Extracto
Antecedentes y Objetivos
La evidencia creciente sugiere que el carcinoma hepatocelular (HCC) podría proceder de una clara subpoblación llamadas células madre del cáncer (CSC), que son responsables de la limitada eficacia de las terapias convencionales. Hemos demostrado previamente que granulina-epitelina precursor (GEP), un factor de crecimiento pluripotentes, es aumentada en el CHC, pero no en la no tumoral adyacente, y que GEP es una posible diana terapéutica para el CHC. A continuación, se caracterizaron su patrón de expresión y propiedades de células madre en el hígado fetal y cancerosas.
Métodos
La expresión proteica de GEP en los hígados fetales y adultos fue examinado en modelos humanos y de ratón mediante tinción inmunohistoquímica y citometría de flujo. líneas celulares de cáncer de hígado, aislado basándose en su GEP y /o dependiente de ATP vinculante cassette de expresión de drogas transportador ABCB5 (ABC), fueron evaluados para propiedades hepáticas CSC en términos de formación de colonias, la quimio-resistencia y tumorigenicidad.
Resultados
Hemos demostrado que la GEP era una proteína hepática oncofetal que se expresa en los hígados fetales, pero no en los hígados adultos normales. Es importante destacar que las células hepáticas fetales GEP + co-expresado las moléculas de señalización relacionadas con las células madre embrionarias (ES), incluyendo β-catenina, Oct4, Nanog, Sox2 y Dlk1, y también hepáticas CSC-marcadores CD133, EpCAM y ABCB5. Caracterización fenotípica en muestras clínicas y líneas celulares de HCC reveló que las células cancerosas GEP + estos marcadores de células madre co-expresó de manera similar como la GEP células de hígado fetal +. Además, se demostró GEP para regular la expresión de moléculas relacionadas con las células de señalización ES β-catenina, Oct4, Nanog, y Sox2. Aislados GEP
pilas de gran cáncer mostraron una mayor capacidad de formación de colonias y quimio-resistencia en comparación con las GEP
homólogos bajas. Co-expresión de GEP y ABCB5 mejor define las poblaciones con mayor capacidad de CSC tumorigénico en ratones inmunodeficientes.
Conclusiones
Nuestros hallazgos demuestran que el GEP es una proteína hepática oncofetal la regulación de moléculas de señalización relacionadas con las células madre embrionarias . Co-expresión de GEP y ABCB5 enriquece aún más una subpoblación con propiedades mejoradas CSC. Los datos actuales proporcionan una nueva visión de la estrategia terapéutica
Visto:. Cheung OPU, Cheng CKC, Wong NCL, Ho JCY, Yip CW, Lui VCH, et al. (2011) Granulina-epitelina Precursor es una proteína oncofetal Definición de células madre del cáncer hepático. PLoS ONE 6 (12): e28246. doi: 10.1371 /journal.pone.0028246
Editor: joven Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, República de Corea
Recibido: 2 de Junio, 2011; Aceptado: 4 de noviembre de 2011; Publicado: 16 de diciembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Cheung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por Sun CY Fundación de Investigación para hepatobiliar y Cirugía de páncreas, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China y el Consejo de Ayudas a la Investigación de Hong Kong (N_HKU 709/07, HKU7 /CRG /09), el Programa de capital semilla y de la Pequeña Programa de Financiación de Proyectos de la Universidad de Hong Kong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC), la tercera causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo, es una enfermedad altamente maligno con ningún tratamiento eficaz actualmente [1]. Si bien los mecanismos moleculares de HCC patogénesis siguen siendo en gran parte desconocida, HCC se considera una enfermedad heterogénea debido a sus perfiles moleculares múltiples y los resultados clínicos variados [2]. La naturaleza heterogénea de HCC y la falta de biomarcadores adecuados han impedido el pronóstico y el tratamiento del paciente.
