Extracto
Antecedentes
La mayoría de los fármacos quimioterapéuticos para matar el cáncer células son altamente citotóxicos en las células normales, lo que limita sus aplicaciones clínicas. Por lo tanto, un objetivo que sigue pendiente es la identificación de un medicamento que es hipersensible a las células cancerosas, pero tiene efectos perjudiciales mínimos sobre las células sanas. Los objetivos de este estudio fueron evaluar el potencial de 4β-hydroxywithanolide (4βHWE) para destruir selectivamente las células cancerosas y para dilucidar sus mecanismos relacionados.
Metodología y Principales conclusiones
Los cambios en la supervivencia, oxidativo estrés, daño en el ADN, la apoptosis y la señalización se compararon entre el cáncer tratados con 4βHWE oral (Ca9-22) y fibroblastos normales (HGF-1) las células. A las 24 h y 48 h, el número de células Ca9-22 fueron sustancialmente disminuyeron, pero el número de células HGF-1 se redujo sólo ligeramente. Además, el IC
50 valores para 4βHWE en las células Ca9-22 eran 3,6 y 1,9 g /ml a las 24 y 48 h, respectivamente. Dependientes del tiempo aumentos anormales de ROS y la despolarización mitocondrial sensible a la dosis pueden ser explotadas mediante el uso de quimioterapias 4βHWE para matar selectivamente las células cancerosas. daño en el ADN dependiente de la dosis medida mediante ensayo extracto cometa-nuclear y el flujo de análisis basado en citometría-γ-H2AX /yoduro de propidio (PI) mostró daños relativamente más severo en las células Ca9-22. A concentraciones bajas y altas, 4βHWE perturbado preferiblemente el ciclo celular en células Ca9-22 mediante el aumento de la población subG1 y la detención de G1 o G2 /M. inducción selectiva de la apoptosis en las células Ca9-22 se confirmó además por Anexina V /ensayo de PI, por la expresión preferencial de fosforilados ataxia-telangiectasia- y proteína relacionada con Rad3 (p-ATR), y mediante escisión de la caspasa 9, caspasa 3, y poli ADP-ribosa polimerasa (PARP).
conclusiones /Importancia
En conjunto, los resultados de este estudio, en particular la mejora de la comprensión de los mecanismos de destrucción selectiva de 4βHWE, se pueden utilizar para mejorar la eficiencia para matar las células cancerosas orales durante la quimioprevención y la terapia
Visto:. Chiu CC, Haung JW, Chang FR, Huang KJ, Huang HM, Huang HW, et al. E (2013) Derivado-Baya de Oro 4β-hydroxywithanolide para destruir selectivamente las células orales contra el cáncer mediante la generación de ROS, daño del ADN, y apoptóticas Caminos. PLoS ONE 8 (5): e64739. doi: 10.1371 /journal.pone.0064739
Editor: Siyaram Pandey, Universidad de Windsor, Canada |
Recibido: 22 Enero, 2013; Aceptado: April 17, 2013; Publicado: 21 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Chiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia (NSC101-2320-B-037-049), el Departamento de Salud, Yuan Ejecutivo, República de China (DOH102-TD-C-111-002), y el Sol Yat-Nacional Proyecto Sen-Universidad UGC Común de Investigación (# NSYSU-KMU 102-034). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer oral es el sexto cáncer más común en todo el mundo [1]. Su alta morbilidad y mortalidad se deben en parte a sus resultados relativamente pobres de quimioterapia [2]. Debido a su alta citotoxicidad en las células normales, los diversos fármacos contra el cáncer de orales desarrolladas hasta ahora han limitado las aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, un objetivo que sigue pendiente es desarrollar una terapia contra el cáncer de oral que es más seguro y más eficaz, sobre todo en términos de eficiencia muerte selectiva.
Extracto de
Physalis peruviana gratis (baya de oro), que es una planta comestible en la familia Solanaceae, según los informes, confiere un efecto anti-hepatoma a través de apoptosis [3]. Nuestro trabajo previo [4] encontró que
P. peruviana
-derivado E-4β hydroxywithanolide (4βHWE) tiene efectos antiproliferativos y apoptóticos en las células cancerosas de pulmón humano [4]. Los withanolidos 4βHWE son C (28) lactonas esteroides derivados de las plantas [5] con potentes propiedades anti-cáncer [6]. Otros withanolidos, como witaferina A, informes, también inducen la apoptosis en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama [7], el melanoma [8], y la leucemia [9].
