Extracto
biomarcadores sensibles y específicos de la inhibición de la proteína quinasa se puede aprovechar para acelerar los estudios de desarrollo de fármacos en oncología mediante la asociación de respuestas moleculares tempranos con la inhibición de destino. En este estudio, hemos utilizado la proteómica escopeta imparciales fosfotirosina (PY) para descubrir nuevos biomarcadores de respuesta a dasatinib, un pequeño inhibidor de Src selectivo molécula, en modelos preclínicos de cáncer colorrectal (CCR). Se realizó la espectrometría de proteómica escopeta pY masa imparciales para revelar el proteoma pY de HCT-116 células de carcinoma de colon cultivadas, y luego se extendió este análisis para xenoinjertos de tumores HCT-116 para identificar biomarcadores pY de dasatinib-respuesta in vivo. Los principales sitios de pY dasatinib sensible en los tumores de xenoinjertos incluyen sitios en de tipo delta proteína quinasa C (PKC), proteína que contiene CUB-dominio-1 (CDCP1), Tipo-II SH2-dominio que contienen inositol 5-fosfatasa (SHIP2), y receptor de la proteína tirosina fosfatasa-alfa (RPTPα). El sitio de pY313 PKC fue apoyado además como un biomarcador relevante de la inhibición de Src mediada por dasatinib en HCT-116 xenoinjertos mediante técnicas de inmunohistoquímica e inmunotransferencia con un anticuerpo phosphospecific. Reducción de la PKC pY313 se correlacionó más con la inhibición mediada por dasatinib-de Src y disminuyó el crecimiento como esferoides de un panel de líneas celulares de CRC humanos. Estos estudios revelan PKC pY313 como una lectura prometedor de la inhibición de Src en CRC y, potencialmente, otros tumores sólidos y pueden reflejar la capacidad de respuesta a dasatinib en un subconjunto de cánceres colorrectales
Visto:. McKinley ET, Liu H, McDonald WH, Luo W, Zhao P, Coffey RJ, et al. (2013) Global fosfotirosina Proteómica Identifica PKC como marcador de respuesta a la inhibición de Src en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (11): e80207. doi: 10.1371 /journal.pone.0080207
Editor: Laszlo Buday, Academia de Ciencias de Hungría, Hungría
Recibido: 19 Julio, 2013; Aceptado: 30 de septiembre de 2013; Publicado: 8 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 McKinley et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos estudios fueron apoyados por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer: R25 CA136440, P50-951903; R01-CA140628; K25-CA127349; RC1-CA145138; R01-CA46413; y la Fundación Kleberg. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
fosforilación de la tirosina es un mecanismo de señalización clave que regula los aspectos centrales de comportamiento de las células de mamífero incluyendo la proliferación, motilidad, el metabolismo, y la diferenciación [1]. Las proteínas tirosina quinasas se reconocieron primero como productos de oncogenes virales incluyendo v-src y v-abl, y como receptores de factores de crecimiento incluyendo EGF. la señalización aberrante por muchos de los noventa tirosina quinasas convencionales codificadas por el genoma humano se ha relacionado con los procesos de enfermedad, incluyendo el desarrollo y propagación del cáncer [1,2].
La terapia dirigida con inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs) es una modalidad cada vez más amplia que permite el tratamiento personalizado del cáncer [3,4]. ejemplos Punto de referencia incluyen la pequeña imatinib inhibidor de molécula que trata con eficacia la leucemia mielógena crónica impulsado por el BCR-ABL oncogénica [5,6], así como terapias para inhibir la mutante BRAF en los cánceres tales como melanoma [7,8]. Pequeño TKIs molécula y anticuerpos monoclonales neutralizantes que se dirigen al receptor de EGF (EGFR) y /o la erbB2 estrechamente relacionados (HER2 /neu) han tenido éxito en el tratamiento de carcinoma de pulmón de células no pequeñas y carcinoma de mama [9,10].
En el carcinoma colorrectal (CCR), una gran mayoría de los casos muestran elevada actividad de la familia Src quinasas de tirosina nonreceptor [11,12], que aumentan progresivamente en la actividad como tumores progresan a enfermedad metastásica [13]. actividad Src aberrante puede contribuir a la malignidad por el impacto de múltiples sistemas de receptores incluyendo uniones mediada por cadherina célula-célula, adherencias célula-ECM integrina mediada, y complejos de los receptores activados incluyendo EGFR [14 a 16]. Src actividad elevada en CRC predice mal pronóstico clínico [17]. En consecuencia, ha habido un considerable interés en Src como una diana terapéutica en el CCR y otros tipos de cáncer [18-21]. El dasatinib, el inhibidor de Src selectivo clínicamente más estudiado, es un agente citostático eficaz para inhibir el crecimiento tumoral, invasión y metástasis [22]. Además de las quinasas de la familia Src, dasatinib inhibe de forma potente BCR-ABL y recientemente ha demostrado ser superior a imatinib como tratamiento para la leucemia mielógena crónica [23].