Durante años, la heterogeneidad de las células tumorales ha sido explicada por el modelo de evolución clonal [3]. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que los tumores están jerárquicamente organizados con una subpoblación distinta llamadas células madre del cáncer (CSC) se extiende en la cúspide de la jerarquía. Estas células no sólo son responsables de la iniciación y progresión del tumor, sino también dotados de propiedades de células madre, incluyendo la auto-renovación, la capacidad de diferenciación y quimio-resistencia [4]. Aunque las terapias existentes pueden eliminar inicialmente la población mayor de tumor, las propiedades de células madre de células madre cancerosas les permiten sobrevivir y repoblar el tumor, lo que resulta en la recaída de la enfermedad [5].
El concepto de los CAC se ha documentado en diversos tumores malignos como el de mama [6], de colon [7] y el cáncer de hígado [8], [9]. A pesar de los recientes avances en la identificación CSC hepática, sigue siendo en gran parte desconocido origen exacto de estas células. Tumorigénesis y la embriogénesis se sabe que comparten muchas propiedades comunes incluyendo la plasticidad celular, la motilidad celular dinámico [10] y la convergencia de las rutas de señalización, lo que sugiere una posible relación entre las células embrionarias y el cáncer [11]. Curiosamente, el concepto de CSC es notablemente similar a la teoría del "resto embrionario", que fue propuesta en base a las similitudes histológicas de tejidos embrionarios y cancerosas, lo que sugiere que los tejidos adultos contienen restos embrionarios que normalmente permanecen latentes, pero se puede activar para convertirse en cancerosas [12]. Por lo tanto, la identificación de la molécula clave que subyacen a la comunidad de células madre embrionarias (ES) y las células tumorales podría dar lugar a nuevas estrategias terapéuticas para suprimir la transformación maligna de las células madre normales, o erradiquen la células madre cancerosas.
Granulina-epitelina precursor (GEP, también llamado progranulina, proepithelin, acrogranin, o factor de crecimiento derivado de PC) es un factor de crecimiento pluripotentes la regulación del desarrollo fetal [13], la reparación de tejidos [14] y la tumorigénesis en diversos tipos de cáncer [15]. Se encontró para regular eventos de desarrollo, incluyendo la cavitación en los embriones de preimplantación de ratón [16] y la diferenciación cerebro masculino-específica del hipotálamo de ratas neonatales [17]. Anteriormente, hemos demostrado la sobreexpresión GEP en la mayoría de los especímenes de HCC humanos [18], [19] y su papel en la regulación de la proliferación celular HCC, la invasión y la tumorigenicidad [19]. Por otra parte, la neutralización de GEP podría inhibir el crecimiento de HCC establecido [20]. A pesar del considerable interés en su doble función en la embriogénesis y la tumorigénesis, la información de su patrón de expresión y las funciones biológicas en el hígado es todavía escasa.
En este estudio, se presenta por primera vez que la GEP es una proteína hepática que oncofetal regula la expresión de moléculas relacionadas con las células madre de señalización β-catenina, Oct4, Nanog y Sox2. Los estudios funcionales confirmaron que las células que expresan GEP poseían una mayor capacidad en la formación de colonias y quimiorresistencia. Además, las células de cáncer de co-expresión de GEP y dependiente de ATP casete de unión B5 (ABC) demostraron mejoraron la capacidad tumorigénico en ratones inmunocomprometidos. Nuestros resultados son cruciales no sólo para la comprensión del desarrollo del hígado fetal, sino también para la construcción de terapias específicas dirigidas a GEP y ABCB5 para erradicar las células madre cancerosas chemoresistant en pacientes con HCC.
Materiales y Métodos
ensayos de células
líneas celulares de cáncer de hígado humano, Hep3B y HepG2, se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [19], [20]; mientras Huh7 se adquirió de Ciencias de la Salud de Investigación de Recursos Bank (Osaka, Japón) y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los transfectantes estables para GEP sobreexpresión y la supresión se han descrito [19]. GEP bloqueo en Hep3B se realizó mediante la incubación de las células con o sin 50 mg A23 /ml anti-GEP anticuerpo monoclonal (hecho en casa, se ha descrito previamente [20] o IgG de ratón anticuerpo de control de isotipo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para 24 h.
