Extracto
Antecedentes
asociación epidemiológica de cáncer de cabeza y cuello con tabaco sin humo (ST) hace hincapié en la necesidad de desentrañar los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo del cáncer, e identificar agentes farmacológicamente seguras para principios intervención y prevención de la recurrencia de la enfermedad. Guggulsterone (GS), una biosafe nutracéutico, inhibe la vía PI3K /Akt que juega un papel crítico en el desarrollo CECC. Sin embargo, el potencial de GS para suprimir ST y la nicotina (principal componente del ST) inducida CECC permanece sin explorar. La hipótesis de GS pueden derogar los efectos de la nicotina ST y sobre la apoptosis en las células HNSCC, en parte, por la activación de la vía PI3K /Akt y de los objetivos, Bax y Bad.
Métodos y Resultados
nuestros resultados mostraron ST y el tratamiento de nicotina dio lugar a la activación de PI3K, PDK1, Akt, y sus proteínas downstream - Raf, GSK3 y ps6 mientras GS indujo una disminución dependiente del tiempo en la activación de la vía PI3K /Akt. ST y el tratamiento de nicotina también dio lugar a la inducción de la fosforilación malo y Bax, el aumento de la asociación de Bad con 14-3-3ζresulting en su secuestro en el citoplasma de las células de cáncer de cabeza y cuello, bloqueando así su función pro-apoptótica. En particular, GS pretratamiento inhibe la activación ST /nicotina inducida por la vía PI3K /Akt, y se inhibe la fosforilación mediada por Akt de Bax y Bad.
Conclusiones
En conclusión, el tratamiento GS no sólo inhibieron proliferación, la apoptosis, pero también inducida por la derogación de los efectos del ST /nicotina en vía PI3K /Akt en células de cáncer de cabeza y cuello. Estos resultados proporcionan un fundamento para el diseño de futuros estudios para evaluar el potencial quimiopreventivo de GS en /de cabeza y cuello de la nicotina asociada ST
Visto:. Macha MA, Matta A, Chauhan SS, Siu modelo OC, Ralhan R (2011 ) Guggulsterona Objetivos tabaco sin humo inducida por PI3K /Akt en células de cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 6 (2): e14728. doi: 10.1371 /journal.pone.0014728
Editor: Madhuri Kango-Singh, Universidad de Dayton, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Julio, 2010; Aceptado 14 de diciembre de 2010; Publicado: 24 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Macha et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Un Muzafar . Macha es un beneficiario de una Beca de Investigación senior del Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), Nueva Delhi, India. Ajay Matta es el beneficiario de una beca de MITACS Accelerate, Ontario, Canadá. Ranju Ralhan reconoce y agradece el apoyo del Centro José y Mildred Sonshine de cabeza y enfermedades del cuello, Alex y Simona Laboratorio Shnaider de Oncología Molecular, Temmy Latner /Dynacare, y el Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello, Hospital Monte Sinaí, Universidad de Toronto . K. W. Michael Siu reconoce fondos del Instituto de Ontario para la Investigación del Cáncer (OICR), y el apoyo de infraestructura de la Ontario Investigación y Desarrollo Challenge Fund y AB Sciex. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo con las tasas de supervivencia de cinco años de alrededor del 50%, marcado por la repetición frecuente o formación de segundos tumores primarios (10-25% de casos) [1], [2]. A escala global, el uso de productos de tabaco es el principal factor de riesgo, con el tabaco sin humo (ST) el consumo se vincula a la alta incidencia de HNSCC [3] - [5]. ST se utiliza en múltiples formas a saber naswar, gutkha, khaini (una mezcla de ST con cal) y tiene o con betel, ha clasificado como un carcinógeno humano por la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer (IARC) [6], [7] . La asociación entre el tabaquismo y CECC es bien conocida, pero se observa la relación entre el uso del ST y cáncer de cabeza y cuello. En un informe reciente, Stepanov
et al.
[8] identificado 23 hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en ST, además de las nitrosaminas y la nicotina según lo informado en estudios anteriores [7]. La nicotina mejora la proliferación, acelera el crecimiento del tumor e inhibe la apoptosis en ciertos tipos de líneas celulares de cáncer humano e induce angiogénesis in vivo por la activación sostenida de las vías mitogénicas [9] - [11]. La nicotina ha sido reportado para inhibir la apoptosis inducida por opioides y el estrés genotóxico inducida por etopósido, cisplatino, o irradiación UV en células de cáncer de pulmón [12], [13]. Además, la nicotina activa vía PI3K /Akt e inhibe las funciones pro-apoptóticos de Bax y Bad través de la fosforilación [14], [15]. Estos resultados nos llevó a investigar si ST (khaini) induce /Akt activación de la vía PI3K en células de cáncer de cabeza y cuello.
