ubiquitina-proteasoma para promover la degradación de HIF-1α. Una disminución de HIF-1α a su vez conduce a la regulación, a través de la supresión de la transcripción del caracol, del epitelio de células específicas de marcador de E-cadherina y la baja regulación de la específica de la célula mesenquimal vimentina marcador en condiciones de hipoxia. Es importante destacar que, 20 (S) -Rg3 inhibe eficazmente la EMT en modelos de xenoinjertos de ratón desnudo de cáncer de ovario, con la promesa de un nuevo agente terapéutico para el tratamiento contra el cáncer
Visto:. Liu T, L Zhao, Zhang Y, W Chen, Liu D, Hou H, et al. (2014) Ginsenosido 20 (S) -Rg3 Targets HIF-1α a Block hipoxia inducida por la transición epitelio-mesenquimal en células de cáncer ovárico. PLoS ONE 9 (9): e103887. doi: 10.1371 /journal.pone.0103887
Editor: José Najbauer, Universidad de la Escuela Médica de Pécs, Hungría
Recibido: Octubre 31, 2013; Aceptado: 4 Julio 2014; Publicado: 8 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30973429). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario, que existe predominantemente en la forma de cáncer de ovario epitelial (EOC), es la neoplasia ginecológica más letal [1], [2]. La baja tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer de ovario se asocia con su naturaleza viciosa de la invasión y la metástasis. Entre los colaboradores críticos a la capacidad invasiva y metastásica de las células de cáncer de ovario es la hipoxia del microambiente del tumor [3], [4], que media la invasión de células tumorales y la metástasis a través de la estabilización de la hipoxia-inducible factor-1 de alfa (HIF-1α) [5], [6].
En las células de normoxia, HIF-1α es hidroxilado por una familia de hidroxilasas prolina (PHD1-3) en Pro402 y Pro564, dando lugar a un cambio conformacional que promueve la unión de HIF-1α a la proteína de von Hippel Lindau (VHL) - un componente del gran complejo ubiquitina ligasa E3 que media la degradación proteasomal de HIF-1α [7], [8]. Bajo condiciones de hipoxia, niveles bajos de oxígeno se oponen a la hidroxilación de prolina, lo que conduce a la estabilización de HIF-1α y la posterior formación de un heterodímero con constitutivamente expresado HIF-1β. El bioactivo HIF-1 dímero regula, como un factor de transcripción, la expresión de una amplia gama de genes implicados no sólo en el ciclo celular, apoptosis [9], angiogénesis [10], [11] y el metabolismo de [12] en respuesta a la ambiente hipóxico, sino también en un proceso celular llamado transición epitelio-mesenquimal (EMT) [13] - [15]
identificó por primera vez en el desarrollo embrionario, la EMT ha encontrado más tarde para participar estrechamente en el proceso de. la invasión del cáncer y la metástasis [16], [17]. Durante la EMT células de proceso se someten a una transición de un fenotipo epitelial polarizada a un fenotipo mesenquimal [18], un evento biológico caracterizado por el cambio morfología de las células de una forma de adoquines a una forma fibroblastoide dispersa, la pérdida de marcadores de proteína específicos de células epiteliales y adquisición de propiedades específicas de las células mesenquimales, y el aumento de la motilidad celular y la invasión. Mientras que una variedad de factores, incluyendo factores de crecimiento y un microambiente hipóxico se demostró como inductores de EMT, muchos factores de transcripción tales como Snail se confirman como importantes mediadores de la EMT [19]. EMT suprime epitelial de células específicas de E-cadherina través de la acción de diversos mediadores, lo que lleva a la pérdida de apical-basal polaridad y célula-célula de unión de adhesión, y hasta regula mesenquimales de células específicas de la vimentina [20] lo que resulta en la reorganización del citoesqueleto y la motilidad celular mejora. Estos hechos constituyen los rasgos fundamentales de la EMT en el nivel molecular. De nota, EMT también está implicado en la resistencia a fármacos contra el cáncer y dificulta la intervención terapéutica eficaz de los cánceres en etapas avanzadas [21]. Obviamente, la orientación del proceso de EMT proporcionará una nueva idea para la terapia del cáncer, especialmente para el cáncer de ovario, un tumor que muestra un fuerte potencial de hacer metástasis.