muestras clínicas
el protocolo de estudio fue aprobado por el Consejo de la Universidad de Hong Kong /Autoridad de Hospitales de Hong Kong West Cluster (HKU /hA HKW IRB) de Revisión Institucional. Seis pacientes fueron sometidos hepatectomía parcial curativo o el trasplante de hígado por hepatocarcinoma en el hospital Queen Mary, Hong Kong, fueron reclutados con el consentimiento informado por escrito para el estudio. los pacientes habían sido diagnosticados de carcinoma hepatocelular primario y confirmada por exámenes patológicos. la edad de los pacientes comprendidas entre los 42 67 años, con una edad mediana de 60 años. había 4 hombres y 2 mujeres, y todos eran portadores del virus B de la hepatitis. El tamaño de los tumores varió de 3,5 a 19,5 cm, con un tamaño medio de 8,3 cm. en particular, cada espécimen tiene número limitado de células (pequeña muestra de investigación para asegurar ninguna interferencia con el examen patológico) y por lo tanto no es suficiente para el panel completo de análisis de la expresión de marcadores de células madre. Los datos de expresión de cada marcador presentan los datos promedio de al menos cuatro muestras. El espécimen normales del hígado se obtuvo a partir de donantes de órganos durante la operación de trasplante, y el donante no tenían enfermedad hepática subyacente y fue negativo en la prueba de serología de la hepatitis B. La muestra de hígado fetal se obtuvo de recuperación de bloque de parafina embebido fijados con formol y archivado de tejido tomada durante un examen patológico de la rutina abortus después de aborto involuntario espontáneo a las 10 semanas y 6 días. Ética aprobación para el uso de tejidos fetales archivados identificados a partir de una base de datos informática se ha obtenido de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong /Hospital de Hong Kong Autoridad West Cluster (HKU /HA HKW IRB).
Ratón especímenes
se recogieron los hígados de adulto, neonatal y ratones ICR fetales y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité para el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación de la Universidad de Hong Kong (Aprobación de Referencia Nº 1968 CULATR -09). Para el aislamiento de hepatocitos de ratón, los hígados se picaron y se digirieron con colagenasa tipo IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Después de la filtración y la lisis de las células rojas de la sangre, se contaron las células para la tinción de inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). Las células aisladas de hígados de embriones se tiñeron con anticuerpo anti-AFP (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) y el anticuerpo anti-albúmina (R & amp; D Systems) para distinguir los hepatocitos para la posterior caracterización de células GEP-expresan
la inmunohistoquímica
la inmunohistoquímica se realizó en las secciones incluidas en parafina fijadas con formalina con sistema Dako Envision Plus (Dako, Carpinteria, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante con modificaciones como se describe [18], [19].
la tinción de inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo
Para la expresión de GEP, ABCB5, β-catenina, Oct4, Sox2, Nanog y Dlk1, las células se permeabilizaron con helado de saponina al 0,1% y luego incubadas con FITC ratón conjugado anti-humano GEP (descrito anteriormente [20]), de cabra conjugada ABCB5 anti-humana (Everest Biotech Ltd, Oxfordshire, Reino Unido), Alexa Fluor 647 de ratón conjugado anti-humano β-catenina, PerCP-Cy5.5 conjugado ratón anti-humano Oct4, Alexa Fluor ratón 647 conjugado con anti-Sox2, ratón conjugado con PE anti-humano Nanog (BD Biosciences), rata conjugado anti-DLK-1 (MBL International, Woburn, MA), o la misma cantidad de correspondientes anticuerpos de control de isotipo. Para ABCB5 y DLK1, las células se incubaron con NorthernLights (NL) burro 557 conjugado anti-IgG de cabra o anticuerpo secundario de cabra NL637 conjugado anti-IgG de rata anticuerpo secundario, respectivamente, antes de la tinción con el anticuerpo anti-GEP. Para CD133 y expresión en la superficie EpCAM, las células se tiñeron con el ratón APC conjugado anti-humano CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), ratón APC conjugado con EpCAM anti-humano (BD Biosciences) o la misma cantidad de anticuerpos de control de isotipo correspondiente, antes de la permeabilización y tinción con anticuerpos anti-GEP.