Además, la identificación de los agentes quimiopreventivos farmacológicamente seguras que puede suprimir PI3K inducida ST /nicotina /Akt en CECC es probable que tenga el potencial de prevenir la cabeza ST inducida por la carcinogénesis y el cuello. Guggulsterone (GS), (4,17 (20) 3,16 -pregnadien--diona), un componente de la planta medicinal ayurvédica india
Commiphora
es un nutracéutico biosafe con propiedades anti-neoplásicas [16] - [18]. GS se ha informado de inducir apoptosis, suprimen la proliferación de, la invasión, la angiogénesis, la metástasis y la resistencia a los medicamentos inversa, por lo que es un agente anti-cáncer complementaria potencial [19] - [24]. GS se une a FXR y se ha demostrado para modular la expresión de las proteínas implicadas en la apoptosis (IAP1, XIAP, Bfl-1 /A1, Bcl-2, cFLIP, survivin), la proliferación celular (ciclina D1, c-Myc), la angiogénesis y la metástasis (MMP-9, la COX-2, VEGF) [25]. Este esterol ejerce sus efectos biológicos por la regulación de factores de transcripción - factor nuclear kappa B (NFkB), STAT-3 y C /EBP alfa, y los receptores de esteroides - receptores de glucocorticoides y receptor de andrógenos. Nuestro grupo y otros han demostrado recientemente la actividad anticancerígena de GS en HNSCC y líneas celulares de mieloma por inhibición de NFkB y STAT3; estudios posteriores reportaron efectos similares en otras líneas celulares de cáncer y en modelos animales de cáncer de colon y cáncer de piel [19], [24], [26].
En este estudio, se determinó la activación de la vía PI3K /Akt en células de cáncer de cabeza y cuello en tratamiento con ST /nicotina y su inactivación por GS. Además desafiamos a la activación de Akt y de los objetivos (ps6, GSK3 y Raf), por ST /nicotina en las células de cáncer de cabeza y cuello (SCC4) por pre-tratamiento con GS.
Resultados
Efecto de ST y la nicotina activa la vía PI3K /Akt en células de cáncer de cabeza y cuello
las dosis y el tiempo cinética de ST y la nicotina (componente adictivo del tabaco) tratamiento de las células del cáncer de cabeza y cuello (SCC4 y HSC2 ), se determinaron mediante el ensayo de MTT (Figura 1A y 1B). cinética similar se observó en ambas líneas celulares y los resultados para las células SCC4 se muestran en la Figura 1. La exposición a ST y la proliferación celular aumentado nicotina en tanto las líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello de una manera dependiente de la dosis con una dosis óptima de 20 mg /ml para ST y 10 micras para la nicotina. Estas dosis óptimas se han utilizado en todos los experimentos posteriores. Para investigar el efecto de ST o la nicotina sobre la vía de Akt en células HNSCC, tanto las células SCC4 y HSC2 fueron tratados con 20 mg /ml de ST o con nicotina (10 M) para diferentes intervalos de tiempo o se mantiene sin tratar, y la activación de Akt (Akt fosforilación en Ser-473 y Ser-309) se determinó en los extractos de proteínas por transferencia Western. Tanto ST y la nicotina incrementaron rápidamente la fosforilación de Akt sin afectar a los niveles de Akt totales en ambas células HSC2 y SCC4 (Figura 2A y 2B, respectivamente). Estos estudios demuestran que ST y la nicotina activan Akt en dosis que pueden ser fisiológicamente relevantes. Además, nuestro análisis de Western blot mostró tanto ST y la nicotina indujo un aumento dependiente del tiempo en la fosforilación tanto de las quinasas aguas arriba, PI3K y PDK1, así como los objetivos de abajo, Raf, GSK3, y PS6 en las células SCC4 (Figura 2A y 2B ), que refleja la rápida aparición de aumento de la fosforilación de Akt. Se observaron resultados similares en ambas líneas celulares (SCC4 y HSC2), por lo tanto, se ha demostrado que los datos de sólo células SCC4 aquí.