Las pruebas acumuladas en estudios recientes indican que la activación selectiva de apoptosis mejora la eficacia de la quimioterapia del cáncer [10] - [15]. Para mejorar la modulación del potencial de apoptosis de células cancerosas, una línea de investigación prometedora es el uso de withanólidos que matan selectivamente las células tumorales, pero que tienen baja toxicidad en las células sanas [13]. Sin embargo, el uso potencial de withanolidos inductores de apoptosis tales como 4βHWE [4] y witaferina A [7] - [9] para la destrucción selectiva, especialmente en las células de cáncer oral, rara vez se discute
Por lo tanto, este estudio. examinado la eficacia potencial y mecanismos relacionados de
P. peruviana
-derivado 4βHWE utilizado para destruir selectivamente las células de cáncer oral.
Materiales y Métodos
Los cultivos celulares y drogas información
Dos líneas celulares, Ca9-22 (humana carcinoma gingival) [16] - [18] y HGF-1 (fibroblasto gingival humano normal) [19], se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) -F12 medio y medio DMEM (Gibco, Grand Island, NY), respectivamente , suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 0,03% de glutamina y piruvato de sodio 1 mM. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. El 4βHWE (C
28H
38o
8; MW: 502,6). Se prepara a partir de extracto de bayas de oro como se describe en [4] y se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) para las pruebas de
Evaluación de la inhibición del crecimiento
El crecimiento celular se midió por (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio ( MTS) de ensayo como se describe en [18]. brevemente, las células fueron expuestas a control de vehículo (DMSO) o para 4βHWE a concentraciones de 1, 2, 5 y 10 mg /ml para 24 h. Las células fueron expuestas a solución de MTS ( CellTiter 96 Aqueous One Solution, Promega, Madison, WI, EE.UU.) y se dejó incubar durante 1 a 2 horas a 37 ° C. El producto se midió a 490 nm de absorbancia usando un Dynex MRX Modelo 96 Well Plate Reader (MTX Lab Systems, Inc., Vienna, VA, EE.UU.).
Evaluación de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS)
ROS intracelular se midió utilizando 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) a partir de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) como se describe anteriormente [17]. Después del tratamiento 4βHWE, las células se lavaron con PBS y luego incubadas con 10 mM H2DCF-DA en PBS durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. Las células se recogieron a continuación y se lavaron con PBS. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en PBS y se analizaron con un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, Mansfield, MA, EE.UU.) con el software Win-MDI (http://facs.scripps.edu/software.html) en excitación y emisión configuración de 480 y 525 nm, respectivamente
Evaluación del potencial de membrana mitocondrial
potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ
m; MitoMP). se midió utilizando un DIOC MitoProbe ™
2 ( 3) kit de ensayo (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) como se describe en [16]. Las células tratadas con 4βHWE se suspendieron en 1 ml de PBS caliente a aproximadamente 1 × 10
6 células /ml, cargado con 5 l de 10 mM DIOC
2 (3), y se incubaron a 37 ° C en 5 % de CO
2 durante 20-30 min. Después de la cosecha, se lavaron las células, se resuspendieron en PBS, y se analizaron inmediatamente usando un citómetro de flujo con el software Win-MDI en los ajustes de excitación y emisión de 488 y 525 nm, respectivamente.
Evaluación de daños en el ADN por el cometa-NE ensayo
El extracto nuclear (NE) de las células HGF-1 se utilizó para realizar el ensayo de cometa NE de acuerdo con un protocolo descrito previamente [4], [20] con una ligera modificación. Brevemente, suspensiones de células se mezclaron con volúmenes iguales de agarosa de bajo punto de fusión 1,2%, cargan inmediatamente en 1,2% diapositivas pre-recubierta de agarosa regulares, y después se enfrió con hielo hasta la solidificación. La tercera capa con un volumen igual de gel de agarosa de bajo punto de fusión 1,2%, entonces se cargó en el segundo gel solidificado y de nuevo se enfrió con hielo. Después del tratamiento de lisis de células a 4 ° C durante 2 h, los portaobjetos se procesan para la digestión NE con un cubreobjetos y se incubaron a 37 ° C durante 2 h en un espacio humidificado. La desnaturalización de las diapositivas de NaOH N y EDTA 0,3 mM 1 para 20 min fue seguida por electroforesis. Después del lavado, los portaobjetos se transfirieron a 0,4 M Tris-HCl (pH 7,5), y 40 l de yoduro de propidio (PI, 50 mg /ml; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) se añadió para la observación de microscopía de fluorescencia (TE2000-U ; Nikon, Tokio, Japón). En el ensayo del cometa, se utilizó un programa gratuito (http://tritekcorp.com) para medir el daño del ADN en términos de porcentaje de la cola de ADN [21].