En la evaluación de los ITC dirigidos en oncología clínica, existe la necesidad de identificar biomarcadores relevantes que pueden ser utilizados para guiar la selección de la dosis en desarrollo preclínico y para controlar la actividad anti-tumoral en ensayos clínicos. Los biomarcadores también pueden ser de utilidad para predecir si un paciente es probable que se beneficien de un tratamiento particular. Varios estudios han utilizado diversos enfoques en un intento de identificar tales marcadores [24-26]. Racionalmente, tales biomarcadores también podrían ser sitios de tirosina específicos que son fosforilados por la quinasa (s) que se inhibe. Por lo tanto, es de interés para caracterizar las vías de señalización de la tirosina quinasa que operan en las células tumorales. Fosforilación de la tirosina en las células tumorales se puede perfilar sistemática y exhaustiva utilizando la espectrometría de masas para analizar péptidos enriquecidos para fosfotirosina (PY) por inmunoafinidad [27]. Hemos aplicado anteriormente este enfoque de la proteómica escopeta imparcial para obtener un análisis en profundidad de la fosforilación de la tirosina en fibroblastos de ratón normal frente a transformadas-Src, caracterizando así el impacto global de la Src oncogénico [28]. tirosina quinasas en otra aplicación de este enfoque, Py señalización en una gran muestra de líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas y tumores sólidos reveló activa [29].
Los objetivos del presente estudio fueron el uso de escopeta Py proteómica para obtener una visión global de la fosforilación de la tirosina en el colon humano línea celular de adenocarcinoma HCT-116 conocido, y para extender el análisis a los xenoinjertos de tumores HCT-116 tratados con dasatinib para identificar biomarcadores pY dasatinib sensible. Se identificaron los sitios pY en proteínas de señalización, incluyendo PKC CDCP1 y RPTPα como los principales sitios de dasatinib-que responda a los xenoinjertos de tumores HCT-116 que pueden ser útiles como biomarcadores predictivos de la inhibición de SRC. Por último, utilizando cultivos de esferoides establecidas a partir de un número de líneas celulares de CRC humanos, se observó una correlación entre la inhibición datatinib mediada de la proliferación y reducción de la PKC pY313. Nuestros resultados revelan PKC pY313 como biomarcador candidato para predecir la respuesta a dasatinib en el CCR.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamiento de drogas
HCT-116 (ATCC CCL 247), Caco-2 (ATCC HTB37), Colo205 (ATCC CCL-222), DKO-1, DLD-1 (ATCC CCL-221) se obtuvieron de ATCC y las células Lim1215 [30] se obtuvieron de Robert Whitehead, Ludwig Institute para la Investigación del cáncer. Las líneas celulares de CRC humanos se mantuvieron como un cultivo en monocapa en subconfluent densidad en un 5% de CO
2, 37 ° C ambiente. El medio de crecimiento consistió en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM; Mediatech) para todas las líneas celulares excepto Colo205 que se cultivan en RPMI (Cellgro). El medio de crecimiento se complementó con 10% de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals), 1% de antibióticos antimicóticos (Mediatech), y 100 mM aminoácidos no esenciales (Gibco-Invitrogen). Todas las células se pasaron usando 0,25% de EDTA-tripsina (Gibco).
El dasatinib (BMS-354825) fue proporcionado amablemente por Richard Smykla de Bristol-Myers Squibb Oncología (Princeton, Nueva Jersey). El dasatinib se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) en una solución madre 10 mM. HCT-116, Caco-2, Colo205, DKO-1, y las células DLD-1 se trataron con concentraciones crecientes dasatinib (0, 10, 100, 1000, 5000 nM) durante 24 h. Al final del tratamiento, el medio de cultivo se retiró y las células se recogieron para su análisis.