Las células fueron tratadas con (A) ST (1-500 mg /ml), ( B) nicotina (1-100 mM) durante 24-96 h. La figura representa la media de tres experimentos realizada en forma independiente.
SCC4 células (2-3 x 10
6) fueron tratados con (A) ST (20 mg /ml) o (B) nicotina ( se prepararon 10 M), para los intervalos de tiempo indicados y extractos de células enteras. extractos de células enteras (60 mg de proteína) se resolvieron en 10% SDS-PAGE, se electrotransfirieron a una membrana de PVDF y de unión se bloqueó con leche desnatada al 5% durante la noche no específica. La expresión de proteínas se determinó mediante el sondeo con anticuerpos fosfo-específicos para pAkt (THR-309), pAkt (SER-473). pGSKβ3, PRAF, pPDK1 y Akt utilizando el método de quimioluminiscencia potenciada. Western blot para α-tubulina se hizo para mostrar la carga igual de proteínas.
Efecto de la activación guggulsterone en ST y la nicotina inducida de PI3K /Akt
Tanto ST y la nicotina inducida por la estimulación de la Akt, por lo tanto, se investigó el efecto de la GS en ST y la activación inducida por la nicotina de Akt. SCC4 células fueron tratadas con GS (50 mM) para diferentes intervalos de tiempo y de sus extractos de proteínas fueron probados para la activación de Akt. Como se muestra en la Figura 3A, GS inhibió la activación de Akt, aguas arriba quinasas PI3K, PDK1, así como las proteínas aguas abajo, Raf, GSK3, y PS6. La normalización de las dosis de inhibidor de PI3K /Akt, LY294002, se llevó a cabo por tratamiento de las células SCC4 con diferentes concentraciones de inhibidor (0,5 a 10 mM) durante 1 h. Como se muestra en la Figura 3B, LY294002 (10 M) inhibió completamente la expresión de Akt activado; mientras que se observó ningún efecto sobre el total de los niveles de expresión de Akt. células SCC4 se pre-trataron con GS de 4 h o LY294002 (10 M) durante 60 min, seguido de ST (20 mg /ml) durante 6 h o nicotina (10 mM) durante 4 h. Los resultados indican que la SG, así como LY294002 bloqueado ST y activación de la vía Akt inducida por la nicotina (Figura 3C), aunque no se observó efecto sobre la expresión de Akt total y GSK3 en estos puntos de tiempo.
células SCC4 ( 2-3 x 10
6) fueron tratados con GS) (a (50 mM) para los intervalos de tiempo indicados y /o (B) con LY294002 a diferentes concentraciones de 1 h. células SCC4 (C) (2-3 x 10
6) se trataron previamente con 50 micras GS durante 4 h o con LY294002 (10 M) durante 1 h y se estimularon con ST (20 mg /ml) durante 6 h , o con nicotina (10 mM) durante 4 h. Sesenta microgramos de proteínas a partir de extractos de células enteras se resolvieron en 10% SDS-PAGE, se electrotransfirieron a una membrana de PVDF, seguido de bloqueo con 5% no grasa durante la noche de la leche. La expresión de proteínas se determinó mediante el sondeo con anticuerpos específicos utilizando el método de quimioluminiscencia potenciada.
Guggulsterona y el inhibidor de PI3K-específica LY294002 bloque ST inducida por la nicotina y malo y Bax fosforilación
Tanto ST y la nicotina potentemente estimulado fosforilación de la serina de Bax y Bad en una forma dependiente del tiempo (Figura 4A y 4B) que resulta en derogación de su función pro-apoptótica. Para demostrar un papel funcional de Akt como el ST fisiológica y la nicotina activa Bax y Bad quinasa, LY294002, un inhibidor específico PI3K que puede bloquear la vía de señalización de PI3K /Akt, se utilizó. células SCC4 se pre-trataron con LY294002 (10 M) durante 60 min o 50 micras GS durante 4 h seguido de ST (20 mg /ml) durante 6 h o con nicotina (10 mM) durante 4 h. GS, así como LY294002 bloquearon ST y la nicotina indujo Bax y la fosforilación de Bad (Figura 4A y 4B). No se observó ningún efecto sobre la expresión del total malo y Bax en estos puntos de tiempo. Estos hallazgos sugieren que la inhibición de ST y la nicotina inducida Bax y Bad fosforilación por GS puede restaurar la función pro-apoptótica de estas moléculas.
