Extracto
Proteína anterior degradado (AGR-2) Se ha informado de que se sobre-expresado en muchos cánceres epiteliales y promueve la metástasis. Un mecanismo bien definido para su función (s) observado no ha sido previamente identificada. Encontramos regulación al alza significativa de AGR-2 expresión en una línea celular de cáncer de próstata metastásica ósea, PC3, después de cultivar en medio de médula ósea acondicionado. Sustancial AGR-2 expresión también se confirmó en muestras de tejido de cáncer de próstata en pacientes con lesiones óseas. Mediante el desarrollo de clones estables de células PC3 con diferentes niveles de AGR-2 de expresión, identificamos que la derogación de AGR-2 redujo significativamente la unión celular a la fibronectina, colágeno I, colágeno IV, laminina I y fibrinógeno. La pérdida de la adhesión celular se asoció con fuerte disminución de la expresión de a4, a5, alpha v, ß3 y beta 4 integrinas. La falta de someterse a la apoptosis después de la separación es una característica de la metástasis del cáncer epitelial. Las células PC3 silenciados-AGR-2 mostraron una mayor resistencia a la apoptosis de necrosis tumoral factor relacionado apoptosis ligando inductor (TRAIL) inducida por
in vitro
. Esta observación también fue apoyada por la reducción significativamente la expresión de la caspasa-3 en células PC3 silenciados-AGR-2, que es un efector clave de ambas vías de señalización de muerte intrínsecos y extrínsecos. Estos datos sugieren que la metástasis del cáncer AGR-2 Influencia de próstata mediante regulación de la adhesión celular y la apoptosis
Visto:. Chanda D, Lee JH, Sawant A, Hensel JA, Isayeva T, Reilly SD, et al. (2014) anterior Gradiente proteína-2 es un regulador de la adhesión celular en el cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (2): e89940. doi: 10.1371 /journal.pone.0089940
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Octubre, 2013; Aceptado 25 de enero de 2014; Publicado: 27 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Chanda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiera apoyo de los Institutos nacionales de Salud subvenciones R01 AR560948, R01 CA133737 y AR046031 P30 se aprecia con gratitud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dr. Raj Singh es un empleado de Vivo Biosciences Inc. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de próstata tiene la tasa de incidencia más alta entre todos los cánceres en los hombres en el mundo desarrollado y es la tercera causa principal de muerte detrás de pulmón y colorrectal [1]. Patogénesis del cáncer de próstata y sus metástasis preferencial al hueso y otros órganos están regulados por los genes, que funcionan cooperativamente para promover cada paso de la carcinogénesis y la cascada metastásica [2] - [4]. Aunque se informó de firmas genéticas específicas sobre las etapas de la progresión del cáncer en el cáncer de mama, por ejemplo información con respecto a cáncer de próstata todavía falta [5]. Identificar el papel de las nuevas moléculas de importancia diagnóstica y terapéutica sigue siendo un importante foco de investigación actual sobre el cáncer. Por análisis de la expresión génica, se observó aumento significativo de AGR-2 en la línea celular de cáncer de próstata PC3, metástasis en hueso, después de mantenimiento en un medio acondicionado ósea de hueso normal. AGR-2 fue identificado por primera vez como XAG-2 en
Xenopus laevis
, que induce la diferenciación de la glándula de cemento que ayuda a los embriones a permanecer unidos a través de sustrato secreción de una sustancia mucinoso [6]. El homólogo de mamífero, AGR-2, es una proteína disulfuro isomerasa (PDI), que contiene un dominio de tio-redoxin y responsable de la producción de moco intestinal [7]. Los ratones que carecen AGR-2 son propensos a desarrollar colitis [7]. AGR-2 ha atraído considerable atención en los últimos años por su supuesto papel en la progresión neoplásica y la metástasis [8] - [15]. AGR-2 se ha encontrado que se sobre-expresan en diversos adenocarcinomas y se ha relacionado con una mala supervivencia de los pacientes con cánceres de mama y de próstata [16], [17]. unos informes recientes han arrojado luz sobre los elementos reguladores de la función AGR-2, pero su papel específico (s) en la tumorigénesis y la progresión de la metástasis sigue faltando [18] - [20]. En el cáncer de próstata, se informa de AGR-2 que se andrógenos inducible y sólo sobre-expresado durante las primeras etapas de la carcinogénesis [13], [21]. Por el contrario, un estudio reciente también observó reducción AGR-2 expresión en tumores de alto grado, que coincidió con la enfermedad metastásica [13].