Los ginsenósidos son los componentes farmacológicamente activos de
Panax ginseng
[22] que durante mucho tiempo ha sido utilizado como medicina tradicional china para los propósitos oficinales o de recuperación [23], [24]. Hasta la fecha, más de 40 compuestos ginsenoside se han identificado [25]. Algunos de ellos, Rg1, Rg3, Th1 y Rh2, por ejemplo, muestran la actividad contra el cáncer potente [24], [26] - [28]. Ginsenosides Rg3, unos extractos bioactivos de
Panax ginseng
, tiene varios efectos médicos, tales como anti-tumoral [29] - [32], anti-oxidantes, anti-inflamación [33], [34], la inhibición de la hiperplasia de la cicatriz de la piel [35] y la angiogénesis [36]. Además, los estereoisómeros 20 (R) -Rg3 y 20 (S) -Rg3 son dos moléculas quirales ópticamente activos que difieren en la orientación del grupo hidroxilo (OH) en el carbono-20 [24]. Aunque ambos se han reportado para inhibir la metástasis tumoral [30], estereoespecificidad de Rg3 parece estar vinculado a sus actividades biológicas. En este estudio, hemos descubierto por primera vez que el 20 (S) -Rg3 inhibe eficazmente EMT inducida por hipoxia de las células del cáncer de ovario humano no sólo
in vitro en
sino también en modelos de xenoinjertos de ratón desnudo, prometiendo una novela agente natural para la terapia contra el cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Drogas y anticuerpos
20 (S) -Rg3 y 20 (R) -Rg3 se obtuvieron de Tasly Pharmaceutical Company (Tianjin, china), y la pureza fue ≥99% según se determinó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). estereoisómeros RG3 se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) en una solución de 4 mg /ml y se almacenaron a -20 ° C. Se añadieron alícuotas de solución de reserva directamente a los medios de cultivo
Se utilizaron los siguientes anticuerpos:. anticuerpo de conejo para vimentina, BVS, anticuerpo de ratón de ß-actina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.), de conejo anticuerpo a E-cadherina (Bioworld Tecnología, Louis Park, MN, EE.UU.), anticuerpo de ratón a HIF-1α (Abcam Inc., Cambridge, MA, EE.UU.), anticuerpo de oveja a PHD1 (amp I +; D Systems Inc, Minneapolis, MN , EE.UU.), anticuerpo de conejo en Snail (Abnove, Taipei, china). peroxidasa de rábano picante (HRP) de inmunoglobulina conjugado de cabra anti-ratón (IgG), de cabra anti-IgG de ratón y conejo anti-IgG de oveja (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.), HRP-Polymer anti-ratón /conejo IHC Kit (Fuzhou Maixin biología Co. Ltd., Fouzhou, Fujian, china)
líneas celulares y cultivo
la línea celular de cáncer de ovario humano SKOV3 se obtuvo del Banco de células de Shanghai de la Academia china de Ciencias (Shanghai, China), 3AO se adquirió de la Academia de Shandong de Ciencias médicas (Jinan, China) .Cells se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino recién nacido (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) en condiciones de normoxia (21% O
2, 5% de CO
2, 37 ° C, 100% de humedad) durante 24 h antes de un tratamiento adicional. Para la inducción de la hipoxia, las células se incubaron en 1% de O
2, 5% de CO
2, 94% N
2, 37 ° C, 100% de humedad en una cámara de HF100 hipoxia (Heal Force, Hong Kong , china) para otro 24 h con o sin exposición a 80 mg /ml de 20 (S) -Rg3 (por SKOV3) o 160 g /ml de 20 (S) -Rg3 (por 3AO), o 80.160 o 320 mg /ml de 20 (R) -Rg3 (para células SKOV3 y 3AO).
viabilidad de las células de ensayo
Las células se sembraron a una densidad de 5.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos en 200 l de RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino recién nacido (NBS). se añadieron después de la incubación 24 h, las concentraciones de 20 (S) -Rg3 y 20 (R) -Rg3 creciente. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazolio bromuro se llevaron a cabo (MTT) ensayos después de 24 h y 48 h de tratamiento, respectivamente. 20 l de 5 mg /ml MTT se añadió en cada pocillo. Las células se incubaron entonces durante 4 horas a 37 ° C seguido de la adición de 150 l de DMSO. Los valores de absorción de longitud de onda de 570 nm se midió utilizando un lector de placas multimodo Enspire (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.). Todos los experimentos se realizaron por triplicado, y se repitieron tres veces.