SCC4 células (2-3 x 10
6) fueron tratados con ( a) ST (20 mg /ml) o (B) de nicotina (10 M) para los intervalos de tiempo indicados. células SCC4 se pre-trataron con LY294002 (10 M) durante 60 minutos, o 50 micras GS de 4 h, seguido de ST (20 mg /ml) durante 4 h, o con nicotina (10 mM) durante 4 h, y toda se prepararon extractos de Célula. Sesenta proteínas de microgramos a partir de extractos de células enteras se resolvieron en 10% SDS-PAGE, se electrotransfirieron a una membrana de PVDF seguido de bloqueo con leche desnatada al 5% durante la noche. La expresión de proteínas se determinó usando el método de quimioluminiscencia potenciada y se sondeó con anticuerpos contra pBAD y pBax. Las transferencias fueron despojados y reprobed de proteínas Bax y Bad.
Akt está co-localizada con Bax en el citoplasma
Para evaluar un papel directo potencial de Akt como Bax quinasa fisiológica, la distribución subcelular de Akt y Bax se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia. Bax fue principalmente co-localizada con Akt en el citoplasma de las células SCC4 (Figura 5A) lo que sugiere que tanto la ST y la nicotina activa Akt tiene el potencial para fosforilar directamente e inactivar Bax en las células SCC4.
La fosforilación de Bax y Bad resultados en la retención de estas proteínas en el citosol y la falta de objetivo mitocondrias
Nuestros resultados demuestran que ST y la nicotina puede inducir la fosforilación de Bax (Ser-184) y Bad (Ser-136), y la fosforilación en estos sitios resultaron en inactivación de la función pro-apoptótica de Bax y Bad. Es bien conocido que la actividad pro-apoptótica de Bax y Bad depende de su citosólica o localización mitocondrial. Para probar si la fosforilación de Bax y efectos Bad su localización sub-celular, las células SCC4 se mantuvieron sin tratar o tratado con GS (50 mM) durante 4 h, ST (20 mg /ml) durante 6 h y la nicotina (10 M) para 4 marido. Se llevaron a cabo fraccionamientos Sub-celulares para aislar las mitocondrias y citosol como se describe en materiales y métodos. En las células SCC4 no tratados, se encontró que la mayoría de Bax y Bad en el citosol, y sólo una pequeña cantidad de estas proteínas, se localiza en las mitocondrias (Figura 5B). En GS se observaron células tratadas mayoría de estas proteínas en la fracción mitocondrial. Por el contrario, tanto en las células tratadas con nicotina y ST, Bax y Bad se observó principalmente en el citosol (Figura 5B).
En particular, el tratamiento previo de las células SCC4 con GS (50 mM) durante 4 h, seguido por ST (20 mg /ml) de tratamiento de 6 h o nicotina (10 mM) durante 4 h, mostró un cambio en la localización de Bax y Bad y la mayoría de estas proteínas se observaron en la fracción mitocondrial (Figura 5B). Para confirmar la pureza de las fracciones subcelulares obtenidas, succinato deshidrogenasa, una proteína exclusiva de la mitocondria, se evaluó mediante Western Blot. Succinato deshidrogenasa, sólo se detectó en la fracción mitocondrial y no en el citosol (Figura 5B), lo que confirma la pureza de las fracciones mitocondriales y citosólicas. β-actina se utilizó como control para garantizar la igualdad de carga de proteína en todos los carriles.