En el presente estudio se utilizaron AGR-2 método de silenciamiento de genes en el cáncer de próstata metastásico hueso humano PC3 línea celular para comprender su función biológica en la metástasis ósea del cáncer de próstata. Los resultados indicaron pérdida de AGR-2 en células PC3 dado lugar a una reducción significativa en la adhesión de células tumorales, la pérdida de expresión de a4, α5, alpha v, integrinas y el desarrollo de resistencia a la apoptosis ß3 y beta 4, lo que sugiere el papel de AGR-2 en cascada metastásica de próstata el cáncer al afectar la adhesión de células tumorales y la migración.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
Una línea celular de cáncer de próstata humano osteolítica, PC3, se adquirió de ATCC (Manassas , VA), y un derivado clonal de las células PC3, que expresa la luciferasa de luciérnaga, fue un generoso regalo del Dr. Kenneth J. Pienta (Universidad de Michigan, Ann Arbor, Michigan). Ambas líneas celulares se mantuvieron en RPMI-1640 (Mediatech Inc. Hendron, VA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Mediatech Inc.) y penicilina /estreptomicina (Mediatech Inc). El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se purificó usando un mini kit QIAGEN (Valencia, CA). cDNA microarray análisis fue realizado por los recursos compartidos Genómica del Cáncer en el Centro de Cáncer Winship de la Universidad de Emory (Atlanta, GA) usando un Illumina BeadStation 500 y los datos se analizaron mediante Java Treeview, Spotfire, Gene Cluster 3.0 y vía de análisis Ingenuity. kit de síntesis de cDNA iScript se adquirió de Bio-Rad (Hercules, CA). AGR-2 primers (adelante 5'-TTGGGGTGACCAACTCATCT-3 '; inverso 5'GGACAAACTGCTCTGCCAAT-3') para el análisis de RT-PCR fueron diseñados utilizando la (versión 4.0) el software Primer 3 y oligonucleótidos fueron adquiridos de Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). muestras de cDNA se analizaron en Bio-Rad iCycler (Hercules, CA). 3 dimensiones (3-D) perlas PC3 para el crecimiento en la médula ósea medio acondicionado se generaron después de un crecimiento de células PC3 en matrices hu-Biogel y suministrados por Vivo Biosciences (Birmingham, AL). Un kit de ensayo de proliferación celular MTT Vybrant ® se adquirió de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). 3-D extracto de membrana basal Cultura Matrix ™ fue adquirido de Cultrex (3445 hasta 00501, Gaithersburg, MD). Un kit de ensayo de adhesión celular Cytoselect ™ de 48 pocillos se adquirió de celulares Biolabs, Inc. (CBA-070, San Diego, CA). Todos los kits y reactivos se utilizan siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los anticuerpos
Mouse y anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos policlonales para AGR-2 fueron adquiridos de Abcam Ltd (Cambridge, MA, y se utiliza en una dilución de 1:1000 para inmunotransferencias y 1:500 para IHC). Un kit de toma de muestras de anticuerpo de integrina se adquirió de Señalización Celular (4749S, Danvers, MA, y se usa a una dilución de 1:1000 para inmunotransferencias y 1:500 para IHC). La caspasa-3, caspasa-3 escinde y beta-actina anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling (Danvers, MA, y se utilizaron a una dilución de 1:500 para inmunotransferencias). Secundaria inmuno-detección se realizó a través de cabra anti-rata /ratón /conejo IgG ABC kits comprados de Vector Laboratories (Burlingame, CA) y GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). Para la detección de inmunofluorescencia secundario, de cabra anti-rata /ratón /IgG de conejo marcado con Alexa-Fluor-594 se adquirió de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, 2 g /ml).
muestras de tejidos humanos
tejido óseo cáncer de próstata metastásico se obtuvo de la autopsia en la Universidad de Alabama en Birmingham, de acuerdo con la aprobación del protocolo junta de revisión institucional (IRB). embebidos en parafina bloques de tejido fijado en formol obtenidos a partir de estas fuentes se seccionaron a 6 micras. Todas las muestras de tejido fueron examinados y caracterizados por los patólogos anatómicos certificados por la junta.