Cell Ordenando
El aislamiento de GEP- y /o células que expresan ABCB5 se llevó a cabo por células activadas clasificación magnética (Miltenyi Biotec) de acuerdo con el fabricante del instrucciones. Brevemente, las células se marcaron con GEP ratón conjugado con FITC anti-humana (descrito anteriormente [20]) o conejo ABCB5 anti-humano conjugado con biotina (Rockland, Gilbertsville, PA) de anticuerpos, y después se incubaron con anti-FITC o anti-biotina microperlas magnéticas (Miltenyi Biotec), seguido de separación magnética. Tenga en cuenta que las células se ordenan en función de la expresión superficial de GEP y ABCB5, pero no en su expresión intracelular, debido a la permeabilización no era factible para mantener las células viable para ensayos funcionales posteriores. Después de aislamiento de células, 2.000.000 de cada población según se recogieron para evaluar la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano y la pureza por citometría de flujo utilizando el ratón anti-humano GEP (R & amp; D Systems) o de cabra ABCB5 anti-humana (Everest Biotech) anticuerpo que reconoce epítopos diferentes de los anticuerpos utilizados para la clasificación de células. Las células fueron teñidas con conejo conjugado con PE anti-ratón de burro o NL557 conjugado de cabra anti-anticuerpo secundario IgG de GEP o ABCB5, respectivamente. Para la evaluación de la pureza de células por citometría de flujo, las células clasificadas se permeabilizaron antes de la tinción de modo que la expresión total de GEP y ABCB5 de las poblaciones clasificadas se pudo determinar. Post-análisis de clasificación general se indica el grado de pureza de & gt; 80% con la muerte celular mínima (& lt; 10%).
acumulación de doxorubicina y apoptosis
Las células se incubaron con o sin 0,5 mg /ml de doxorrubicina durante 24 horas. la acumulación intracelular de doxorubicina se analizó mediante citometría de flujo en el espectro FL2; mientras que la apoptosis celular se determinó por Anexina V-FITC (FL1) y yoduro de propidio (PI) (FL2) tinción y análisis de citometría de flujo.
Colonia ensayo de formación de
células recién aisladas se sembraron a una densidad de 1000 células /pocillo y se dejaron crecer durante 10 días. La formación de colonias se evaluó mediante un ensayo colorimétrico usando un cristal violeta (Sigma Aldrich).
En vivo
experimentos de carcinogénesis
Se utilizaron ratones BALB /c atímicos ratones desnudos de 5 semanas de edad para probar la
in vivo
potencial tumorigénico de las células. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité para el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación de la Universidad de Hong Kong. Varios números de células se inocularon por vía subcutánea en la región dorsal del tronco de cada animal. Los ratones fueron sacrificados entre 8 y 16 semanas después de la inyección, en el que los tumores se recolectaron un examen más detenido. Esos ratones inyectados con células de HCC, pero sin ningún signo de la carga tumoral se terminaron generalmente 5 meses después de la inyección de células.
Los análisis estadísticos
Todos los datos se expresan como valores medios ± desviación estándar (SD) a partir de al menos tres experimentos independientes. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. Una probabilidad (p) & lt; 0,05 se consideró significativamente diferente. Todos los análisis se realizaron utilizando el software estadístico GraphPad Prism para Windows, versión 3.00 (GraphPad Software, CA, EE.UU.).
Resultados
GEP es una proteína hepática oncofetal
Anteriormente , GEP mRNA se informó en el hígado de embriones de ratón [13], pero si GEP se traduce en proteínas y se ignora la hora de encendido /-off durante el desarrollo del hígado. Dado que el hígado fetal tiene un montón de células madre hematopoyéticas, además de hepatocitos fetales, que necesitamos para identificar el tipo (s) celular que expresa GEP. Aquí, describimos por primera vez el patrón de expresión de la proteína de GEP en hígados humanos y de ratón. Por tinción inmunohistoquímica, se detectó proteína GEP en el ratón y los hígados fetales humanos, mientras que los hígados adultos carecían de GEP-expresión de los hepatocitos (Figura 1A).