células SCC4 (5 × 10
3) se sembraron en cubreobjetos y se incubaron con un anticuerpo de ratón contra Bax humano y una anticuerpo de conejo contra anticuerpos AKT humanos. Alexa flour®594 conjugado anti-conejo (rojo) y isotiocianato de fluoresceína conjugado (verde) anticuerpos secundarios anti-ratón se utilizan para visualizar Akt (rojo) y patrones de localización Bax (verde) usando un microscopio de fluorescencia. Panel (i) DAPI núcleos en color azul manchada; (Ii) la expresión citoplásmica de Bax; (Iii) la expresión citoplasmática de la proteína Akt; y (iv) fusionado fotomicrografía (ii) y (iii) que muestra co-localización de Bax y Akt. (B) La fosforilación de Bax al (Ser-184) y Bad (Ser-136) da como resultado la retención de Bax y Bad en citosol. células SCC4 se mantuvieron sin tratar o tratadas con 50 micras GS de 4 h, ST (20 mg /ml) durante 6 h, 10 mM de nicotina durante 4 h. células SCC4 se trataron previamente con 50 micras GS de 4 h, seguido de ST durante 6 h o con nicotina durante 4 h. Citoplasmáticas (C) y mitocondrial (M) extractos se prepararon como se describe en materiales y métodos y se separaron en 10% SDS-PAGE. Las proteínas fueron electro-transfirieron sobre membrana de PVDF seguido de bloqueo con leche desnatada al 5% durante la noche. Las transferencias se incubaron con anticuerpos específicos contra Bax y Bad. expresión de la proteína se determinó utilizando el método de quimioluminiscencia potenciada. La pureza de las fracciones subcelulares obtenidas se determinó mediante Western blot para la proteína mitocondrial, succinato deshidrogenasa. β-actina se utilizó como control de carga.
ST y la nicotina inducida por fosforilación de Bad mejora la interacción con 14-3-3ζ
Bad fosforilación (SER-136) promueve su translocación desde mitocondrias en citosol y la interacción con la proteína andamio 14-3-3. Para evaluar si ST o la nicotina afectan mala asociación, las células SCC4 fueron tratados con ST (20 g /ml) o nicotina (10 M) para diferentes intervalos de tiempo. Co-inmunoprecipitación de 14-3-3ζ y Bad mostraron un aumento dependiente del tiempo en pBAD enlazado en los inmunocomplejos (IP) de 14-3-3ζ indicando asociación entre 14-3-3ζ y pBAD (Figura 6A y 6B), en el tratamiento de con ST y la nicotina, respectivamente. Se observaron resultados similares en ensayos de inmunoprecipitación inversa, transferencia Western se realizó para 14-3-3ζ en inmunocomplejos obtenidos usando anticuerpo específico pBAD, confirmando la interacción de 14-3-3ζ con pBAD (Figura 6A y 6B). Estos resultados sugieren ST y la nicotina inducida por la fosforilación de Bad resultaron en secuestrar inadecuado en el citoplasma, el bloqueo funcionalmente su función pro-apoptótica.
SCC4 se trataron con (A) ST (20 mg /ml) o (B) con nicotina (10 M) para diferentes intervalos de tiempo y ensayos de inmunoprecipitación se llevaron a cabo usando lisados de células enteras y se analizó por transferencia Western como se describe en Materiales y Métodos. 14-3-3ζ se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo específico y la proteína de pBAD unido co-precipita con 14-3-3ζ se determinó por análisis de transferencia Western. ensayos de inmunoprecipitación inversa se realizaron en el que pBAD se inmunoprecipitó, seguido por análisis de transferencia Western de 14-3-3ζ usando un anticuerpo específico contra esta proteína. (C) La figura muestra el modelo hipotético para la inhibición de la activación inducida ST /nicotina de PI3K /Akt por GS. Nuestros resultados mostraron tratamiento con ST y /o la nicotina activa Akt (fosforilada en Ser-473 y Ser-309) resulta en la fosforilación de sus objetivos de abajo Raf, GSK3, y ps6, mientras que el tratamiento GS inhibe la activación de Akt. Curiosamente, el tratamiento previo de las células de cáncer de cabeza y cuello con GS inhibe la activación de Akt y de los objetivos (Raf, GSK3, y PS6) sobre la exposición a ST /nicotina. GS pretratamiento también libera inadecuado de la acción inhibitoria de 14-3-3ζ, activando de este modo vía intrínseca de la apoptosis. Por lo tanto, nuestros resultados demostraron GS como agente terapéutico potencial para la carcinogénesis inducida por ST cabeza y el cuello.