El aislamiento de médula ósea acondicionado Medio
Varón C57BL /6 ratones fueron sacrificados y ambos fémur y la tibia se cosecharon y médula se purgada con SIGMA libre de suero estéril medio Stemline (St Louis, MO) utilizando una aguja de calibre 28,5 montado en una jeringa de 1 ml en un tubo estéril de 50 ml que contiene 10 ml de medio libre de suero Stemline. grupos de médula ósea se separaron por repetidas pasa a través de una aguja de calibre 16,5 montado en una jeringa de 10 ml hasta que se consigue una suspensión celular única homogénea. Las células se sedimentan mediante centrifugación a 1200 rpm, se lavaron tres veces usando medio libre de suero y finalmente se resuspendieron en 50 ml de medio que contiene Stemline 10% de suero bovino fetal y antibióticos. Las células se diluyen con medio que contiene suero Stemline a 100 ml y se distribuyen a cuatro 150 cm
2 frascos de cultivo celular (Corning Inc. Corning, NY) para el mantenimiento en una cámara húmeda con 95% de O
2 y 5% de CO
2 de suministro. Después de dos días se recogió el medio de cultivo y se centrifuga a alta velocidad para deshacerse de las células y los desechos. Los sobrenadantes se combinaron y se utiliza directamente para la cultura de la 3-D, perlas PC3.
Construcción de vector recombinante shRNA y el desarrollo de clones individuales PC3 derivado de células con AGR-2 Derribo
Veinte objetivos de par de una sola base se seleccionan de regiones únicas de la secuencia de codificación AGR-2 usando Tuschl et al., 1999 directrices de diseño siRNA [22]. Entre las secuencias de ARNhc probados, la que mostró la máxima eficacia se utilizó en el presente estudio y consistió en sentido 21-mer (GACAAACACCTTTCTCCTGAT) y cadenas antisentido separadas por una región 9-bp y contenía BamHI o Hind III sitios de restricción, respectivamente , para la clonación direccional (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Los oligonucleótidos se hibridaron y ligaron directamente en un pRNAT.U6 /Neo plásmido de expresión /GFP (Genescript, Piscataway, NJ). Una de las secuencias de 21-mer (CCTTGAGACTTGAAACCAGAA) que no pudieron silenciar AGR-2 expresión se utilizó como control experimental para minimizar cualquier efecto desviado. PC3 células se cultivaron en placas de 6 pocillos a aproximadamente el 90% de confluencia en un medio libre de antibióticos. Las células fueron luego transfectadas con AGR-2 shRNA que expresan plásmidos usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, el medio de transfección se reemplazó con medio completo y después de otras 24 horas, las células GFP positivos flujo de ordenadas y se mantiene en pre-estandarizado 600 mg /ml de neomicina (10131, GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Una vez neomicina células resistentes desarrolladas, las células se tripsinizaron y se sembraron de nuevo en placas de cultivo de 96 pocillos a una /pocillo de frecuencia 1 célula, en los duplicados. Se seleccionaron AGR-2 clones desmontables PC3 (PC3
AGR-2SH) clones de células y de control (PC3
de control) después de evaluar la AGR-2 de expresión a través de Western Blot y análisis de inmunofluorescencia.
sTRAIL- la apoptosis inducida por ensayos
recombinante humano TNF-relacionados ligando inductor de apoptosis (TRAIL) se adquirió de Merck Millipore Corporation, Temecula, CA. PC3
Control y PC3
células AGR-2SH fueron tratados con 0, 12.5, 25, 50 y 100 de concentración ng /ml de TRAIL. La viabilidad celular se determinó después de 12 hrs y 72 hrs por tinción con yoduro de propidio (BD Biosciences) y MTT Ensayo de proliferación celular Kit respectivamente. también se recogieron las células tratadas después de 0 h, 1 h, 3 h y 6 hrs por raspado de células, sedimentos de células se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo y se sometieron a transferencia de Western para la detección de la caspasa 3 y activos escindidos de caspasa-3 péptidos.