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR)
ARN total fue extraído a partir de células cultivadas utilizando RNAfast 200 (Fastagen Biotech Co. Ltd. , Shanghai, china) según las instrucciones del fabricante. concentración de ARN y la pureza se determinaron en un espectrofotómetro UV (BioRad Inc., Hercules, CA, EE.UU.) mediante la relación de absorbancia 260 nm de absorbancia y 260/280 nm, respectivamente. la síntesis de ADNc se realizó utilizando RevertAid primer kit de síntesis de cDNA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones se realizaron a 25 ° C durante 5 min, seguido de 42 ° C durante 60 min y 70 ° C durante 5 min. Los ADNc fueron almacenadas a -80 ° C para su uso posterior. Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en un sistema en tiempo real PCR CFX-96 (Bio Rad, Hercules, CA, EE.UU.), utilizando SYBR Green Master Mix (Takara Biotecnología Co. Ltd., Dalian, China). Para la normalización, se utilizó el de genes β-actina. Las condiciones de ciclación fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 31 s. Cada medición se realizó por triplicado, y no hay en plantillas controles se incluyeron para cada ensayo. Después de la PCR, se realizó un análisis de la curva de disociación. la expresión génica relativa se calcula automáticamente utilizando el método 2
-ΔΔCt. Todos los cebadores de oligonucleótidos se diseñaron y sintetizaron por Shanghai Shenggong Biotecnológica Ltd (Shanghai, China). Se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores: HIF-1α-adelante, 5'-ATCCATGTGACCATGAGGAAATG-3 '; HIF-1α-inverso, 5'-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3 '; PHD1-adelante, 5'-AGGCTGTCGAAGCATTGGTG-3 '; PHD1- inversa, 5'-GGGATTGTCAACGTGCCTTAC-3 '; PHD2-adelante, 5'-AAGCCCAGTTTGCTGACATT-3 '; PHD2-inverso, 5'-TTACCGACCGAATCTGAAGG-3 '; PHD3-adelante, 5'-AGCCCATTTTTGCCAGACTCC-3 '; PHD3-inverso, 5'-GATTTCAGAGCACGGTCAGTC-3 '; BVS-adelante, 5'-GCAGGCGTCGAAGAGTACG-3 '; BVS-inversa, 5'-CGGACTGCGATTGCAGAAGA-3 '; Caracol-adelante, 5'-TCCAGAGTTTACCTTCCAGCA-3 '; Snail- inversa, 5'-CTTTCCCACTGTCCTCATCTG-3 '; β-actina hacia adelante, 5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3 '; β-actina inversa, 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3 '.
Western Blot
Total de extractos de proteínas celulares se prepararon por lisis de células en tampón RIPA en hielo. Las células se recogieron por raspado y se transfirieron a tubos de microcentrífuga. Las muestras se sometieron a ultrasonidos brevemente y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 30 min para eliminar los residuos insolubles. Se recogió el sobrenadante y se cuantificó usando el kit de ensayo de proteínas de inicio rápido de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las proteínas se hirvieron antes de ser separados por electroforesis en electroforesis de poliacrilamida de sodio dodecil sulfato de gel (SDS-PAGE) geles y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Pall Life Science, NY, EE.UU.), utilizando un dispositivo de mojado transmembrana (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ , ESTADOS UNIDOS). Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% a temperatura ambiente durante 1 hora, se sondaron durante la noche con anticuerpo primario (E-cadherina 1:500, vimentina 1:2000, β-actina 1:1000, HIF-1α 1:500, PHD1 1:2000, VHL 1:1000) en TBST, seguido de la incubación con peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) conjugado con anticuerpo secundario (de cabra anti-ratón /IgG de conejo 1:2000, conejo anti-IgG de oveja 1:1000) como se indica. Se utilizó el reactivo ECL (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) para desarrollar las manchas. Todos los valores se normalizaron a ß-actina.
cicatrización de heridas ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos 24 h antes del tratamiento. Las monocapas se rayan con una punta de pipeta de 200 l y se lavaron con medio sin suero para eliminar las células desprendidas. Las células se mantuvieron en medios sin suero bajo normoxia, hipoxia o hipoxia en presencia de 20 (S) -Rg3 durante 24 horas, respectivamente. Las áreas heridas fueron entonces con imagen formada tras la incubación durante un período indicado.