Modelo animal
Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal. HCT-116 se generaron xenoinjertos en ratones desnudos atímicos (Harlan Sprague Dawley) después de la inyección subcutánea de 2-4 × 10
6 células. Se detectaron tumores palpables dentro de 2 a 4 semanas. El dasatinib se reconstituyó en DMSO. Inmediatamente antes del tratamiento, se añadió solución salina estéril nueve partes de la solución de fármaco. los ratones portadores del tumor (0,5-1 cm dimensión más larga) se administraron 100 l dasatinib (60 mg /kg) o vehículo /solución salina DMSO por sonda oral. Los animales recibieron una dosis única o trataron diariamente durante 5 días consecutivos. Para cada régimen de tratamiento, cohortes de animales fueron sacrificados y los tumores fueron extirpados 4 h y 24 h después de la administración de fármaco final.
Preparación de las muestras de péptidos de fosfotirosina enriquecida
Los péptidos trípticos enriquecido en fosfotirosina eran preparado a partir de HCT-116 cultivos en monocapa de crecimiento exponencial (en torno al 70% de confluencia) y desde HCT-116 xenoinjertos de tumores. La lisis celular, la digestión de proteínas, y el enriquecimiento de inmunoafinidad para PY-que contienen péptidos trípticos se logró utilizando el kit de PhosphoScan (P-Tyr-100; Cell Signaling Technology) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para las células cultivadas, cada ronda de análisis se realizó utilizando la proteína celular total 60 mg (obtenido de ocho platos 150 mm). La concentración de proteína se determinó usando BCA (Thermo Scientific), con albúmina de suero bovino (BSA; Sigma) como un estándar. lisados tumorales se prepararon por homogeneización en hielo para dispersar el tejido congelado (400 mg de peso en húmedo de aproximadamente tumor en 9 ml de tampón de lisis PhosphoScan), seguido de breve sonicación y centrifugación (20.000 x
g
de 15 min) para el material insoluble clara. lisados tumorales aclarados que contienen aproximadamente 40 mg de proteína (tal como se determinó por el ensayo BCA) se utilizaron en el análisis. Los péptidos trípticos fueron generados por el tratamiento de los lisados durante la noche a 25 ° C con tripsina TPCK (60: 1 de proteína celular: tripsina).
La espectrometría de masas
LC-MS /MS análisis de los péptidos se realizó con un instrumento /Orbitrap trampa de iones híbridos lineal (LTQ-Orbitrap, Thermo-Fisher) equipado con un Eksigent nanoLC-AS1 muestreador automático, Eksigent nanoLC-1D, más bomba de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Eksigent), fuente de nano-electrospray, y el software de control de instrumentos Xcalibur. Los péptidos se separaron en una columna capilar de sílice fundida (100 m × 18 cm) rellena con resina de fase inversa (Júpiter C18, 3 m, 300 A; Phenomenex), y junto con un filtro en línea, sinterizado (generado con silicato líquido Kasil) atrapando columna (100 micras × 4 cm) también lleno de resina C18 (Jupiter C18, 5 m, 300 Å, Phenomenex) [31]. Se empleó gradiente bifásico de elución cromatográfica por el que la fase móvil A consistía en ácido fórmico 0,1% y la fase móvil B consistía en ácido fórmico 0,1% en acetonitrilo. La velocidad de flujo durante la fase de carga y la desalinización del gradiente fue de 1,5 l /min y durante la fase de separación fue 500 nL /min. Un gradiente de 184 min se llevó a cabo con un período de lavado de 10 min desviada a los residuos después de la pre-columna (disolvente A 100% para el primero 10 min seguido de un gradiente a 98% de disolvente A, v /v, a 15 min) para permitir la eliminación de cualquier sal residual. Tras el período de lavado, el gradiente se aumentó a 35% de B por 125 min, seguido de un aumento de 90% de B por 140 min y se mantiene durante 9 min antes de volver a las condiciones iniciales. Tandem espectros fueron adquiridos utilizando un modo de escaneo dependiente de los datos en el que se adquirió un análisis completo de MS (m /z 300-2000) en el Orbitrap a una resolución de 60.000. El tiempo máximo de inyección fue de 1 s. dependientes exploraciones de MS /MS Los datos fueron adquiridos para los cinco iones más intensos de la exploración completa utilizando una anchura de aislamiento de 2 m /z, un tiempo de activación de 30 ms, una energía de colisión normalizada 30%, y un tiempo de inyección máxima de 150 ms .