Discusión
El tabaco en diversas formas es uno de los principales factores etiológicos para el desarrollo y progresión de HNSCC. La expresión aberrante de genes implicados en el crecimiento celular, supervivencia, angiogénesis, invasión y metástasis en ST asociado carcinogénesis de cabeza y cuello ha sido reportado por nuestro grupo y otros [27] - [31]. En este estudio, hemos demostrado la activación de Akt en células HNSCC tratados con ST /nicotina, evidenciado por la fosforilación sostenida de Akt en la serina 473 y treonina 308, así como sus sustratos aguas abajo (PS6, GSK3, PRAF), en un tiempo dependiente manera. Tanto ST y la nicotina también indujo la fosforilación de la quinasa aguas arriba PDK1 (Ser241), y la subunidad p85 de otra quinasa aguas arriba, PI3K en células SCC4. Estas observaciones son compatibles con los informes anteriores que muestran la activación de PI3K /Akt en las neuronas corticales cultivadas, bronquial humano normal y las células epiteliales de la vía aérea pequeña en respuesta al tratamiento de nicotina [11], [32] - [34]. Además, puso de manifiesto tanto la ST y la nicotina activamos Akt, Bad inducida (Ser136) y la fosforilación Bax (Ser184), resultando en la retención citoplasmática de estas proteínas. Sin embargo, el tratamiento con LY294002, un inhibidor de PI3K /Akt, inhibe potentemente ST y la nicotina inducida por fosforilación de Bad (Ser-136) y Bax (Ser-184), resultando en la relocalización mitocondrial de estas proteínas, reforzando aún más nuestra observación de que ST y la nicotina inducidos fosforilación de Bad (Ser-136) y Bax (Ser-184) por la activación de PI3K /Akt. fosforilación Curiosamente, tanto la ST y la nicotina induce de Bad (Ser-136) en las células SCC4 aumentó su asociación con 14-3-3ζ según lo revelado por los ensayos de co-IP. Esto resulta en el secuestro de Bad en el citoplasma, lo que inhibe la vía intrínseca de la apoptosis. Informes anteriores han demostrado la fosforilación en ambos Ser112 o Ser136 facilita la formación de un complejo entre malo y 14-3-3s en el citosol, el bloqueo de su interacción con Bcl2 /Bcl-XL en la mitocondria [35], [36].
Recientemente, hemos demostrado la sobreexpresión de PI sintasa, PI3-K y ciclina D1 en las células ST tratados de lesiones orales y el cáncer oral [37]. Además, el análisis de muestras clínicas de lesiones leucoplásicas orales sin displasia, con displasia y carcinomas de células escamosas orales (OSCCs), que proporcionó la primera evidencia de una mayor expresión de PI sintasa en las primeras etapas de las lesiones precancerosas y el cáncer oral y su correlación con la desdiferenciación del tumor y el tabaco consumo [37]. Aquí hemos ampliado en estos resultados para demostrar GS podría inhibir la inducción de la vía PI3K /Akt por ST y la nicotina
.
Por lo tanto, la inhibición de la inducción de la actividad de Akt por los componentes del tabaco ST podría ser un enfoque valioso para mitigar los efectos de la de tabaco en los consumidores en situación de riesgo para el desarrollo de la CECC, y /o en HNSCC pacientes que continúan fumando o utilizar productos ST. A este respecto, se observó que GS suprimió la fosforilación de Akt (Ser473 y Thr308), PDK1 (Ser241) y la subunidad p85 de PI3K, que conduce a la disminución de la fosforilación de GSK3, PRAF, PS6, los objetivos de abajo de Akt. En particular, nuestro estudio reveló que no sólo GS inhibió la vía PI3K constitutiva /Akt, pero su tratamiento previo abrogada tanto ST y la nicotina inducida por la activación de PI3K /Akt. ST y la nicotina abrogadas los efectos pro-apoptóticos de Bax /Bad de fosforilación y secuestro en el citoplasma, sin embargo GS pretratamiento inhibió el efecto de ST y la nicotina, la orientación Bax y Bad a la mitocondria, la inducción de la apoptosis. Sin embargo, el efecto de GS no es específico y limitado a células de cáncer de cabeza y cuello solamente. Nosotros y otros han demostrado los efectos anticancerígenos de GS en una variedad de tipos de células cancerosas, es decir, cabeza y cuello; leucemia, mieloma múltiple, pulmón, melanoma, de ovario, adenocarcinoma intestinal derivada, colorrectal, colon, piel, próstata, esófago, y de mama [19], [21] - [24], [38] - [43]
.