La migración de células de ensayo
Las células (1 × 10
5 /pocillo) en 100 l de medio sin suero se añadieron en millicells con tamaño de 8 micras de poro (Millipore Co., Bedford, MA, EE.UU.), insertados en los pocillos que contenían RPMI 1640 con suero bovino fetal al 20% como factor quimiotáctico. Después de 24 h de incubación, las células restantes en la superficie superior del filtro se retiraron con un hisopo de algodón y las células que migran se fijaron con dialdehído glutárico 5%, seguido por tinción con Giemsa para la cuantificación del número de células. Se contaron el número de células que migran en tres campos de alta potencia de las superficies inferiores de las membranas. Un mínimo de tres pozos fueron contados por experimento.
pequeños ARN de interferencia (siRNA) desmontables
Desmontables de PHD1 y BVS se realizaron mediante siRNAs específicos adquiridos de GenePharma Company (Shanghai, China). Secuencias de siRNAs son los siguientes: siPHD1-A, 5'-GCAUCACCUGUAUCUAUUATT-3 '; siPHD1-B, 5'-CCAACAUCGAGCCACUCUUTT-3 '; siPHD1-C, 5'-GCUAGCAUCAGGACAGAAATT-3 '; siVHL-A, 5'-CCACCCAAAUGUGCAGAAATT-3 '; siVHL-B, 5'-GUCUCAUUCUCAGAGUAAATT-3 '; siVHL-C, 5'-AACUGAAUUAUUUGUGCCAUCTT-3 '. Un siRNA revueltos (5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ') se utilizó en experimentos paralelos como control negativo. siRNAs fueron transfectadas a las células SKOV3 y 3AO a 40-50% de confluencia con el reactivo de transfección siRNA (Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. siRNAs eficaces fueron seleccionados de acuerdo con los resultados de tiempo real RT-PCR después de 48 h de incubación y mediante transferencia Western después de 72 h, respectivamente. A continuación, los siRNAs eficaces se transfectaron en las células y se incubaron durante 24 h seguido de inducción de la hipoxia con o sin 20 (S) tratamiento -Rg3 para otro 24 h. El efecto de la BVS PHD1 y silencio en la supresión de HIF-1α por 20 (S) -Rg3 se evaluó a nivel de proteína.
luciferasa reportero ensayo
Después de haber sido sembradas en placas de 24 pocillos durante 24 h, las células fueron transfectadas transitoriamente con e-cadherina promotor de luciferasa reportero plásmido pGL2Basic-e-cadK1 (Addgene, Cambridge, MA, EE.UU.) y el vector phRL-TK (Promega, Madison, WI, EE.UU.). 24 h más tarde, las células fueron tratadas con o sin 20 (S) -Rg3 en la configuración de hipoxia durante 24 h con células transfectadas normoxically cultivadas como control. El lisado celular se cosechó 24 h después y la actividad de luciferasa se midió con un luminómetro (Promega, Madison, WI, EE.UU.), utilizando el Sistema Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI, EE.UU.). la actividad de luciferasa E-cadherina se normalizó a la de la luciferasa de Renilla. Los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes y cada ensayo que contenía pocillos por triplicado.
Los estudios en animales
El cuidado y uso de animales de experimentación fueron aprobados por el comité de ética del Hospital Afiliado En primer lugar, y eran adherentes a las directrices institucionales y las normas éticas. Todos BALB /c hembras de ratones desnudos seis semanas fueron alojados en las instalaciones de barrera SPF bajo un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad. los pesos corporales de los animales y diámetros perpendiculares del tumor subcutáneo se registraron cada dos días. Los volúmenes tumorales se calculan de acuerdo con la fórmula V = 0.5236 x (L x W
2) (V: volumen del tumor, L: longitud, W: anchura).
Para el experimento xenoinjerto subcutáneo, células SKOV3 se tripsinizaron y se resuspendieron en PBS a una concentración final de 2 x 10
7 células /ml. Se inyectaron 2 x 10
6 células por vía subcutánea en el flanco de los ratones. 10 días después, los ratones desnudos fueron asignados aleatoriamente al grupo de tratamiento (n = 4) y grupo control (n = 4). Los ratones en estos dos grupos fueron tratados con inyecciones intravenosas de 5 mg /kg de 20 (S) -Rg3 o un volumen igual de PBS en la vena de la cola cada dos días a partir de entonces. Después de 30 días en los tratamientos experimentales, los ratones fueron sacrificados por CO
2 asfixia. Las muestras tumorales se recogieron y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 h a temperatura ambiente, embebido en parafina, y se seccionaron para el análisis inmunohistoquímico.