Para mejorar la detección de fosfopéptidos, un algoritmo dependiente de los datos adicionales en el software Xcalibur se habilitó en el que la presencia de una pérdida neutra de fosfato predominante (97.97, 48.99, 32.66 y m /z unidades) daría lugar a la adquisición de un MS /MS /MS [32]. Para permitir la recogida de espectros MS /MS de péptidos de abundancia inferiores, ex iones de destino seleccionados para MS /MS fueron excluidos de forma dinámica con una longitud de la lista de 150 iones y un tiempo de 60 s. "Precursor de la selección monoisotopic" fue habilitado y estados de carga de 1+ y & gt; 4+ fueron excluidos de la consideración para MS /MS. El instrumento fue operado en el modo de vista previa para permitir la recolección simultánea de espectros MS /MS durante la exploración Orbitrap. Condiciones generales de espectrometría de masas fueron los siguientes: tensión de pulverización, 2,2 kV; no vaina y el flujo de gas auxiliar; ión temperatura del tubo de transferencia, 200 ° C; y la lente del tubo de tensión 80 V.
búsqueda de base de datos, filtrado, y falsos descubrimiento determinación del tipo de
Los métodos eran similares a las estrategias de base de datos en busca descrito previamente [28], con modificaciones menores. Thermo archivos RAW se transformaron en archivos DTA utilizando el algoritmo de ScanSifter (Universidad de Vanderbilt), luego se buscaba con TurboSEQUEST v.27 (rev. 12) algoritmo (Thermo Electron) contra el ratón /humano subconjunto de la base de datos UniRef100, que se invirtió para calcular la tasa de falsos descubrimiento. Las búsquedas se realizaron permitiendo que las siguientes modificaciones diferenciales: 57 en cisteína (por carboxyimidomethylation de yodoacetamida), 16 en metionina (oxidación), y 80 en Ser, Thr o Tyr (fosforilación). El /MS /MS Los espectros de MS También se realizaron búsquedas para un desplazamiento de masa -18 en Ser, Thr, Tyr o para tener en cuenta la pérdida de agua, que resulta de la pérdida neutra de ácido fosfórico. tolerancias péptido y de iones fragmento se establecieron a 2,5 Da y 1,0 Da, respectivamente.
tasa de falso descubrimiento fue entonces estimada a partir de péptido partidos a las secuencias inversas multiplicado por dos y dividido por el número total de accesos de péptidos. Los péptidos obtenidos de los algoritmos de búsqueda de base de datos con la tasa de falsos descubrimiento 5% se filtraron adicionalmente mediante tres pasos adicionales. En primer lugar, el umbral de puntuación se establece en función de la categoría de péptidos. Para la carga 1 péptidos, los péptidos se eligieron con Xcorr mayor que o igual a 1, RSP menos de o igual a 5, y Sp mayor que o igual a 350; Para la carga 2 péptidos, el umbral se fijó en 1,8 Xcorr, RSP 5 y SP 350; Para la carga 3 péptidos, el umbral se fijó en 2,5 Xcorr, RSP 5 y SP 350. En segundo lugar, se retuvieron sólo los péptidos con al menos una tirosina y una fosforilación. Por último, de los éxitos de péptidos restantes, solamente pTyr que contiene péptidos con al menos uno de los tres criterios adicionales fueron retenidos: (1) al menos dos espectros a juego tuvo valores XCorr encima de umbral alto (3,3 para la carga de 3, 2,2 para la carga de 2 y 1.5 para la carga de 1), (2) el sitio pTyr se identificó de forma independiente a partir de dos o más distintos péptidos, o (3) el sitio pTyr había sido identificado independientemente en otra parte y se incluye en el recurso en línea phosphosite de
in vivo sitios de fosforilación
, versión 1.5 (http://www.phosphosite.org), mantenido por Cell Signaling Technology, Inc.