Western Blotting
Las células se tripsinizaron, se lavaron y se resuspendieron en tampón de lisis de proteína antes de ser congelado-descongelado una vez a -80 ° C. Las proteínas se desnaturalizaron adición de tampón SDS-PAGE que contenía β-mercaptoetanol e incubando a 95 ° C durante 5 min. El ADN genómico fue esquilada por ultra-sonicación. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el método de Lowry (Biorad, Hercules, CA). Las proteínas se separaron en gel de poliacrilamida o bien 10 o 15% y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó durante 1 hr, en la leche en polvo 2% no grasa, en TBST para bloquear la unión de anticuerpo primario no específica. La membrana se incubó durante la noche con anticuerpos primarios apropiadamente diluido en tampón TBST. anticuerpo Beta-actina se utilizó como control de carga. Siguiendo a 3 tiempos de lavado en TBST, la membrana se incubó en IgG de cabra anti-ratón /conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5000, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) durante 30 minutos. La membrana se lavó de nuevo en TBST y se desarrolló usando un reactivo de quimioluminiscencia (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Piscataway, NJ) y se proyecta sobre un desarrollador de quimioluminiscencia Fuji LAS-3000.
inmunofluorescencia
tanto PC3
control y PC3 células
AGR-2SH se hicieron crecer en cultivo hasta 50% de confluencia en portaobjetos con cámaras, se lavó a fondo en PBS y se fijaron en helado de 3,7% de paraformaldehído en PBS que contenía 0,1% de Triton-X-100 , por 20 min, a temperatura ambiente. Las células se lavaron a fondo y se incubaron durante la noche a 4 ° C en anticuerpo AGR-2 humana monoclonal de rata. Después de PBS de lavado, las células se incubaron con IgG anti-rata de Alexa-Fluor-594 marcado (Molecular Probes, Eugene, OR), durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Se lavaron las células y los núcleos se tiñeron con DAPI para el contraste. Las células marcadas con fluorescencia se montaron utilizando Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) y se vieron en un microscopio de fluorescencia Leica DMRB.
histomorfometría e inmunohistoquímica
Los tejidos blandos fueron fijadas en 10% neutros buffered- solución de formalina durante 48 horas antes de la incrustación en parafina para análisis histológico. tejidos óseos fueron descalcificadas en 0,5 mol /l de EDTA en Ca
2 + - y Mg
2 + exento de PBS de Dulbecco (Cellgro) antes de la inclusión en parafina. Seis micras de serie de secciones longitudinales se cortaron del fémur y la tibia y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para determinar las características de crecimiento de los tumores en el hueso. Por inmunohistoquímica, 6 M secciones de parafina fueron desparafinados en xileno, e hidratada a través de alcohol graduado. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en tampón de citrato, pH 6,0, bajo vapor para 20 min. Las secciones se enfriaron a temperatura ambiente y la peroxidasa endógena se eliminó usando 0,3% H
2O
2 en metanol durante 30 min y se bloquearon con suero normal de cabra al 3% durante 30 min. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Las secciones se lavaron en PBST y de nuevo se incubaron a temperatura ambiente (RT) con anticuerpo de cabra conjugado con biotina anti-conejo /anti-rata anticuerpo secundario durante 2 horas. Después del lavado, las secciones se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de otro lavado con PBST, inmunodetección se realizó con DAB-H
2O
2 (Vector Labs, Burlingame, CA) y de contraste con hematoxilina siempre que sea aplicable.
Ensayos de Migración
ensayos de migración se realizaron mediante un método de "cierre de la herida" y mediante el uso de ensayo de cámara de Boyden. En el ensayo de cierre de la herida, las células PC3 silenciados-AGR-2 y células PC3 de control se sembraron a 10
5 por pocillo en una placa de seis pocillos. Al llegar a 90% de confluencia, las células se privaron de suero durante la noche. medio fresco se añadió a las células y las heridas fueron creadas usando una punta de pipeta de 200 l estéril. Fotografías del cierre de la herida se tomaron a las 0 horas y 22 horas para comparar la diferencia en la tasa de cierre de la herida entre el silenciado-AGR-2 y líneas de células de control PC3. Un ensayo de migración de cámara de Boyden se realizó en placas de 4 × 10
4 PC3
control y PC3
células AGR-2SH por pocillo en un inserto de cultivo celular (8 micras de tamaño de poro, el formato de 24 pocillos; Becton Dickinson Los aparatos de laboratorio) en medio libre de suero por triplicado. Para iniciar la migración 10% de FBS se utilizó como un quimioatrayente en la cámara inferior. Las células se incubaron durante 6 horas a 37 ° C y se retiran de la cámara superior con un bastoncillo de algodón. Las células en la parte inferior de la cámara se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia y se contaron usando el software Image J. El efecto de silenciamiento AGR-2 sobre la migración celular PC3 se presentó como valores relativos en comparación con el control (100%).