Para el modelo de xenoinjerto intraperitoneal, se tripsinizaron las células SKOV3 y se resuspendieron en PBS a una concentración de 1 × 10
8 /ml. Los ratones fueron inoculados con 1 x 10
7 células en la cavidad abdominal en el día 0. A partir de día 1, 5 mg /kg de 20 (S) -Rg3 (grupo de tratamiento, n = 7) o un volumen igual de PBS (control grupo, n = 7) se inyectó a través de la cola de la vena cada dos días. se observaron diariamente los ratones y se sacrificaron después de 30 días. Se realizaron necropsias, se resecaron los tumores diseminados de los ratones, y se recogió el líquido ascítico. El peso total del tumor y el volumen de líquido ascítico en cada ratón se midieron. Todos los contenidos del experimento con animales hemos informado aquí están de acuerdo con las directrices llegar.
La inmunohistoquímica
diapositivas histológicos fueron preparados a partir de los bloques de tejido de cáncer de ovario incluidos en parafina. Los especímenes fueron desparafinados en xileno, se rehidrataron en una serie alcohol descendente seguido de calefacción en tampón 0,01 M de citrato (pH 6,0) en un vapor durante 1,5 minutos para recuperar los sitios de unión antigénicos. La detección de los antígenos se realizó mediante incubación con los anticuerpos primarios (E-cadherina 1:200, vimentina 1:400, HIF-1α 1:200), durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de incubación con anticuerpo secundario marcado con HRP ( Maxvision HRP-Polymer anti-ratón /conejo IHC Kit, 1:200) a temperatura ambiente durante 30 minutos y el desarrollo del color con DAB. muestras de control negativo se incubaron en PBS sin el anticuerpo primario en las mismas condiciones. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina, se deshidrataron en una serie ascendente de alcohol, y montado para su análisis. Las imágenes digitales fueron adquiridas en una Olympus BH-2 microscopio (Tokio, Japón) instalado con el software de la cámara DeltaPix y (Maalov, Dinamarca).
El análisis estadístico
Las diferencias estadísticas fueron determinadas por dos de cola
t-test o
Wilcoxon la suma de rangos (sólo para el volumen de ascitis). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (Chicago, IL, EE.UU.). Las diferencias se consideraron significativas (*) a
P Hotel & lt; 0,05 y altamente significativas (**) a
P
. & Lt; 0,01 para todas las comparaciones
Resultados
20 (S) -Rg3, pero no 20 (R) -Rg3, bloques de la hipoxia inducida por EMT en SKOV3 y células de cáncer ovárico 3AO
primero examinamos el efecto de 20 (S) y -Rg3 20 (R) -Rg3 sobre la viabilidad celular de las dos líneas celulares de cáncer de ovario humano SKOV3 y 3AO en una serie de ensayos de MTT. Las estructuras de 20 (S) -Rg3 y 20 (R) -Rg3 se muestran en la Figura S1-A. 20 (S) -Rg3 inhibió el crecimiento celular de una manera dependiente de la dosis, dando lugar a IC
50 (concentración inhibidora en la que la viabilidad celular 50% se inhibe) valores de 146,8 y 242,6 g /ml, respectivamente, para SKOV3 y células 3AO 24 h (o 48 h) después del tratamiento (Figura S1-B.). Por el contrario, 20 (R) -Rg3 no mostraron inhibición aparente de la proliferación de ambos tipos de células a concentraciones de hasta 640 g /ml (Figura S1 AC).