(A) El análisis inmunohistoquímico que muestra la proteína GEP en el hígado fetal de ratón ( día embrionario 17,5) y humano (10 semanas 6 días), pero no en los hígados adultos (aumento x 400). (B) Los análisis de citometría de flujo que demuestra la expresión de marcadores de GEP y de células madre hepática en los hepatocitos embrionarios de ratón. La co-expresión de GEP y marcadores de células madre hepáticas CD133, EpCAM, DLK1 y β-catenina se realizaron por cuádruple color citometría de flujo, gating en la AFP + y /o hepatocitos de albúmina + de hígados de embriones. Las células co-expresan los marcadores respectivos se muestran en el cuadrante superior derecho de gráficos de puntos. Los datos se expresan como porcentaje medio de células + SD.
En el modelo de ratón, con el fin de distinguir la expresión GEP específicamente en hepatocitos, el análisis de nivel GEP se realizó por triple color de citometría de flujo, gating en AFP + y /o albúmina + de hepatocitos en todo el estado de desarrollo. La inclusión de AFP + y /o células de albúmina + en todas las etapas de desarrollo podría reflejar mejor la población de hepatocitos en el hígado debido a que la proporción de células AFP + + y células de albúmina eran diferentes en los hígados de embriones, neonatos y adultos (Figura S1). expresión GEP aumentó gradualmente de E11.5 de embriones días (14,8% + 6,9%) a E17.5 (30,8 + 9,2%). Inmediatamente después del nacimiento, nivel de GEP disminuyó abruptamente desde el día 1 (4.4 + 1.5%) para day7 (1,2 + 0,4%), y llegó a ser casi indetectable en hígados de ratones adultos (0,9 + 0,4%) (Figura S1). Junto con nuestros hallazgos anteriores de que el GEP se expresa en la mayoría de las muestras de HCC, pero no en los tejidos hepáticos no tumorales adyacentes [18], [19], se confirmó que era una proteína GEP oncofetal hepática.
Para caracterizan a la firma de células madre de GEP + hepatocitos fetales, hemos examinado la co-expresión de GEP y varios de células madre hepáticas o detener marcadores relacionados con las células, incluyendo CD133, EpCAM, Dlk1 y β-catenina [21], [22], [23] , [24] en los hígados de embriones (Figura 1B). Hepatoblastos tendrían los cambios de serie a lo largo de las etapas de desarrollo y dar lugar a hepatocitos y cholangiocytes. En el día embrionario 11.5 (E11.5), expresiones de CD133, EpCAM, Dlk1 y β-catenina fueron altas en los hepatoblastos y la mayoría de las células GEP-positivos todos estos marcadores de células madre hepáticas co-expresan. En E13.5, expresiones de CD133 y EpCAM comenzaron a declinar y la mayor parte del CD133 + o EpCAM + células se observaron para co-expresa GEP. Para DLK1 y β-catenina, sus niveles de expresión se mantuvo alta en E13.5 y la mayoría de las células que expresan GEP-también fueron positivos para ambos marcadores. En E17.5, la expresión de CD133, EpCAM, Dlk1 y β-catenina se redujeron a niveles bajos, mientras que la expresión GEP alcanzó el pico en esta etapa. La discrepancia de las tendencias de expresión entre GEP y estos marcadores de células madre podría atribuirse a las propiedades del factor de crecimiento de GEP. Aunque se necesita más investigación para dilucidar el mecanismo subyacente al patrón de expresión de GEP, la co-expresión de GEP con estas células madre hepáticas o marcadores relacionados con las células madre sugiere un fenotipo de células madre de las células que expresan GEP.
La expresión GEP en los hepatocitos de ratón fue investigada por nuestra A23 anticuerpo anti-GEP hecho en casa. La especificidad de A23 fue examinado por Western blot (Figura S2 y el resultado mostró que podía reconocer la GEP ratón como una sola banda de la embrionario extracto de proteína de hígado de ratón. Por otra parte, el patrón de expresión GEP como se muestra en la transferencia Western fue consistente con el flujo de citometría de datos en ese nivel de proteína aumentó de GEP E11.5 y E13.5 a E17.5, proporcionando datos consistentes para reflejar la expresión GEP en los hígados de embriones.