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados por el estudiante de
t
-prueba. Los valores proporcionados son la media ± SEM y se consideraron significativas las diferencias si p. & Lt; 0,05
Resultados
AGR-2 expresión aumenta en las células del cáncer de próstata metastásico en la Presencia de acondicionado de médula ósea microambiente
la metástasis ósea es un sello distintivo de la difusión del cáncer de próstata, que ofrece un ambiente ideal para estudiar la metástasis de este tipo de células cancerosas dentro del microambiente y, específicamente, las señales moleculares que promueven su supervivencia en el nicho metastásico. Para dilucidar si las respuestas a tales señales en el microambiente altera AGR-2 expresión en células de cáncer de próstata, las células PC3 se cultivaron en esferoides 3-dimensionales y se mantuvo durante 3 días en medio ósea acondicionado hueso. El ARN total se aisló de estas células y se sometió a análisis de microarrays de ADNc (Figura 1A), lo que fue confirmado posteriormente por cuantitativa en tiempo real RT-PCR (Expresión Génica Omnibus, GEO adhesión#GSE38714; NCBI sistema de seguimiento#16589736). AGR-2 fue sobre-expresado de manera significativa (p & lt; 0,05) en comparación con células PC3 cultivadas en medio regular (Figura 1B), lo que sugiere AGR-2 podría ser necesaria para la adaptación inicial de las células tumorales metastásicas al nuevo microambiente. AGR-2 expresión también se determinó en muestras de tejido de cáncer de próstata metastásico del hueso. se detectó expresión intensa AGR-2, lo que sugiere requisito de AGR-2 para el establecimiento de metástasis ósea (Figura 1C).
A. cDNA microarrays mapa de calor que muestra una mayor expresión AGR-2 (rojo) en las células PC3 cultivadas en medio acondicionado de médula ósea en comparación con medio normal (verde). B. Datos en tiempo real de RT-PCR que muestran una disminución significativa (p & lt; 0,05) aumento de AGR-2 expresión en células PC3 después de un crecimiento en la médula ósea normal medio acondicionado (bmcm) en comparación con cuando se cultivan en un medio regular (RM). C. inmunohistoquímico análisis que mostraba intensa AGR-2 inmunotinción en las células de cáncer de próstata humano metástasis en los huesos (Original 400 aumentos).
Determinación de AGR-2 mRNA expresión en varias líneas celulares de cáncer de próstata
relativa expresión de ARNm de AGR-2 se determinó en el hueso PC3 metastásico, líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP y C4-2B y metastásico línea celular de cáncer de próstata Du145 cerebro por RT-PCR. Los resultados indican significativamente más alta expresión AGR-2 en PC3, LNCaP y líneas celulares C4-2B en comparación con la línea celular Du145, lo que sugiere la importancia de AGR-2 en el hueso del cáncer de próstata metástasis (Figura 2A).
A. AGR-2 niveles se determinaron por análisis RT_PCR en diversas líneas celulares de cáncer de próstata humano. Las células PC3 metastásicas óseas tener la expresión de ARNm de AGR-2 más alto, mientras que las células Du145 metastáticos del cerebro tienen la menor cantidad de AGR-2 expresión. B. Desarrollo de AGR-2 células PC3 silenciados. El análisis de Western Blot que muestra regulación a la baja significativa de proteína AGR-2 después de la introducción estable de shRNA constructo de AGR-2 en células PC3. beta-actina se utilizó como control de carga. C. El análisis de inmunofluorescencia comparando AGR-2 expresión en AGR-2 células PC3 silenciados frente a las células de control PC3 (original 400X aumentos).