A continuación examinó la capacidad de 20 (S) -Rg3 y 20 (R) -Rg3 para influir EMT inducida por hipoxia. Como se muestra en la Fig. 1A, cuando se expone a 1% O
2 durante 24 horas tanto en las células SKOV3 y 3AO EMT se sometieron caracteriza por un cambio morfología de las células de la apariencia tight-junction adoquines similar a una forma disociada de huso similares. Este cambio fue acompañado por una baja regulación significativa del marcador epitelial E-cadherina y una marcada regulación de la vimentina marcador mesenquimal según lo revelado por Western blot (Fig. 1B). El tratamiento de células SKOV3 y 3AO con 20 (S) -Rg3 en 80 mg /ml, 160 g /ml, respectivamente, evita eficazmente el cambio morfológico asociado con la hipoxia inducida por EMT (Fig. 1A), en consonancia con un nivel elevado de E -cadherin y un nivel reducido de vimentina en condiciones de hipoxia (Fig. 1B). En contraste, el tratamiento de SKOV3 con 20 (R) -Rg3 a 80 mg /ml y 160 g /ml, respectivamente, no para rescatar las células de someterse a EMT (Fig. 1A), como se evidencia por los niveles sin cambios de E-cadherina y vimentina bajo condiciones de cultivo hipóxicas (Fig. 1C). A fin de verificar que el 20 (S) -Rg3 bloqueado EMT inducida por hipoxia, la movilidad celular se evaluó en la cicatrización de heridas y
in vitro
ensayos de migración en. Como se muestra en la Fig. 2A y B, mientras que la hipoxia promueve claramente la movilidad celular y cierre de la herida, estos efectos fueron contrarrestados en gran medida por el tratamiento de las células SKOV3 y 3AO con 20 (S) -Rg3.
Las células (A) fueron primero cultivadas en común condición para 24 h. Para la inducción de la hipoxia in vitro, las células SKOV3 y 3AO se incubaron en una cámara de hipoxia de 1% O
2, 5% de CO
2 y 94% N
2 para otro 24 h sin (hipoxia) o con Rg3 (hipoxia + RG3) a la concentración indicada por 24 h. Los controles se cultivaron en condiciones de normoxia (normoxia) durante 24 h. imágenes de células fueron capturados utilizando un microscopio de contraste de fase (100 ×). (B) Las proteínas de las células expuestas a normoxia, hipoxia e hipoxia plus 20 (S) -Rg3 se cosecharon, y la expresión de E-cadherina y vimentina se examinaron mediante transferencia Western, utilizando β-actina como control de carga. disminución hipoxia proteína E-cadherina y aumentar la proteína vimentina, que fue revertido por 20 (S) -Rg3 co-tratamiento. (C) El efecto de 20 (R) -Rg3 sobre la expresión de marcadores de EMT en las células SKOV3. No se observó efecto de 20 (R) -Rg3 sobre la expresión de marcadores de EMT hipoxia inducida. Todos los tratamientos en esta figura se llevaron a cabo por triplicado.
(A) la movilidad de la célula detectado por el ensayo de curación de la herida. Las células se incubaron en condiciones de normoxia durante 24 h seguido por el rascado de la capa de células confluente y exponiendo a normoxia, hipoxia o hipoxia además de 20 (S) -Rg3 durante otras 24 h, respectivamente. El cierre del arañazo se controló durante 24 h, y se mostraron fotografías a las 0 h y 24 h después del rascado. movilidad (B) de la célula examinada por
in vitro
ensayo de migración. Normoxically células cultivadas fueron sembradas en millicells, seguido de incubación durante 24 h bajo normoxia, hipoxia o hipoxia además de 20 (S) -Rg3, respectivamente. El número de células que pasaron a través de la membrana por cada 20 × lente magnificado se contaron y se utiliza para representar la capacidad de migración de las células. Todos los tratamientos en esta figura se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se muestran como los medios ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01,
t-test
En conjunto, nuestros resultados fuertemente. indican que 20 (S) -Rg3, pero no 20 (R) -Rg3, es capaz de revertir cambios EMT hipoxia inducida en la morfología celular, marcadores de células, y la movilidad celular, lo que subraya su función potencial como inhibidor de la EMT inducida por hipoxia y EMT mediada la metástasis del cáncer.
20 (S) -Rg3 reduce la expresión de HIF-1α a través de la promoción de la degradación de la proteína HIF-1α en un PHD1 /BVS /proteasoma manera dependiente
Para entender mejor la los mecanismos moleculares por los cuales 20 (S) bloquea -Rg3 EMT inducida por hipoxia en las células de cáncer de ovario, analizamos la expresión de HIF-1α, un regulador crucial de la EMT, tanto a nivel de transcripción y traducción. Cuando se cultivan en presencia de 1% de O
2 durante 24 horas el nivel de proteína HIF-1α fue elevada en las células SKOV3 y 3AO, mientras que el nivel de ARNm de HIF-1α apenas se ve afectado. El tratamiento de las células con 20 (S) -Rg3 en la configuración de hipoxia por lo demás idénticas marcadamente suprimida la expresión de HIF-1α a nivel de proteínas con el nivel de mRNA sin cambios, lo que indica que HIF-1α era regulada por 20 (S) -Rg3 (post-transcriptionally Fig. 3A y B)
.