caracterización fenotípica de las células que expresan GEP en el CHC
Para caracterizar mejor si las células GEP-expresan tenían las propiedades de células madre en el CHC, se analizó la co-expresión de GEP y un panel de marcadores de células madre usando citometría de flujo en las líneas celulares de HCC humano Hep 3B y Huh7. marcadores examinados incluyen precursoras hematopoyéticas marcadores de superficie celular CD31, CD34, CD117, precursor hepática marcador de superficie celular CD123, marcadores de superficie celular CD24, CD29, los marcadores hepáticos superficie CSC CD44, CD90, CD133, EpCAM, ES moléculas de señalización relacionadas con las células β-catenina se derivan, Oct4, Sox2 y Nanog, ABC transportadores de fármacos y ABCC1 ABCB5. Tenga en cuenta que también se incluyeron transportadores de fármacos ABC porque tanto las células madre normales y cancerosas expresan un mayor nivel de transportadores de fármacos ABC, contribuyendo a una mayor resistencia a los agentes quimioterapéuticos que las células diferenciadas [4], [21]. Entre los marcadores investigados, se demostró que las células GEP + a preferentemente co-expresa con β-catenina, Oct4, Nanog, Sox2, CD133 y EpCAM en comparación con las células GEP- tanto HCC líneas de células Hep3B (Figura S3) y Huh7 (Figura S4 ). Por tanto, nuestros hallazgos sugieren una característica de células madre de las células GEP expresan en las células del hígado tanto embrionarias y cancerosas.
GEP regula la expresión de marcadores de células madre
modulan los niveles de expresión en las células Hep 3B GEP por el enfoque de la transfección y se investigó si se vean afectados los niveles de proteína de los marcadores de células madre. Los resultados mostraron que la sobre regulación de nivel GEP mejorado, mientras que la supresión del nivel de GEP disminuyó la expresión de β-catenina, Oct4, Nanog, Sox2 y ABCB5 (Tabla 1). La modulación de los niveles de GEP no cambió la expresión de marcadores de superficie de células madre hepática CD133 y EpCAM. La razón podría ser debido al hecho de que la mayoría de las células Hep 3B fueron positivos para CD133 y EpCAM (mayor que 95%), por lo que el cambio de una molécula (por ejemplo GEP) podría no ser capaz de cambiar la población. Mientras GEP se ha informado anteriormente por nuestro grupo para regular ABCB5 para mediar en la quimio-resistencia en células de HCC [25], la correlación positiva entre el GEP y β-catenina, Oct4, Sox2 y Nanog sugirió que GEP podría regular la expresión de estos relacionada con células ES moléculas de señalización para mantener la pluripotencia de las células madre.
a fin de validar el papel regulador del GEP en la expresión de estas moléculas de señalización, el bloqueo GEP GEP por anti-A23 anticuerpo monoclonal se realizó en células Hep 3B ( Tabla 2). A23 fue encontrado para reducir significativamente los niveles endógenos de GEP en células Hep 3B. GEP obstrucción también suprimió significativamente la expresión de β-catenina, Oct4, Sox2 y Nanog, lo que confirma el papel regulador del GEP en la expresión de estas moléculas de señalización relacionadas con las células madre.
GEP células que expresan poseen propiedades CSC
in vitro
Para caracterizar mejor las propiedades de células madre de las células que expresan GEP, GEP
alto y GEP
subpoblaciones bajas fueron aisladas de líneas celulares de cáncer de hígado humano Hep3B, HepG2 y Huh7, y se examinaron para la expresión de marcadores de células madre utilizando citometría de flujo. Las células se ordenan en función de la expresión superficial de GEP, pero no en su expresión intracelular, debido a la permeabilización no era factible para mantener las células viable para ensayos funcionales posteriores. Después de aislamiento de células, se recogió 2.000.000 de cada población ordenados para evaluar la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano y la pureza por citometría de flujo usando un anticuerpo anti-GEP diferente que reconoce epítopos distintos de los anticuerpos utilizados para la clasificación de células. La pureza de los GEP
subpoblaciones bajas y altas GEP eran aproximadamente 80% a 90%, respectivamente, según lo revelado por el análisis de clasificación de mensaje (Figura 2A). GEP
se encontraron pilas de gran expresar mayores niveles de células madre embrionarias relacionadas con moléculas de señalización beta-catenina, Oct4, Nanog, Sox2 y ABC ABCB5 transportador de drogas que GEP
bajas equivalentes en las tres líneas celulares de HCC (Figura 2B) . Para hepática CSC CD133 marcador de superficie, expresión en la superficie superior en GEP
pilas de gran que GEP
bajo contraparte se encontró en HepG2 y Huh7, pero no Hep3B, que era probablemente debido al nivel extremadamente alto de CD133 (& gt; 95 %) expresada constitutivamente en las células Hep 3B (datos no mostrados). Para EpCAM, no se observó expresión en la superficie superior en GEP
alta de GEP
poblaciones bajos en Huh7, pero no Hep3B y HepG2, en el que la mayoría de las células; se encontraron para expresar EpCAM (& gt 95%). Los datos son, por tanto, coherente con los hallazgos previos de que las células asociadas con expresiones de marcadores de células madre en comparación con las células negativas GEP GEP-expresan
.