Todos los datos de espectrometría de masas originales de los experimentos tumorales xenógrafo se ha hecho disponible para el público a través el Coro de recursos en línea de datos de espectrometría de masas (https://chorusproject.org/). Con una cuenta de usuario Coro, cualquier subconjunto de estos datos en bruto se puede descargar o ver en línea. Por otra parte, estos datos pueden ser descargados directamente como un archivo de 2,8 GB y sin registrarse en:. Https://chorusproject.org/anonymous/download/experiment/-2997969850554343767)
Los anticuerpos y inmunotransferencia
Las muestras de células se recogieron después de 24 h de exposición a dasatinib. muestras de tumores de xenoinjertos se recogieron 4 h o 24 h después de la última administración de dasatinib. Los tumores se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, a continuación, se homogeneiza y se diluyó a 1 g /l en tampón de lisis. Entre 20 y 40 g de proteína total de cada muestra se cargó en 7,5-12% en geles de SDS PAGE y se resolvieron por electroforesis antes de la transferencia a membranas de PVDF (PerkinElmer). Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 ° C en tampón Tris-solución salina tamponada 0,1% de Tween-20 (TBST) que contiene 5% w /v de leche en polvo seca no grasa. Posteriormente, las membranas se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos frente a p-Src Y416 (Señalización Celular#6943S), el total de Src (Señalización Celular#2107), p-PKC Y313 (Señalización Celular#2055S), el total de la PKC (Señalización Celular#2058), p- RPTP Y789 (Señalización celular#4481S), RPTP totales (Upstate#07-472), β-actina (Señalización celular#4967), y β-tubulina (Señalización celular#2128). Palpación ocurrido durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos diluidos como se sugiere por los proveedores en TBST con albúmina de suero bovino 3% (BSA), seguido por incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa de especies apropiadas (Jackson ImmunoReserach) diluido 1: 5000 en TBST que contiene 3% de BSA. Western Rayo
TM Plus-ECL (PerkinElmer) sustrato se utilizó para la detección de una densitometría Xenogen IVIS 200. Se llevó a cabo utilizando el software Image Living 3.2 (calibrador).
esferoide análisis de crecimiento
imágenes microscópicas de serie de esferoides celulares a partir de 0, 24, 48 y 72 h post-tratamiento con dasatinib se importaron en el paquete de software ImageJ (NIH). Las imágenes se convierten automáticamente en binario y agujeros en la imagen binaria se cerraron utilizando la función Rellenar agujeros en ImageJ. La herramienta Varita La selección se utiliza para segmentar todos los píxeles conectados desde el esferoide, y se registró el número de píxeles en esta área. El área total de cada esferoide se normalizó hasta el punto de tiempo de 24 h.
Inmunohistoquímica
Inmediatamente después del sacrificio, las muestras tumorales de tumor extirpado se fijaron en formalina al 10% durante 24 h y se transfirió a 70% etanol. Las muestras se procesaron a continuación para la inclusión en parafina y se seccionaron antes de la inmunotinción. Después de seccionamiento, las muestras de tejido se desparafinaron, se rehidrataron, y la etapa de recuperación de antígeno se llevó a cabo utilizando un tampón de citrato (pH 6,0) solución aplicada durante 20 minutos a 105 ° C seguido de 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se trataron a continuación con H 20
2 para eliminar la actividad peroxidasa endógena 3%
. Las secciones se bloquearon a continuación con un reactivo de bloqueo de proteínas libre de suero durante 20 minutos. Serial secciones se incubaron durante la noche con una dilución 1: 100 de anticuerpo p-PKC pY313 (Cell Signaling#2055S) o p-SHIP2 Y986 /987 (Cell Signaling#2008). La detección de anticuerpos primarios utilizados Sistemas + Envision (Dako) con un polímero marcado con peroxidasa de rábano (30 min de incubación), seguido de la adición de sustrato DAB (5 min de incubación). muestras teñidas se obtuvieron imágenes a un aumento de 40x y se analizaron para la expresión de marcadores histológicos.
Resultados
El proteoma fosfotirosina de 116 HCT-células cultivadas humanos colorrectales
previamente se realizó un análisis exhaustivo del proteoma fosfotirosina de Src fibroblastos de ratón transformado
In
vitro [28]. El propósito de este estudio fue realizar un análisis similar para caracterizar el proteoma Py de la línea celular humana CRC y luego extender el enfoque de la búsqueda de potenciales biomarcadores Py dasatinib-respuesta en los xenoinjertos de tumores HCT-116.
Inicialmente, hemos tratado de caracterizar el proteoma de las células cultivadas Py HCT-116, en ausencia de tratamiento con dasatinib. De 15 carreras independientes LC-MS /MS (5 réplicas biológicas, cada uno apoyado por 3 repeticiones técnica), se identificaron 249 péptidos pY distintas. Estos péptidos representan 162 sitios pY distintos sobre 116 proteínas diferentes. Criterios para la retención de péptido incluyen Xcorr valor de umbral alto y la identificación de & gt; 1 biológica replicar. Tabla S1 muestra los péptidos retenidos agrupados según una clasificación funcional, pY posición ácido sitio amino, número de identificaciones independientes (recuentos espectrales), y los valores más altos XCorr. La lista de péptidos pY retenidas y los datos de recuento espectral proporciona una visión global de las actividades de señalización Py células HCT-116 en las condiciones de cultivo celular monocapa. Alrededor de la mitad de los sitios de pY enumerados representan proteínas quinasas (44/162) y otras proteínas de señalización (38/162), mientras que otro 25% de los sitios se encuentran en las proteínas asociadas con la adhesión celular y el citoesqueleto de actina (40/162) (Figura 1A).