(a) ARN total de las células expuestas a normoxia, hipoxia o hipoxia además de 20 (S) -Rg3, respectivamente, para se extrajeron 24 h. se llevaron a cabo en tiempo real ensayos de RT-PCR para analizar el efecto de 20 (S) -Rg3 en el nivel de ARNm de HIF-1α, y no se detectaron cambios. (B) Las células cultivadas durante 24 h bajo normoxia, hipoxia o hipoxia más 20 (S) -Rg3, respectivamente, fueron supervisados por Western blot para la expresión de HIF-1α. 20 (S) -Rg3 interferido con el aumento de HIF-1α inducida por hipoxia. (C) MG132 bloquea el efecto de inhibición de 20 (S) -Rg3 en el nivel de proteína HIF-1α. los niveles de proteína HIF-1α se compararon entre las células hipóxicas, células hipóxicas co-tratados con 20 (S) -Rg3, y las células pretratadas con 20 M MG132 durante 30 minutos seguido de exposición a la hipoxia y 20 (S) -Rg3 para 24 h. (D) Las células expuestas a normoxia, hipoxia e hipoxia en presencia de 20 (S) -Rg3, respectivamente, fueron evaluados por PCR en tiempo real para la transcripción de PHD1, PHD2, PHD3 y VHL. Después de 20 (S) de tratamiento -Rg3, la transcripción de genes pHD1 y VHL, que se redujo en condiciones de hipoxia, se incrementaron tanto en las células SKOV3 y 3AO. (E) Los extractos de proteínas de las células tratadas fueron examinados por Western blot para la expresión de PHD1 y BVS, con la proteína de las células cultivadas normoxically como el control y β-actina como control de carga. PHD1 y BVS se redujo en las células hipóxicas. 20 (S) -Rg3 recuperaron su expresión bajo condiciones de hipoxia. Todos los tratamientos en esta figura se llevaron a cabo por triplicado y los resultados se muestran como los medios ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01,
t-test
Dado que la reducción de la proteína HIF-1α estaba estrechamente relacionado con la degradación de proteínas a través de la vía ubiquitina-proteasoma, los inhibidores de la proteasa 26S-proteasoma MG132 específica se utilizó para investigar si 20 (S) -Rg3 promovió la degradación proteasomal de HIF-1α. Como se muestra en la Fig. 3C, el pretratamiento de 20 M de MG132 durante 30 minutos en condiciones de hipoxia restaurado proteína HIF-1α en las células SKOV3 y 3AO tratados con 20 (S) -Rg3, lo que demuestra que 20 (S) -Rg3 las reguladas HIF-1α en el proteasoma -dependiente. Como miembros de la familia PHD y la proteína VHL son factores que median la ubiquitina /degradación de HIF-1α proteasoma dependiente, el efecto de la 20 (S) -Rg3 en los niveles de mRNA de PHD1, PHD2, PHD3 y BVS conocidos fue examinado más a fondo. -PCR en tiempo real los datos mostraron que la hipoxia consistentemente las reguladas PHD1, PHD3 y BVS (Fig. 3D). Este efecto de la hipoxia, especialmente en PHD1 y VHL, sin embargo, se invirtió por 20 (S) -Rg3 tanto en las células SKOV3 y 3AO. Como era de esperar, pHD1 y BVS niveles de proteína fueron restaurados en gran medida, como fue el caso para el ARNm, después del tratamiento de las células SKOV3 y 3AO con 20 (S) -Rg3 para contrarrestar la hipoxia mediada baja regulación de PHD1 y proteínas BVS (Fig. 3E).
para aclarar aún más el papel de los PHD1 y la BVS en la mediación de la actividad de 20 (S) -Rg3 con respecto a la degradación de HIF-1α, SKOV3 y 3AO fueron transducidas con siRNA-PHD1 (siPHD1) o siRNA-BVS (siVHL). Basándose en la PCR en tiempo real y de transferencia Western, se seleccionaron dos siRNA más eficaz para silenciar PHD1 (siPHD1-A y siPHD1-B) y VHL (siVHL-B y siVHL-C), respectivamente (Figura S2), seguido por la estimulación de la hipoxia y la 20 (S) de tratamiento -Rg3. Según se determinó por Western blot, knock-down de PHD1 o BVS inhibe el efecto de la degradación pro-20 (S) -Rg3 de HIF-1α (Fig. 4A y B), con el efecto de siPHD1 más significativa que la de siVHL de HIF -1α recuperación de proteínas. En conjunto, estos resultados sugieren que la 20 (S) -Rg3 bloqueado EMT inducida por hipoxia de las células de cáncer de ovario mediante la activación de la vía de la ubiquitina /proteasoma PHD1- BVS-para facilitar la degradación de HIF-1α.