(A) expresión en células GEP Hep3B, HepG2 y Huh7 sin clasificar, y el recién aislado GEP
alta, y GEP
subpoblaciones bajas después de la clasificación de células. Las células se ordenan en función de la expresión de superficie de GEP, pero no en su expresión intracelular, con el fin de mantener las células viable para ensayos funcionales posteriores. Después de aislamiento de células, 2.000.000 de cada población ordenados se recogió para evaluar la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano y la pureza de las subpoblaciones según citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-GEP diferente (reconociendo epítopos distintos en comparación con los anticuerpos utilizados para la clasificación de células ). Los datos se expresan como porcentaje medio de células GEP + ± SD. niveles (B) Expresión de proteínas de marcadores de células madre β-catenina, Oct4, Nanog, Sox2 y ABCB5 en las subpoblaciones según se midió mediante tinción intracelular y análisis de citometría de flujo. Los datos se expresan como media del porcentaje de células positivas ± SD. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con GEP
células bajas. (C) Colony eficiencia de formación de GEP
altos subpoblaciones fueron superiores a sus respectivos
células Hep 3B y HepG2 bajas y sin ordenar GEP. (D, E) Después de la exposición a la doxorrubicina (0,5 mg /ml durante 24 h), GEP
altos subpoblaciones retenido significativamente menos doxorrubicina y menos apoptosis de las células de GEP
células bajas y sin ordenar Hep3B y HepG2. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001 en comparación con los controles sin ordenar
para determinar si las células se enriquecieron GEP-expresión de los CAC, se comparó el potencial tumorigénico y propiedades de células madre de GEP
pilas de gran con sus homólogos
células in vitro Hoteles en Hep3B y HepG2, que representan líneas celulares de alta y baja GEP que expresan, respectivamente. Clonogenicidad de las células se evaluó por el ensayo de formación de colonias. GEP
pilas de gran Hep3B fueron capaces de formar colonias significativamente más en comparación con el GEP
células de baja y el control sin clasificar. observación similar se muestra con una célula de cáncer de hígado independiente HepG2 (Figura 2C).
Para examinar el papel de GEP en la quimiorresistencia, las células se incubaron con doxorrubicina y evaluaron para la acumulación intracelular de los fármacos y la apoptosis celular. GEP
altos subpoblaciones, tanto en las células Hep3B y HepG2, demostró la captación de doxorrubicina significativamente menor (Figura 2D) y la apoptosis celular (Figura 2E), en comparación con el control sin clasificar; mientras GEP
subpoblaciones bajas mostraron una mayor absorción de la doxorrubicina y la apoptosis de las células en comparación con las poblaciones sin clasificar.
GEP
+ highABCB5 células demuestran mayor capacidad de formación de colonias y quimio-resistencia
De acuerdo con CSC hipótesis, los CCC representan solamente una población rara de tumor [4]. Esto implica que GEP
alta subpoblación sigue siendo heterogénea, y, posiblemente, consiste en subconjuntos con potenciales tumorigénicas diferenciales. Por lo tanto, hemos tratado de diseccionar la GEP
alta población por marcador adicional de co-expresión.
En las células Hep 3B, la mayoría de las células ABCB5 + expresó GEP, pero sólo un subconjunto de células GEP + fueron ABCB5 + (Figura 3A, panel izquierdo). Además, hemos demostrado recientemente que ABCB5 regulados marcadores de células madre del cáncer hepático CD133 y EpCAM [21]. Por lo tanto, la hipótesis de que el GEP en combinación con ABCB5 podría definir con mayor precisión la población hepática CSC.