En células cultivadas HCT-116, se identificaron 162 sitios pY que representan 116 proteínas distintas (A). Las proteínas clasificadas en las categorías generales de adhesión y citoesqueleto, proteínas quinasas, y la Cuenta de otro señalización durante aproximadamente tres cuartas partes del total. De los sitios pY en proteínas quinasas, la gran mayoría son en tirosina quinasas convencionales y las proteínas quinasas "Grupo CMGC", que incluye las CDK, ERK /MAPK, GSK-3, y otras quinasas de especificidad dual. Véase la Tabla 1 y Tabla 2 para una lista de los sitios más frecuentemente identificadas por recuento espectral en las células HCT-116. Todos los 162 sitios se presentan en la Tabla S1 junto con la información clave que incluye el número de entrada UniProt, fosfopéptidos detectadas en el análisis LC-MS /MS, y los ID espectrales totales. En los tumores de xenoinjertos HCT-116, se identificaron 71 sitios pY que representan el 58 proteínas distintas (B). criterios de retención para los sitios eran 7 o más IDs espectrales en los tumores y de detección también en HCT-116 células cultivadas. Los 71 sitios pY representan 58 proteínas distintas. sitios de tumor que satisfacen los criterios de retención tienen una distribución funcional muy similar a la de los sitios identificados en células cultivadas. Véase la Tabla 3 y la Tabla 4 para una lista de los principales sitios de recuento espectral en HCT-116 xenoinjertos. Los 71 sitios se presentan en la Tabla S2, junto con la información clave, incluyendo el número de identificación UniProt, fosfopéptidos detectadas en el análisis LC-MS /MS, y el número de identificaciones espectrales de
contra los tumores tratados con dasatinib no tratados.
De los sitios pY proteína quinasa, que identificó 24 sitios en 14 diferentes tirosina quinasas y 15 sitios en 14 quinasas CMGC diferentes. CMGC quinasas (un grupo de clasificación amplio que incluye las CDK, ERK /MAPK, GSK-3, y las familias de quinasas de doble especificidad) eran prominentes entre los sitios HCT-116 más frecuentemente identificados (Tabla 1). CDK1 pY15 era el sitio más detectada con 146 recuentos espectrales. Un sitio bucle de activación del dominio quinasa (pY1234) sobre el trato de economía, de crecimiento de hepatocitos receptor de la tirosina quinasa del factor, fue el segundo sitio más frecuentemente identificado en el perfil de células cultivadas HCT-116 con 74 recuentos espectrales. Otros sitios de alta clasificación de quinasas CMGC (incluyendo PRP4, ERK2, DYRK1, y GSK-3) también residen en el dominio quinasa bucles de activación de la fosforilación donde indica el estado activado. Se identificaron una serie de sitios en las células HCT-116 que no fueron observados en nuestro extenso análisis previo de MEFs [28], la tabla 2.