Efecto de PHD1 ( a) y la BVS (B) el silencio, el 20 (S) -Rg3 suprimido-HIF-1α. células SKOV3 y 3AO fueron transfectadas transitoriamente durante 24 h con o siPHD1 siVHL, seguido de incubación en condiciones de hipoxia durante otras 24 h. El nivel de proteína de PHD1, VHL y HIF-1α Después se detectó mediante Western blot. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
20 (S) -Rg3 suprime la hipoxia inducida por la represión transcripcional de la E-cadherina a través de la supresión de caracol
Durante el proceso de EMT, E-cadherina se suprime comúnmente por sus represores de la transcripción incluyendo caracol que a su vez está transcripcionalmente activa por HIF-1. Para entender mejor la forma (S) -Rg3 impedido inducida por hipoxia 20 baja regulación de la E-cadherina, se investigó el efecto de la 20 (S) -Rg3 en Caracol. Inversa de transcripción resultados de PCR mostraron que la hipoxia provocó un aumento drástico de Snail ARNm, que aparentemente estaba inhibida por 20 (S) -Rg3 (Fig. 5A). En consecuencia, la sobre regulación de la proteína Snail estimulada por la hipoxia fue severamente atenuada por 20 (S) de tratamiento -Rg3 (Fig. 5B).
P>
2 (normoxia) o 1% o
2 (hipoxia) o 1% o
2 y 80 mg /ml 20 (S) -Rg3 (hipoxia + 20 (S) -Rg3) durante otras 24 h. Snail ARNm se determinó mediante RT-PCR con β-actina como un control interno, y estandarizada con el nivel presente en las células cultivadas normoxically. La expresión de Snail se incrementó a nivel de ARNm en las células SKOV3 después de la estimulación hipoxia durante 24 h. 20 (S) de tratamiento -Rg3 abrogada Snail upregulation causada por la hipoxia. (B) Los extractos celulares se sometieron a análisis de inmunotransferencia para detectar el nivel de proteína Snail, y β-actina se utilizó como control de carga. Bajo nivel de proteína Snail se detectó en las células cultivadas normoxically, mientras que la proteína Snail se aumenta en las células hipóxicas. 20 (S) -Rg3 reduce la expresión de Snail inducida por hipoxia. (C) Ensayo de la luciferasa en las células SKOV3 y 3AO. la actividad del promotor de E-cadherina se redujo significativamente en las células hipóxicas. La disminución en la actividad del promotor de la E-cadherina se invirtieron en un 20 (S) -Rg3 co-tratamiento. Actividad del promotor de E-cadherina luciérnaga constructos de luciferasa se normalizó a la de un cotransfected
Renilla
constructo de luciferasa. Todos los tratamientos en esta figura se llevaron a cabo por triplicado, y los valores se presentan como la media ± SD de tres experimentos. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, por
t-test
Para investigar más a fondo si la represión. de Snail por 20 (S) -Rg3 era responsable de la recuperación de la E-cadherina en condiciones de hipoxia, un ensayo doble-reportero de luciferasa se llevó a cabo. Un E-cadherina-promotor de luciferasa constructo informador y un vector de control interno capaz de expresar luciferasa de Renilla se co-transfectaron en células. La hipoxia se encontró para hacer que la pérdida de casi 50% de la intensidad de la señal de luciferasa tanto en las células SKOV3 y 3AO, mientras que 20 (S) -Rg3 suprime los efectos de hipoxia y causó un aumento significativo en la intensidad de la luciferasa (Fig. 5C). Estos resultados demostraron que el 20 (S) -Rg3 bloqueó la inhibición de la actividad promotora hipóxico E-cadherina.
20 (S) -Rg3 inhibe el crecimiento del cáncer de ovario y EMT
in vivo
< Como se muestra en la Fig.