(A) GEP y la expresión en células Hep 3B ABCB5 sin clasificar, y la recién aisladas GEP
+ highABCB5, GEP
highABCB5- y GEP
lowABCB5- subpoblaciones. Las células se ordenan en función de la expresión superficial de GEP y ABCB5. Después de aislamiento de células, 2.000.000 de cada subpoblación ordenados se recogió para evaluar la pureza por citometría de flujo usando diferentes anticuerpos anti-ABCB5 que reconocen epítopos distintos de los de los anticuerpos utilizados para la clasificación de células anti-GEP y. Tenga en cuenta que la mayoría de las células ABCB5 + + también fueron GEP, por lo tanto no había GEP
lowABCB5 + células (panel izquierdo). La media de porcentaje de células ± SD se muestra en cada cuadrante. (B) de la colonia eficiencia de formación de GEP
+ highABCB5 subpoblación fueron superiores a GEP
highABCB5-, GEP
lowABCB5- y células no clasificadas. (C, D) Después de la exposición a la doxorrubicina (0,5 mg /ml para 24 h), GEP células
highABCB5 + retenido significativamente menos doxorrubicina y menos apoptosis de las células que las otras subpoblaciones. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con los controles no clasificados;#
P Hotel & lt; 0,05,##
P Hotel & lt; 0,01,###
P
. & Lt; 0,001 entre los grupos indicados por líneas horizontales
Se aislaron GEP
+ highABCB5, GEP
highABCB5- y GEP
lowABCB5- células de Hep3B. Las células se ordenan en función de la expresión superficial de GEP y ABCB5, pero no en su expresión intracelular, debido a la permeabilización no era factible para mantener las células viable para ensayos funcionales posteriores. Después de aislamiento de células, las subpoblaciones según se evaluó la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano y la pureza por citometría de flujo usando diferentes anticuerpos anti-ABCB5 que reconocen epítopos distintos de los anticuerpos utilizados para la clasificación de células anti-GEP o. se obtuvo al menos el 80% de pureza en cada subpoblación (Figura 3A) y su potencial tumorigénicos se examinaron ambos
in vitro
y
in vivo
.
GEP
+ highABCB5 células demostraron la inducción de un mayor número de colonias, mientras que la GEP
highABCB5- células mostraron capacidad intermedia para formar colonias pero aún significativamente más altos que el control sin clasificar. Es importante destacar que, GEP
lowABCB5- subpoblación era casi incapaz de formar colonias (Figura 3B).
Tras la exposición a la doxorrubicina, GEP
+ highABCB5 células demostrado significativamente más bajo nivel de absorción de la doxorrubicina y la apoptosis de las células en comparación con GEP
highABCB5- células, y el control sin clasificar. Por el contrario, GEP
lowABCB5- células son muy sensibles a la doxorubicina en términos de acumulación del fármaco y la apoptosis de las células (Figura 3C y D)
GEP
highABCB5 + células son más tumorigénico
in vivo
experimentos desarrollo de tumores utilizando GEP
+ y highABCB5 GEP
lowABCB5- subpoblaciones aisladas a partir de células Hep 3B se realizaron en ratones desnudos inmunodeficientes. Todos los ratones inyectados con GEP
+ highABCB5 células desarrollaron tumores. Los ratones inyectados con 1 x 10
6 células positivas dobles tumores formados dentro de 2 a 4 semanas después de la inoculación. Por el contrario, sólo 2/10 ratones inyectados con GEP
lowABCB5- células generadas relativamente pequeños tumores y requiere más tiempo de latencia (12 semanas) (Figura 4A y B).
(A) ratones Nude inyecta por vía subcutánea con GEP
+ y highABCB5 GEP
lowABCB5- células después de 8 semanas. El panel derecho muestra los tumores subcutáneos derivados de 2,5 × 10
5 GEP
highABCB5 + y 1 × 10
6 GEP
lowABCB5- células en la semana 16. (B) tumorigenicidad de GEP
highABCB5 + y GEP
lowABCB5- células.