Proteína
Clase Funcional sitio
identificadores
CDK1Protein quinasa: CMGCY15146METProtein quinasa: tirosina * Y123474PRP4Protein quinasa: CMGC * Y84969CDCP1Adhesion: celular /ECM Y70747PaxillinAdhesion: celular /ECMY11841ERK2Protein quinasa: CMGC * Y18736SHBOther SignalingY24632Annexin A2Other SignalingY2429DYRK1AProtein quinasa: CMGCY32126SHBOther SignalingY26824LAP2 /ErbinOther SignalingY110424Catenin δ-1Adhesion: celular /CellY22824GSK-3Protein quinasa: CMGC * Y27922Table 1. Todos los sitios de fosfotirosina identificaron con mayor frecuencia en HCT-116 células cultivadas
* sitio en la activación de la proteína quinasa de dominio loop Los abreviaciones:. CDCP1, CUB contiene el dominio de la proteína 1; CDK1, proteínas controlan la división celular homólogo 2; DYRK1A, especificidad dual-fosforilación de la tirosina-quinasa regulada 1A; ERK2, activada por mitógenos proteína quinasa 1; GSK-3, la glucógeno sintasa quinasa-3 (alfa y beta); MET, hepatocitos del receptor del factor de crecimiento; PRP4, serina /treonina proteína quinasa homólogo PRP4; SHB, SH2 de dominio que contienen proteína adaptadora B. CSV Descargar proteína CSV
Clase Funcional sitio
identificadores
CDCP1Adhesion: celular /ECMY70747DCBLD2MiscellaneousY75019PKCδProtein quinasa: AGCY31318FAT1Adhesion: celular /CellY424416MST1R /RONProtein quinasa: Tirosina * Y123815Annexin A2Other SignalingY3014DCBLD2MiscellaneousY73214TYK2Protein quinasa: TyrosineY29213FYNProtein quinasa: la tirosina quinasa Y21311LYNProtein **: ** las tirosina Y19311Table 2. sitios fosfotirosina que no se encuentran en el extenso análisis previo de los MEF cultivaron
(28)
* sitio en el bucle de activación de la proteína quinasa de dominio ** sitio de la familia Src quinasa SH2 domainAbbreviations: CDCP1, CUB contiene el dominio de la proteína 1; DCBLD2, discoidina, CUB y LCCL proteína que contiene el dominio 2; FAT1, Protocadherin Grasa 1; FYN, tirosina-proteína quinasa Fyn; LYN, tirosina-quinasa Lyn proteína; MST1R /RON; Macrófagos estimulante de receptor de la proteína; PKC, proteína quinasa C de tipo delta; TYK2, no receptor de la tirosina-quinasa de proteínas TYK2. Descargar CSV CSV
El proteoma fosfotirosina de HCT-116 xenoinjertos de tumores
Después de haber obtenido el perfil Py de las células HCT-116 en cultivo, se empleó a continuación, la estrategia proteómica para identificar Py HCT-116 sitios que son pY prominente en xenoinjertos de tumores y que tienen el potencial de servir como biomarcadores para la capacidad de respuesta de dasatinib. tumores de xenoinjertos HCT-116 subcutáneos se establecieron en ratones desnudos atímicos y péptidos trípticos enriquecidos-Py se prepararon a partir de cada uno de 3 tumores de ambos ratones tratados con vehículo y de los ratones tratados 4 horas antes con 60 mg /kg dasatinib. Cada preparación de péptidos se analizó a través de tres duplicados LC-MS /MS se ejecuta para obtener los perfiles de pY tumorales. A partir de este análisis, 71 sitios py, en representación de 58 proteínas diferentes, fueron reconocidos como siendo prominente en los tumores de xenoinjertos, además de ser detectada en las células cultivadas (Tabla S2). Al igual que en el perfil de células cultivadas, la mayoría de estos sitios estaban en proteínas (incluyendo muchas proteínas quinasas) y proteínas de adhesión /asociada al citoesqueleto (Figura 1B) de señalización. Las tirosina quinasas y las proteínas quinasas CMGC estaban otra vez prominente en el perfil del tumor. Sitios en CMGC quinasas dominaron la lista de sitios de tumor más frecuentemente identificados incluyendo CDK1 Tyr15, y los sitios de bucle de activación de p38 MAPK, PRP4, ERK1, ERK2, y GSK-3 (Tabla 3).