Determinación de AGR-2 expresión en PC3
Control y PC3
Líneas celulares AGR-2SH
Cantidad de AGR-2 silenciamiento de genes en PC3
AGR-2SH se evaluó por Western Blot (Figura 2B) y la tinción de inmunofluorescencia (Figura 2C ). Más del noventa por ciento de baja regulación de AGR-2 expresión se logró en las células PC3
AGR-2SH si se compara con PC3
Control de las células.
Características de crecimiento alterado de las células PC3 Siguiendo AGR-2 silenciamiento génico
Cuando se analizaron las células PC3 con diferentes niveles de AGR-2 expresión
, no hubo diferencia significativa en las tasas de proliferación entre PC3
AGR-2SH y PC3
control in vitro líneas celulares (Figura 3A). Sin embargo, en cultivos en monocapa, las células control PC3
parecían ser similar a fibroblastos y firmemente unido a la superficie de plástico. Las células se conectan libremente el uno al otro y sólo a través de las extensiones pseudopodial. El PC3
células AGR-2SH por otra parte mantiene fenotipo epitelial más con morfología redondeada o cúbicas y formó un adoquín como aspecto cuando confluente. A diferencia de las células de control PC3
, PC3
células AGR-2SH parecían estar unida débilmente a la superficie de plástico (Figura 3B).
A. ensayo de proliferación celular MTT que muestra las tasas de crecimiento similares en el control PC3
y PC3
AGR2sh células. B. PC3
células de control (arriba) muestran una apariencia similar a fibroblastos con la extensión de pseudópodos-como para los contactos célula-célula. PC3
células AGR2sh (abajo) mostraron una célula epitelial-como más redondeadas fenotipo. Estas células también estaban unidos débilmente a las placas de cultivo en comparación con las células control. La fluorescencia verde en los paneles de la derecha muestra tanto PC3
control y PC3
AGR2sh células GFP constitutivamente expresa debido a la presencia de GFP cassette de expresión de los vectores utilizados para crear el control y líneas de células PC3 silenciados-AGR-2.
AGR-2 promueve adhesión celular
Cuando se compararon PC3
control y PC3 células
AGR-2SH por su capacidad de unirse a diversos matriz extracelular (ECM) proteínas, incluyendo fibronectina, colágeno I, colágeno IV, laminina y el fibrinógeno que utiliza un kit de ensayo de adhesión celular, los resultados indicaron una reducción significativa en la capacidad de PC3
células AGR-2SH a permanecer unidos a todos los componentes de la ECM probado. PC3
AGR-2SH la adhesión a la fibronectina se redujo al máximo (70%), entre otras proteínas ECM, lo que indica AGR-2 influencias vía (s) que promueven la adhesión celular (Figura 4A).
A. propiedades de adhesión de control de PC3
y células PC3 AGR2sh
se evaluaron tras un crecimiento en placas de cultivo recubiertas con diferentes proteínas ECM. En primer lugar, las células se sembraron por duplicado sobre los sustratos revestidos y se dejaron adherir. A continuación, las células no unidas se lavaron de distancia, y las células adherentes se fijaron y se tiñeron. Por último, la mancha se extrajo y se cuantificó por colorimetría. Reducción significativa en la adhesión celular a la fibronectina (*** p & lt; 0,001), colágeno I (** p & lt; 0,01), colágeno IV (*** p & lt; 0,001), laminina (* p & lt; 0,05) y el fibrinógeno (* p & lt; 0,05) se observaron en caso de PC3
AGR2sh células en comparación con las células control PC3
. pocillos recubiertos de BSA se usaron como el control de reactivos (p & gt; 0,1). Los datos aquí presentados son la media ± SEM. B. significativa baja regulación de la a4, a5, alpha v, y beta 3 beta 4 integrinas se observó en PC3
AGR2sh células en comparación con PC3
control de las células. No se observó ninguna diferencia en los niveles de integrina beta 1 entre los dos tipos de células. Beta-actina se utilizó como control de carga. Varias bandas de proteínas presentes en las manchas incluyen precursor de la integrina y proteínas maduras, así como productos escindidos se espera masa molecular de acuerdo con la información del fabricante (Cell Signaling Technology, Cat#4749S).