en conclusión, nuestro estudio demostró que tanto la ST y la nicotina promueven la supervivencia de las células de cáncer de cabeza y cuello humanos SCC4, mediante la inactivación de las funciones pro-apoptóticos de Bax y Bad mediante su fosforilación y el secuestro de estas proteínas en el citoplasma. GS no sólo inhibe la vía constitutivamente activa PI3K /Akt, pero también inhibe la ST y la nicotina inducida por la activación de esta vía y promueve señales de apoptosis en estas células (Figura 6C). Por lo tanto, GS puede ser explorado como un agente quimiopreventivo para ST carcinogénesis inducida por la cabeza y el cuello.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
z-Guggulsterona (GS), 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT), yoduro de propidio (PI) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). anticuerpo monoclonal de ratón contra Bax (sc-7480); anticuerpo policlonal de conejo contra 14-3-3ζ (sc-1019), el anticuerpo p85 pPI3K (Tyr-508, SC-12929R) fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. anticuerpo monoclonal de conejo contra fosfo-Akt (Ser 473, gato-9271), fosfo-Akt (Thr 308, gato-9275), Akt (cat-9272), fosfato GSK-3β (Ser 9, gato-9336), fosfo RAF (Ser 259, gato-9421), fosfo-PDK1 (Ser 241, gato-3061), inhibidor de la cinasa PI3-LY294002 (cat-9901) fueron todos adquiridos de Señalización celular Tecnología. Para los estudios de co-localización, de cabra anti-conejo Alexa Fluor ® 594 (Cat no A-11012) fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). De cabra anti-ratón FITC (Cat no. F2012) se adquirió de Sigma (St. Louis, MO). perlas de proteína A-sefarosa se obtuvieron de GE Healthcare Biosciences, (Uppsala, Suecia).
Cell Cultura y
líneas celulares cabeza humana y de carcinoma escamoso de cuello, SCC4 se obtuvo de la American Type Culture Collection ( ATCC) y HSC2 (JCRB0622) se obtuvo de Ciencias de la Salud de Investigación de Recursos del Banco (HSRRB), Japón [44], [45]. Ambas líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello son conocidos por albergar p53 mutante. células SCC4 tener un punto de mutación en el codón 51 CCC TCC a las células y HSC2 tienen una mutación en el intrón 6 [44], [45]. HSC-2 células mutadas Harbor PIK3CA (H1047R) [46]. Ambas líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello (SCC4 y HSC2) se hicieron crecer en cultivos monocapa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma, St. Louis, MO) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Sigma), 1 mM L-glutamina, piruvato 1X de sodio, vitaminas 1X, medio esencial 1 mM mínimo (MEM), 100 mg /ml de estreptomicina y 100 U /ml de penicilina en un incubador humidificado (5% de dióxido de carbono, aire 95%) a 37 ° C como se describe anteriormente [47].
Preparación de extracto de tabaco sin humo (ST)
marca utilizada comúnmente de tabaco curado (khaini) se adquirió en el mercado local. 25 g de tabaco era finamente pulverizado y se homogeneizaron en 225 ml de agua destilada. La mezcla se agitó en un agitador magnético durante dos horas y luego se dejó reposar durante 24 horas a 37 ° C. A continuación, se recogió el sobrenadante después de centrifugación a 5000 g durante 20 minutos. El extracto se esterilizó haciéndola pasar a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenó a 4 ° C hasta su uso. La concentración final de tabaco en el extracto acuoso se estimó en 2,7 g% [48].