proteína Clase Funcional
sitio
identificadores (no tratado, Das 4 horas) guía CDCP1Adhesion: celular /ECM Y70790, 14CDK1Protein quinasa: CMGCY1585, 80PKCδProtein quinasa: AGCY31372, 10p38α MAPKProtein quinasa: CMGC * Y18259 , 35PRP4Protein quinasa: CMGC * Y84949, 45ERK2Protein de quinasa: CMGC * Y18735, 31ERK1Protein de quinasa: CMGC * Y20430, 27RPTPαOther SignalingY79827, 1β-actinCytoskeletonY5522, 24GSK-quinasa 3Protein: CMGC * Y27919, 22Annexin A2Other SignalingY3019, 5Histone H4MiscellaneousY8919, 17Table 3. Los sitios fosfotirosina más frecuentemente identificado en los xenoinjertos de tumores HCT-116 no tratadas: comparación con los animales tratados con dasatinib
* sitio en bucle de activación de la proteína quinasa de dominio Abreviaturas:. CDCP1; CUB proteína que contiene el dominio 1; CDK1, proteínas controlan la división celular homólogo 2; ERK1, activada por mitógenos proteína quinasa 3; ERK2, activada por mitógenos proteína quinasa 1; GSK-3, la glucógeno sintasa quinasa-3 (alfa y beta); p38 MAPK, activada por mitógenos proteína quinasa 14; PKC, proteína quinasa C de tipo delta; PRP4, serina /treonina proteína quinasa homólogo PRP4; RPTPα, receptor de tipo tirosina fosfatasa-alfa de la proteína. Descargar CSV CSV
CDCP1 pY707 (90 recuentos espectrales), PKC pY313 (72 recuentos espectrales), y PKC pY334 (14 cargos espectrales) fueron algunos de los sitios más frecuentemente identificados en los xenoinjertos de tumores no tratados. tratamiento con dasatinib reduce en gran medida la frecuencia de identificación de los tres sitios (Tabla 3, Tabla 4), en consonancia con sus objetivos de bienestar de las quinasas de la familia Src. Por el contrario, los sitios de quinasas CMGC (que no se consideran ser fosforilados por quinasas dasatinib y minúsculas) fueron identificados en las frecuencias similares en los tumores no tratados y tratados con dasatinib. Otros sitios de dasatinib sensible aparentes entre los más frecuentemente identificado en los tumores tratados con vehículo incluido en pY798 RPTPα y pY30 de anexina A2 (Tabla 3). RPTPαpY798 fue identificado en 27 de los espectros de los tumores no tratados, pero sólo una vez en muestras tratados con dasatinib.
Proteína
Clase Funcional sitio
identificadores (sin tratar, 4 horas Das)
RAIG-1Otros SignalingY34715, 1PKCδProtein de quinasa: AGCY33414, 0SHC1Other SignalingY42713, 0α-enolaseMetabolic EnzymeY4413, 3SHIP2Other SignalingY98611, 0Table 4. otros sitios notables con dasatinib sensible fosfotirosina identificados en HCT-116 xenoinjertos de tumores no tratados: comparación con los animales tratados con dasatinib
Abreviaturas: PKC, tipo proteína quinasa C delta;. PRP4, serina /treonina proteína quinasa homólogo PRP4; RAIG-1, 3 retinoico proteína inducida por el ácido; proteína 1 SHC1, SHC-transformación; SHIP2, fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 5-fosfatasa 2. Descargar CSV CSV
inmunotransferencia valida la capacidad de respuesta de dasatinib PKC pY313 y RPTPα pY798 sitios en HCT-116 xenoinjertos de tumores
de la dasatinib más prominente sitios pY -responsive identificadas a partir del análisis de phosphoproteomic HCT-116 xenoinjertos de tumores (Tabla 3, Tabla 4), fosfato anticuerpos específicos son comercialmente disponibles para PKC pY313, SHIP2 pY986 /987 y RPTPα pY798. Estos anticuerpos se utilizan para validar la capacidad de respuesta dasatinib de estos sitios en relación con la inhibición de Src (determinado mediante el uso de un anticuerpo fosfoespecífico contra el sitio de autofosforilación Src pY416). Para los sitios tanto de la PKC pY313 y RPTPα pY798, inmunotransferencia con anticuerpos fosfo-específicos indica una marcada disminución en la fosforilación en 4 h tumores tratados con dasatinib de forma concomitante con la inhibición de Src (Figura 2A). El estado de fosforilación de estos residuos volvió a los niveles de línea base cerca de 24 horas después del tratamiento, lo que sugiere la durabilidad de la inhibición de Src en este modelo fue transitorio con una sola administración.
Immonoblot análisis de PKC pY313 y RPTPα pY798 en xenoinjertos de tumores en relación con Src pY416 después de una sola dosis farmacológica (A) o 5 dosis diarias de dasatinib (B). tejidos de xenoinjerto se evaluaron 4 h y 24 h después de la exposición dasatinib. Tanto PKC pY313 y RPTPα pY798 se correlacionan con la inhibición de Src en HCT-116 xenoinjertos. Además de una sola dosis, regímenes de tratamiento en estado estacionario (B) dieron como resultado la inhibición prolongada Src, medida 24 horas después de la exposición a dasatinib y se correlacionó con la disminución de los niveles de PKC y pY313 RPTPα pY798.
Para evaluar el efecto de la duración del tratamiento con dasatinib en la durabilidad de la inhibición de Src, HCT-116 tumores tratados con 5 dosis diarias de dasatinib se evaluaron mediante análisis de transferencia Western para determinar la respuesta de los residuos identificados en la administración del fármaco en estado estacionario.