Evaluación de daños en el ADN por γ-H2AX /PI citometría de
Después del tratamiento 4βHWE, las células fueron fijadas en 70% de etanol, se lavó dos veces en solución de BSA-T-PBS (1% de albúmina de suero bovino y 0,2% de Triton X-100 en PBS; Sigma), y se incubaron durante la noche a 4 ° C en 100 l de solución de BSA-PBS-T que contiene 0,2 g de p-histona H2A.X (Ser 139) del anticuerpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.). Después del lavado, las células se suspendieron durante 1 hora en una dilución 1:100 de Alexa Fluor 488-anticuerpo secundario etiquetado (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, EE.UU.). Después de otro lavado, las células se resuspendieron en 5 g /ml de PI para el análisis con un citómetro de flujo FACSCalibur con el software Win-MDI.
Evaluación de la distribución del ciclo celular y sub-G1 población
La tinción con PI se realizó como se describe anteriormente [20]. Brevemente, las células se trataron con vehículo (DMSO solamente) o 0,5, 1, 2, 5, y 10 mg /ml 4βHWE de 24 y 48 h. Después de la cosecha, las células se fijaron durante la noche con 70% de etanol. Después de la centrifugación, los sedimentos celulares se incubaron con 10 mg /ml PI y 10 mg /ml RNasa A en PBS durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo FACSCalibur y el software Win-MDI.
Evaluación de la apoptosis
La apoptosis se midió por anexina /PI tinción doble (Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [22]. Brevemente, las células se trataron con vehículo o con 4βHWE a dosis de 1, 2, y 5 mg /ml para 24 h. Las células fueron incubadas con 10 mg /ml de isotiocianato de anexina V-fluoresceína y 5 g /ml de PI y se analizaron con un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson) con el software Win-MDI.
Western Blot
ensayo de Western blot se realizó como se describe anteriormente [23]. Brevemente, las células se cosecharon y se lisaron primero. Los lisados se centrifugaron, y se determinaron las concentraciones de proteína. Los 40 g de lisados de proteínas se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10% y luego electrotransferred. Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5%. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios contra fosforilada ataxia-telangiectasia- y proteína relacionada con Rad3 (p-ATR) (# sc-109 912, Ser 428, Santa Cruz Biotech., CA, EE.UU.), escinde la caspasa-9 (# 9501 , señalización Technology, Beverly, MA, EE.UU.), la célula escinde la caspasa-3 (# IMG-144A, IMGENEX, San. Diego, CA, EE.UU.), se escindió poli polimerasa ADP-ribosa (PARP) (# 9541, Cell Signaling Technology) y β-actina (# sc-8432, Santa Cruz Biotech.), y sus correspondientes anticuerpos secundarios. La ECL ™ (Amersham Piscataway, NJ, EE.UU.) kit de detección de quimioluminiscencia a continuación, se utilizó para la detección de la señal.
El análisis estadístico
Se presentan todos los datos como medias ± SD. Las diferencias de grupo en la viabilidad celular y el ciclo celular se evaluaron utilizando el software JMP 9 para realizar un modelo lineal con la prueba HSD de Tukey post hoc. Niveles no conectados por la misma letra minúscula indican diferencias significativas. Otros datos fueron analizados por Estudiante
t-test
.
Resultados
Evaluación de la inhibición del crecimiento
El ensayo de MTS de la viabilidad celular después de 24 horas y 48 h de tratamiento con 4βHWE (0, 1, 2, 5 y 10 mg /ml) mostró que, para cada concentración experimental de 4βHWE, la proliferación de células de cáncer oral, Ca9-22 fue significativamente menor que la de 1-HGF células normales (de uno ANOVA de una vía) (Figura 1). En HGF-1 en las células, el tratamiento con 10 mg de viabilidad /4βHWE disminuyó ligeramente celular ml a 89,02 ± 1,17% y 65,42 ± 2,26% después de 24 h y 48 h, respectivamente. Por el contrario, la viabilidad de las células tratadas con Ca9-22 4βHWE tratados de manera similar se redujo drásticamente a 26,56 ± 2,22 y 16,01 ± 2,38 después de 24 h y 48 h, respectivamente. El efecto antiproliferativo de 4βHWE en células Ca9-22 era tanto de dosis-respuesta y dependiente del tiempo. Además, IC
50 valores fueron de 3,6 y 1,9 g /ml después de 24 h y 48 h, respectivamente, en las células tratadas con Ca9-22 4βHWE mientras IC
50 fue detectado en células de HGF-1 tratados de manera similar.