La pérdida de la expresión de la integrina en las células PC3 a quienes no se AGR-2
heterodímeros de integrina en varias combinaciones son conocidos por mediar en la adhesión celular a la ECM y jugar un papel importante en el crecimiento del tumor y la metástasis [23]. Para determinar si las modulaciones de AGR 2-niveles durante el crecimiento tumoral y la metástasis se asocia con niveles de integrina alterados y función, se determinó la expresión de un grupo de integrinas (a4, a5, alpha v, beta 1, beta 3, beta 4, integrinas beta 5) en PC3
PC3
control de las células por Western Blot y AGR-2SH. Se ha reducido significativamente la expresión de a4, a5, alpha v, y beta 3 beta 4 integrinas se observó en PC3
células AGR-2SH. se observaron cantidades comparables de los niveles de beta 1 integrina en ambas líneas celulares mientras que no integrina β5 se detectó en cualquiera de las líneas de células. Estos datos sugieren fuertemente un papel para AGR-2 en la regulación de la adhesión celular a través de la expresión de la integrina. (Figura 4B).
silenciada-AGR-2 Reducción de la migración de células tumorales en células PC3
Para determinar si la adherencia reducida celular y la expresión de la integrina en las células PC3 silenciados-AGR-2 afectados celular PC3 migración, tanto un ensayo de "cierre de la herida", así como un ensayo de migración de cámara de Boyden se llevó a cabo. Los resultados indicaron redujeron significativamente (p & lt; 0,01) la migración de células tumorales en células PC3 silenciados-AGR-2 en comparación con las células control PC3. Ambos ensayos también sugieren la adhesión celular a través de la expresión de la integrina es crucial para la migración de células tumorales (Figura 5 A & amp; B).
High AGR-2 que expresa PC3
control de las células y baja AGR-2 que expresan PC3
células AGR-2SH se cultivaron en placa de cultivo de 6 así hasta 90% de confluencia. Ellos fueron suero de hambre durante toda la noche y se les permitió emigrar después de la creación de la herida utilizando una punta de pipeta de 200 l y la adición de medio completo fresco. Las fotografías fueron tomadas a las 0 horas y 22 horas para la determinación de la velocidad de cierre de la herida entre las dos líneas celulares. B. Boyden Cámara de ensayo: PC3
células de control y PC3
células AGR-2SH se sembraron en insertos de cultivo celular en medio libre de suero y la migración de las células se estimuló la adición de 10% de FBS como quimioatrayente en la cámara inferior. Después de 6 horas de incubación, las células se retiraron de la parte superior de la pieza de inserción usando un hisopo de algodón y las células en la parte inferior del inserto fueron fotografiados y se contaron. El efecto de silenciamiento AGR-2 sobre la migración celular PC3 se presenta aquí como valores relativos en comparación con el control (100%).
desarrollo de resistencia a TRAIL en células PC3
AGR-2SH
Los experimentos anteriores indicaron silenciados células PC3-AGR-2 mostraron una reducción de la adhesión celular, la expresión de integrina y la migración. Las células epiteliales normales experimentan apoptosis después de la separación de la membrana basal (anoikis), mientras que la resistencia a la anoikis es una de las características de las células cancerosas malignas. Para determinar si AGR-2 silenciamiento ha contribuido a la susceptibilidad a la anoikis, tanto PC3
Control y PC3
se cultivaron células AGR-2SH
in vitro
durante 72 horas en presencia de 0, 12.5, 25, 50 y 100 ng /ml de proteína recombinante soluble TRAIL humana (s). Resultado del experimento se analizó por ensayo de viabilidad celular usando un kit de ensayo de proliferación celular MTS después del tratamiento TRAIL. Aunque no se observó muerte celular en ambos PC3
Control de las células y PC3
células AGR-2SH, las células PC3
AGR-2SH sobrevivieron a la exposición TRAIL significativamente mejor que las células de control PC3
(Figura 6A) sugiriendo pérdida de AGR-2 podría estar asociado con el desarrollo de la resistencia a la anoikis en las células tumorales malignas. La viabilidad celular después de la estimulación sTRAIL también se determinó por tinción de las células con yoduro de propidio (PI).