Ensayo de citotoxicidad
células de cáncer de cabeza y cuello (5 × 10
3 /pocillo) chapado en una placa de 96 pocillos durante 24 horas. Las células se incubaron por triplicado en presencia de medio que contiene ST /nicotina o 0,02% de DMSO que sirvió como control de vehículo en un volumen final de 100 l de 24-96 horas a 37 ° C. La muerte celular se midió mediante la adición de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) a 37 ° C durante 3-4 h. Los cristales de formazán se disolvieron en 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y la densidad óptica (DO) se midió a longitud de onda de 570 nm. El porcentaje de muerte celular se calcula individualmente para cada dosis de la siguiente manera:. (OD
Control-DO
tratadas /OD
control) x 100, como se describe anteriormente [49]
Western Blot y Co-inmunoprecipitación (Co-IP) de ensayo
Co-inmunoprecipitación (Co-IP) ensayos y WB se llevaron a cabo como se describe por nosotros previamente [39]. lisados de células enteras se prepararon a partir GS (50 M) o nicotina (10 mM) se determinó células SCC4 tratadas y la concentración de proteína utilizando el reactivo de Bradford (Sigma) y cantidades iguales de proteínas (50 g /carril) se resolvieron en 12% de sodio dodecil sulfato (SDS) en gel de poliacrilamida. Las proteínas se electro-transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquear con leche no grasa al 5% en solución salina tamponada con Tris (TBS, 0,1 M, pH = 7,4), transferencias se incubaron con anticuerpos específicos según el protocolo recomendado por el fabricante a 4 ° C durante la noche. la abundancia de proteínas de α-tubulina (Santa Cruz Biotechnology, CA) sirvió como control para la carga de proteína en cada carril. Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Dako, Cytomation, Glostrup, Dinamarca), diluida en una dilución apropiada en 1% de BSA, durante 2 h a temperatura ambiente. Después de cada paso, transferencias se lavaron tres veces con Tween (0,1%) - solución salina tampón Tris (TTBS). Las bandas de proteínas se detectaron mediante el método de quimioluminiscencia (ECL, Santa Cruz Biotechnology, CA) en la película XO-MAT. ensayos de co-IP se llevaron a cabo como se describe anteriormente
Sub-celular fraccionamiento:. El aislamiento del citoplasma y mitocondrias
células de cáncer de cabeza y cuello (2 × 10
7) fueron tratados, cosechadas y lavadas una vez con PBS frío 1X y se resuspendieron en tampón isotónico mitocondrial (manitol 210 mM, sacarosa 70 mM, EGTA 1 mM, Hepes 10 mM, pH 7,5, 0,1% de BSA) que contenía cóctel inhibidor de proteasa. Las células resuspendidas se homogeneizaron con un homogeneizador Polytron operativo para cuatro ráfagas de 10 s cada uno a un entorno de 5 y después se centrifugó a 2000 g durante 3 min para sedimentar los núcleos y las células intactas. El sobrenadante se centrifugó a 13.000 g durante 10 min para sedimentar las mitocondrias como se describe [50]. El sobrenadante se centrifuga a 15.000 g para sedimentar las membranas de luz. El sobrenadante resultante contenía las fracciones citosólicas. Las mitocondrias se lavó con tampón mitocondrial dos veces, se resuspendieron con tampón de lisis Nonidet 1% P-40, sacudió durante 60 min, y después se centrifugó a 13.000 g durante 10 min a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante que contiene las proteínas mitocondriales. La proteína (100 g) de cada fracción se sometió a 12% SDS-PAGE y se analizó mediante análisis de transferencia Western usando el anticuerpo anti-citocromo c. La pureza de las fracciones fue confirmada mediante la evaluación de localización de las proteínas fracción específica incluyendo succinato deshidrogenasa de mitocondrias.
estudios de co-localización de Akt y Bax en las células de cáncer oral utilizando microscopía de escaneo láser confocal
células de cáncer de cabeza y cuello, SCC4 y HSC2, se cultivaron en cubreobjetos en medio DMEM suplementado con 10% FBS a 37 ° C y se procesaron para microscopía de escaneo láser confocal como se describe por nosotros previamente [51]. Las células se enjuagaron en PBS de Dulbecco (DPBS), se fijaron en metanol durante 5 min a -20 ° C y se incubaron con anticuerpos primarios específicos, monoclonal de ratón anti-Bax y el anticuerpo monoclonal de conejo anti-Akt, se incubaron como un cóctel a 4 ° C durante la noche . Después de lavado en tampón de fosfato de solución salina- 0,1% Tween (PBST, 1X) los cubreobjetos se incubaron con anti-ratón conjugado con FITC /anti-conejo Alexa flour®594 anticuerpo secundario conjugado durante 45 min a 37 ° C en la oscuridad. Los cubreobjetos se lavaron y contratinción con DAPI para 30 seg. Un anticuerpo de ratón contra Bax humano, un anticuerpo de conejo contra Akt humana, y fluoresceína anti-ratón conjugado con isotiocianato de (verde) o anticuerpos secundarios se utilizaron para que las células podrían teñirse simultáneamente sin reacción cruzada con rodamina conjugado anti-conejo (rojo) . En los controles negativos, los anticuerpos primarios fueron sustituidos por IgG no inmune de ratón del mismo isotipo para asegurar la especificidad (datos no mostrados). A partir de entonces, los portaobjetos se aclararon y se montaron en medio de montaje de fluorescencia y se examinaron con Lieca TCS SP2 láser microscopía confocal de barrido (CLSM).