Las células se trataron con 0, 1, 2, 5, y 10 mg /ml 4βHWE de 24 y 48 h. Los datos, media ± SD (n = 3). Por las mismas concentraciones de fármaco en cuatro grupos diferentes (Ca9-22 durante 24 h, Ca9-22 durante 48 h, el HGF-1 durante 24 h, HGF-1 durante 48 h), datos que no están conectados por la misma letra minúscula ( esquina superior derecha de SD) diferían significativamente (ANOVA de una vía con HSD prueba post hoc de Tukey).
Evaluación de ROS
Algunas withanolidos como witaferina Un Según los informes, induce la muerte celular en células de melanoma mediante la generación de ROS [8]. Por lo tanto, este estudio siguiente se compararon los efectos de regulación de ROS sobre la proliferación de células Ca9-22 y HGF-1. Las figuras 2A y 2B muestran las intensidades de fluorescencia de ROS en términos de porcentajes de Ca9-22 y células HGF-1 positivos para DCFD-A, que fueron contados después del tratamiento con 3,6 mg /ml 4βHWE para intervalos de tiempo variables. La Figura 2C muestra la inducción suave de ROS observó en las células HGF-1 en comparación con la relativamente dramático de inducción dependiente del tiempo de ROS en células Ca9-22. Para cada concentración experimental de 4βHWE, el porcentaje de un DCFD células positivas fue significativamente mayor en las células de cáncer oral, Ca9-22 que en las células normales HGF-1 (
P
& lt; 0,0001).
Las células se administraron un vehículo y 3,6 mg /ml de 4βHWE para variar los intervalos de tiempo (0 a 5 h). Para medir el cambio ROS, 200 M H
2O se utilizó
2 como control positivo. (A, B) ROS flujo representativo basado en citometría de perfiles para las células tratadas con 4βHWE. (C) análisis de cuantificación de la intensidad de ROS en términos de DCFD-A positividad (%). Los asteriscos indican diferencias significativas entre las dos líneas de células después del tratamiento con concentraciones 4βHWE similares (
t-test
,
P Hotel & lt; 0,0001 **).
Evaluación de los potenciales de membrana mitocondrial (mitoMP) guía
a continuación, una Dioc
2 (3) ensayo se realizó para examinar los efectos de la inducción de ROS inducida por 4βHWE en mitoMP. Las figuras 3A y 3B muestran las intensidades de fluorescencia mitoMP en términos de porcentajes de DIOC
2 (3) células positivas Ca9-22 y HGF-1 después de 24 h de tratamiento con 0, 1, 2, y 5 mg /ml 4βHWE. La Figura 3C muestra que mitoMP moderadamente disminuyó en las células HGF-1, pero sustancialmente disminuida en Ca9-22 células de una manera dependiente de la dosis. Para cada concentración experimental de 4βHWE, el porcentaje de células positivas para DIOC
2 (3) fue significativamente menor en las células Ca9-22 que en las células HGF-1 (
P
& lt; 0,0005).
(A, B) un resultado representativo perfiles MitoMP basados en citometría de Ca9-22 tratado con 4βHWE y las células HGF-1. Las células se trataron con concentraciones variables (0 a 5 mg /ml) de 4βHWE para 24 h. (C) análisis de cuantificación de la intensidad de MitoMP. Los datos se presentan como medias ± SDs% (n = 3). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre las líneas celulares Ca9-22 y HGF-1 después del tratamiento con concentraciones similares de 4βHWE (
t-test
,
P Hotel & lt; 0,0005 **).
Evaluación de daños en el ADN por el cometa-NE ensayo
en el ensayo cometa-NE (Figura 4A), las "colas" efectos observados en las células Ca9-22 eran más grande en alto 4βHWE concentraciones. En contraste, ninguna de las concentraciones experimentales 4βHWE indujo un efecto observable en las células del tizón del HGF-1. La Figura 4B muestra que las células HGF-1 mostraron ningún aumento visible en la cola de ADN% mientras que las células Ca9-22 mostraron un aumento espectacular de ADN% cola de una manera dosis-respuesta. Para cada concentración experimental de 4βHWE, el daño del ADN en términos de ADN% en las colas de las células tratadas con 4βHWE era significativamente más grave en las células HGF-1 que en las células Ca9-22 (
P Hotel & lt; 0,0001) .