AGR-células PC3 2SH
control y PC3 se cultivaron
in vitro
durante 12 horas en presencia de 0 ng /ml y una concentración de 100 ng /ml de sTRAIL seguido de tinción PI. El contraste de fases, fluorescentes y las imágenes superpuestas fueron capturados utilizando un microscopio Leica DMI 4000B y se analizaron con el software Image J. Tanto las células vivas y muertas se contaron y las células no viables (PI positivo) se representan como porcentaje del número total de células. Los resultados mostraron células positivas significativamente mayor pi (p & lt; 0,05) en las células control PC3
en comparación con las células PC3
AGR-2SH (Figura 6 B & amp; C). se encuentra la caspasa-3 para ser activado en ambas vías de la muerte celular intrínsecos y extrínsecos y llevar a cabo la fase de ejecución de la apoptosis [24]. Se encontró caspasa-3 sea significativamente menor en las células PC3 silenciados-AGR-2 en comparación con las células control en el análisis de Western blot, que también apoya el desarrollo de la resistencia a la anoikis (Figura 6D). No se observaron diferencias entre el control y células PC3 silenciados-AGR-2 en términos de la caspasa-8, la muerte receptor-5 y la caspasa-9 (datos no mostrados). la actividad de caspasa-3 requiere la escisión proteolítica de la caspasa-3 inactiva hasta 19/17 kDa activa exfoliados caspasa-3 [25]. Para comparar la generación de la caspasa-3 escinde tanto PC3
Control y PC3 células
AGR-2SH se cultivaron en una concentración de 50 ng /ml de sTRAIL durante un periodo de 0 horas, 1 hora, 3 horas y 6 horas. Las células se recogieron por desguace y sedimento celular se lavó con PBS dos veces antes de aislamiento de proteínas. Caspasa-3 y caspasa-3 escinde se determinó mediante Western Blot, que mostraron niveles más altos de ambos péptidos en PC3
Control de las células PC3 en comparación con
células AGR-2SH de una manera dependiente del tiempo (Figura 6D). . Análisis de cáncer de próstata conjunto de datos de expresión génica para el cáncer de próstata primario y metastásico (194 casos), publicado por Taylor et al, 2010 usando CBIOPORTAL indica una odds ratio de 4,25 (intervalo de confianza 1,40 a 12,86; p & lt; 0,02 mediante la prueba exacta de Fisher) entre AGR -2 y la caspasa-3 que sugiere una tendencia a la co-ocurrencia de estas dos moléculas [26].
a. PC3
control y células PC3 AGR2sh
se trataron
in vitro
con varias concentraciones de sTRAIL. La viabilidad celular se ensayó después de 72 horas usando un kit de ensayo de la viabilidad celular. se observó en PC3
control de las células PC3 en comparación con
AGR2sh células; significativamente mayor muerte celular (0,001 p & lt). También se determinó la viabilidad de las células B. después de la exposición sTRAIL entre el control PC3
y PC3
AGR2sh células por tinción PI y la visualización al microscopio de fluorescencia (Original 200 aumentos). Se tomaron fotografías C. múltiples para cada línea celular después del tratamiento sTRAIL y tinción PI. Ambos viven y las células muertas se contaron manualmente utilizando el software Image J y gráficamente representados. D. Análisis de transferencia Western que muestra la caspasa-3 y caspasa 3 escindida-niveles en el control no inducido y la inducida por TRAIL y silenciados células PC3-AGR-2.
Discusión
hace metástasis de cáncer de próstata al hueso y produce lesiones osteolíticas osteoblásticas /, que causan dolor óseo severo, la susceptibilidad a la fractura y la compresión de la médula espinal [27]. cáncer metastásico del hueso es incurable y conduce a una importante morbimortalidad en estos pacientes. La adhesión de las células cancerosas circulantes, exfoliadas dentro de las proteínas ECM de médula ósea es el principal paso necesario para el establecimiento de metástasis ósea [28]. En nuestro estudio de microarrays, la regulación positiva significativa de AGR-2 expresión mRNA siguiente mantenimiento en la médula ósea medio acondicionado sugiere un papel de AGR-2 para facilitar el crecimiento de células de cáncer de próstata en el microambiente de la médula.