(a) un representante de cometas resultados de la tinción PI para los controles celulares (DMSO) y células tratadas con 0,5, 1, 2, y 5 mg /ml 4βHWE durante 2 h. Los núcleos aparecen como manchas rojas, y las colas de los puntos indican la gravedad del daño al ADN después de los tratamientos 4βHWE. (B) Promedio del% del ADN de la cola en Ca9-22 tratado con 4βHWE y las células HGF-1. Los datos, media ± DE (núcleos = 50). Los asteriscos indican diferencias significativas entre las líneas celulares Ca9-22 y HGF-1 después del tratamiento con concentraciones 4βHWE similares (
t-test
,
P Hotel & lt; 0,0001 **).
Evaluación de daños en el ADN por γ-H2AX /PI citometría
Para confirmación adicional de la implicación de los daños en el ADN en la inhibición inducida por 4βHWE de crecimiento en células de cáncer oral, Ca9-22, el ADN de doble hebra descanso (OSD) se midió en términos de expresión γ-H2AX. La Figura 5A muestra los perfiles de γ-H2AX /PI tinción obtenidos después de 24 h con tratamientos de control positivo o con 0, 0,1, 0,25, 0,5 y 1 mg /ml de 4βHWE. La Figura 5B muestra que, después del tratamiento con concentraciones 4βHWE inferior a 2 g /ml, las células HGF-1 mantenidos bajos niveles de expresión γ-H2AX mientras que las células Ca9-22 mostraron aumentos dependientes de la dosis dramáticos en la expresión de γ-H2AX. A concentraciones más altas de 4βHWE, sin embargo, el factor de cambio en el% de células γ-H2AX-positivas fue significativamente mayor en las células Ca9-22 que en las células de HGF-1 (
P
& lt; 0,0005).
Las células se trataron con 0, 1, 2, y 5 mg /ml de 4βHWE para 24 h. (A) perfil basado en citometría de flujo Representante OSD para Ca9-22 tratado con 4βHWE y las células HGF-1. Las células tratadas con 5 camptotecina mu M (CPT) durante 24 h se consideraron control de γ-H2AX positivo. (B) análisis de cuantificación de cambios veces en el daño del ADN a base de γ-H2AX en Ca9-22 tratada 4βHWE y células HGF-1. Los datos, media ± DE. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre Ca9-22 y las células HGF-1 tratados con concentraciones 4βHWE similares (
t-test
,
P Hotel & lt; 0,0005 **; n = 2 y 3, respectivamente).
Evaluación de la distribución del ciclo celular
la figura 6 muestra que, después de 24 h de tratamiento con 4βHWE, el cambio porcentual en la población sub-G1 en las células HGF-1 no era estadísticamente significativo a concentraciones menores que 2 mg /ml. El cambio porcentual en la sub-G1 aumenta ligeramente hasta el 2,75% cuando la concentración alcanzó 5 mg /ml. Por el contrario, el cambio porcentual en la sub-G1 en las células tratadas con Ca9-22 4βHWE durante 24 h comenzó a mostrar cambios significativos en concentraciones tan bajas como 2 mg /ml y, finalmente, alcanzó el 30,59%. Después de 48 h de tratamiento, el porcentaje de poblaciones sub-G1 en las células HGF-1 aumentó moderadamente a 25,03% y 29,42% después de los tratamientos con 2 y 5 mg /ml 4βHWE, respectivamente. En contraste, el porcentaje de sub-G1 en las células tratadas con Ca9-22 4βHWE durante 48 h mostró un cambio estadísticamente significativo (42,76%) después del tratamiento con 1 mg /ml y un cambio mucho mayor (78,89%) después del tratamiento con 5 mg /ml.
Las células se trataron con 0, 1, 2, y 5 mg /ml 4βHWE para 24 h y 48 h. (A) la distribución del ciclo celular Representante en Ca9-22 tratado con 4βHWE y las células HGF-1. porcentajes (B) de fase de la célula obtenidos para (A) en los experimentos por triplicado. Por la misma fase de diferentes concentraciones de fármaco, los datos no conectados por la misma letra minúscula (parte superior derecha de SD) diferían significativamente (ANOVA de una vía con HSD prueba post hoc de Tukey).
A 24 h, los análisis de G1 y G2 /M en las poblaciones de células HGF-1 mostró un cambio no significativo en la población de G1 y un nivel basal de cambio en la G2 contaminación /M. Por el contrario, después de 24 h de tratamiento 4βHWE, las células Ca9-22 mostraron cambios significativos en la detención en G1 (57,49% y 40,75% a 0,5 y 1 g /ml, respectivamente) y en G2 /M detención (50,44% y 62,08% a 1 y 2 mg /ml, respectivamente). Después de 48 h de tratamiento con 5 mg /ml βHWE, la población G1 en las células HGF-1 disminuyó ligeramente a 56,27%, mientras que el G2 /M población aumentó ligeramente. En contraste, las células mostraron Ca9-22 sustancial (79,23%) después de la detención en G1 48 h de tratamiento con una concentración 4βHWE de solamente 0,5 mg /ml. En la G2 /M de la población, el tratamiento con 1 mg /ml dio como resultado 4βHWE moderada arresto G1 (27,34%), junto con acumulaciones subG1 dramáticos como se describe anteriormente.
Evaluación de la apoptosis
Para examinar la la participación de la apoptosis en la acumulación de sub-G1 inducida por 4βHWE, fluya anexina V basada en citometría /PI se llevó a cabo la doble tinción. La Figura 7A muestra los perfiles de tinción γ-H2AX /PI de células Ca9-22 HGF-1 y tratados con concentraciones variables 4βHWE. Las áreas positivas dobles de gamma-H2AX y PI intensidades se definen comúnmente como finales de la apoptosis. Los análisis de los finales de la apoptosis (Figura 7B) mostraron un aumento dependiente de la dosis leve en células HGF-1, pero un aumento dependiente de la dosis en las células dramática Ca9-22. Para cada concentración experimental de 4βHWE, el porcentaje de células que se sometieron a apoptosis tardía después del tratamiento 4βHWE fue significativamente mayor en las células Ca9-22 que en las células de HGF-1 (
P
& lt; 0,0001).
Las células se trataron con 0, 1, 2, y 5 mg /ml 4βHWE para 24 h. apoptóticos perfiles representativos (A) obtenidos por Anexina V /PI tinción doble en Ca9-22 tratado con 4βHWE y las células HGF-1. resultados de los análisis (B) Cuantificación de la población apoptosis tardía (%). Sólo anexina V (+) /PI se analizaron las regiones (+). Los datos, media ± SD (n = 3). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre las dos líneas celulares (Ca9-22 y HGF-1) tratadas con concentraciones similares 4βHWE (
t-test
,
P Hotel & lt; 0,0001 **).
Evaluación de la apoptosis de señalización
señalización apoptótica se examinó mediante ensayos de transferencia Western de células Ca9-22 y HGF-1 tratados con concentraciones variables de 4βHWE (0, 1, 2, y 5 mg /ml). Figura 8 muestra que concentraciones crecientes de 4βHWE indujeron aumentos paso a paso en la fosforilación ATR asociado con daño en el DNA celular en las células Ca9-22. La escisión de la caspasa 9, caspasa 3 y PARP también se indujo en células Ca9-22, especialmente a concentraciones 4βHWE de 2 mg /ml y 5 mg /ml. Por el contrario, 4βHWE no provocó ya sea fosforilación ATR o activación de cascada de caspasas en las células HGF-1.
Las células se trataron con 0, 1, 2, y 5 mg /ml 4βHWE para 24 h. La apoptosis proteínas, tales como p-ATR, y la escisión de la procaspasa 9 de señalización, se detectaron pro-caspasa 3 y PARP. El β-actina se utilizó como control interno. Cada transferencia representa un experimento independiente realizado por triplicado.
Discusión
withanólidos son C (28) lactonas esteroides derivados de plantas con actividad potente contra el cáncer [24], [25] . Sin embargo, el uso de withanólidos para células de cáncer de destruir selectivamente no se ha estudiado intensamente. Witaferina A se sabe que inducen la apoptosis en muchos tipos de cáncer, incluyendo leucemia [9], melanoma [8], y los cánceres de mama [7], el hígado [26], páncreas [27], colon [28], pulmón [29 ], y de próstata [30]. En estudios anteriores, los ensayos XTT realizaron después de 24 h de tratamiento con witaferina A mostró IC
50 valores de 2 M en células de leucemia (HL-60) [31], 4 M en células de cáncer de próstata (PC3) [30], y & gt ; 6 M en células de cáncer renal (Caki) hepatoma (SK-HEP1), cáncer de colon (HT29), y [26]. Informó IC
50 valores obtenidos por ensayos de MTT de las células de cáncer de mama (MDA-MB-231) incluyen 13 mM para anomanolide A, 15 mM de tubocapsanolide E, y & gt; 20 M para tubocapsenolide B, tubocapsanolide C, y peruvianolide H [ ,,,0],6].
Recientemente, withanolide derivado de la hoja de Ashwagandha extracto de [32] han demostrado un papel potencial en matar selectivamente a las células MCF7 de cáncer de mama a una concentración de 24 mg /ml [33]. El presente estudio muestran de igual manera que el CI valores
50 de células de cáncer oral Ca9-22 fueron de 3,6 mg /ml (7,16 m) y 1,9 mg /ml (3,78 M) después de 24 hy 48 h de tratamiento con 4βHWE, respectivamente. Nuestra hipótesis es que el efecto de la destrucción selectiva de 4βHWE puede ser comparable o incluso más potente en otras líneas celulares de cáncer oral. En las células HGF-1, sin embargo, IC
50 valores fueron indetectables por el ensayo de MTS a concentraciones inferiores a 10 mg /ml. En otros estudios de tratamientos 4βHWE de 24 h, se informó de un IC
50 valor de 6 micras en un ensayo de MTT de las células de cáncer de mama MDA-MB-231 [6] y un IC
50 valor de 1,41 M era informaron en un ensayo de azul de tripano de cáncer de pulmón H1299 células [4]. Estos datos indican que la sensibilidad a los fármacos de 4βHWE varía según el tipo de célula de cáncer. Además, el presente estudio es el primero que confirmar que 4βHWE mata las células cancerosas orales preferentemente a las células orales normales.
Además, los efectos protectores de withanólidos se encuentran en células de fibroblastos normales. Por ejemplo, withanone derivado de la hoja Ashwagandha protege los fibroblastos humanos normales contra la detención del crecimiento senescencia-como inducida por ácido metoxiacético en términos de tinción β-galactosidasa asociada a la senescencia [34]. Del mismo modo, el estudio actual encontró que la morfología de las células HGF-1 tratado con 1, 2, y 5 mg /ml 4βHWE fue similar a la de las células de fibroblastos sin tratar HGF-1 (datos no presentados). Se necesitan más estudios de fenotipos detención del crecimiento para determinar si 4βHWE es seguro para las células normales.
A pesar de la acumulación de pruebas de acuerdo en que withanolidos inducen la apoptosis mediada por ROS, su uso potencial para destruir selectivamente las células cancerosas es relativamente claro. Por ejemplo, witaferina A se sabe que inducen la apoptosis mediada por ROS-en cáncer de mama [7], melanoma [8], y la leucemia [9], [31]. Aunque se espera que las células de cáncer de tener un mayor estrés oxidativo en comparación con las células normales [35], las células normales pueden tolerar un nivel de estrés oxidativo exógeno suficiente para evitar la sobrecarga que resulta en la muerte celular. En contraste, las células cancerosas expuestas a alto estrés oxidativo no pueden tolerar agentes ROS-moduladores exógenos, y aumenta la muerte celular como el nivel de umbral se excede [36]. Este concepto puede explicar en parte los efectos selectivos de muerte de 4βHWE en células de cáncer orales observados aquí y los de withanone en células de cáncer de mama como se informa en [33], es decir, tanto ROS inducción y la reducción del potencial de membrana mitocondrial son más altos en las células de cáncer en comparación para las células normales. Estos resultados sugieren que las terapias para destruir selectivamente las células cancerosas deben dirigirse a la modulación de estado redox en las células cancerosas y las células normales [36]. Sin embargo, los papeles de caspasas y los inhibidores de caspasas [37] en la apoptosis selectiva inducida por 4βHWE necesitan más estudios.
Los efectos mediados por ROS de withanolidos pueden ser modulados por los antioxidantes. Por ejemplo, N-acetilcisteína puede rescatar los informes, las células de melanoma humano de witaferina A inducida, la apoptosis mediada por ROS [8]. En consecuencia, el papel de las ROS en la matanza selectiva de 4βHWE puede aclararse aún más mediante el estudio de moduladores ROS.
El ROS se sabe que induce daño en el ADN y respuestas de control [38]. Por ejemplo, los ensayos cometa-NE y γ-H2AX en este estudio revelaron que 4βHWE induce daño en el ADN y G1 o G2 /M detención del ciclo celular, ambos de los cuales se han observado anteriormente en otros withanólidos. Por ejemplo, según se informa tubocapsanolide A inhibe la proliferación de las células A549 de cáncer de pulmón a través de la detención en G1 [39]. Sin embargo, 4βHWE [4] y withanone [33] se sabe que inducen daño del ADN y luego la detención en G2 /M en las células H1299 cáncer de pulmón y cáncer de mama en células MCF-7, respectivamente.
daño en el ADN selectiva ( es decir, DSB) se puede controlar mediante H2AX, que se fosforiló de forma ATR-dependiente [40]. El H2AX también ayuda a estabilizar el genoma [41] y es esencial para la caspasa-activado la fragmentación del ADN [42]. Como era de esperar, el tratamiento 4βHWE indujo mayores expresiones de ATR y proteínas de señalización de caspasas en células Ca9-22 comparación con las células HGF-1.
Después de 24 h de tratamiento con 2 mg /ml 4βHWE, Ca9-22 y HGF-1 células mostraron viabilidades de células (%) de 56,09 ± 1,78 y 92,81 ± 2,20 (Figura 1); mitoMP (%) de 61,18 ± 3,21 y 99,81 ± 0,74 (Figura 3); γ-H2AX (veces) de 8,47 ± 0,54 y 0,73 ± 0,19 (Figura 5); poblaciones subG1 (%) de 14,74 ± 0,30 y 1,32 ± 0,15; G2 /M detención de 62,08 ± 1,03 y 15,89 ± 0,19 (Figura 6) a finales de la apoptosis (%) de 13.80 ± 1.05 y 7.97 ± 0.06 (Figura 7); y superiores e inferiores a la expresión de las proteínas de señalización de apoptosis (Figura 8), respectivamente. Estos resultados mostraron consistentemente los efectos de 4βHWE en términos de destrucción selectiva, la disfunción mitocondrial selectiva, el daño del ADN selectiva (es decir, DSB), G2 selectiva detención /M, y la apoptosis selectiva de las células Ca9-22 preferentemente a las células HGF-1. Después de un tratamiento similar con 3,6 mg /ml 4βHWE de 2 h, la Ca9-22 y células HGF-1 mostraron la inducción ROS (%) de 158,83 ± 0,34 y 108,63 ± 1,04 (Figura 2) y el daño del ADN-basados NE cometa de 29,21 ± 5,93 y 0,27 ± 0,52 (Figura 4), respectivamente. Estos resultados confirmaron además que el tratamiento 4βHWE induce selectivamente ROS y daño en el DNA en las células Ca9-22 con preferencia a las células HGF-1.
En conclusión, los resultados de este estudio confirman que el tratamiento 4βHWE induce selectivamente ROS, la despolarización mitocondrial , y el daño del ADN, que a su vez induce la señalización de apoptosis selectiva, que finalmente resulta en la muerte selectiva de células de cáncer oral (Figura 9). Por consiguiente, este estudio demostró, por primera vez, que el tratamiento 4βHWE mata selectivamente las células de cáncer oral en preferencia a las células normales por vía oral. El estudio adicional de los candidatos a blancos y los mecanismos de señalización reportados aquí pueden también proporcionar una comprensión suficientemente mejorada de los mecanismos de destrucción selectiva de 4βHWE para permitir su uso efectivo en el tratamiento del cáncer oral con efectos adversos mínimos.
Los cambios en Ca9-22 las células se indican mediante flechas azules. células orales normales (no mostrados) mostraron cambios relativamente pequeños en comparación con las células Ca9-22. En Ca9-22 tratados con 4βHWE, la generación de ROS se tradujo en un aumento del estrés oxidativo. La inducción de ROS aumenta entonces la disfunción mitocondrial y facilitó la reducción del potencial de membrana mitocondrial en las células Ca9-22. La inducción de ROS también se produjo un aumento de daño en el ADN en las células Ca9-22, por ejemplo, γ-H2AX en el OSD, que a su vez induce la fosforilación ATR. En conjunto, la señalización de daño mitocondrial y la señalización de daño en el ADN resultado un aumento de la señalización de la apoptosis, que luego dio lugar a la apoptosis selectiva y muerte de las células Ca9-22.