Extracto
Durante las dos últimas décadas, las proteasas de la superficie celular que pertenecen al tipo II transmembrana serina proteasa (TTSP) de la familia se han convertido en importantes enzimas en el degradoma de mamíferos, jugando un papel crítico en la biología epitelial, la regulación de la homeostasis metabólica, y el cáncer. las vías respiratorias humanas proteasa de tipo tripsina 5 (HATL5) es uno de los pocos miembros de la familia que permanece sin caracterizar. Aquí demostramos que HATL5 es una serina proteasa catalíticamente activo que es inhibida por los dos inhibidores de serina proteasa de tipo Kunitz, de crecimiento de hepatocitos inhibidor del factor activador (HAI) -1 y 2, así como por SERPINA1. De longitud completa HATL5 se localiza en la superficie celular de células de mamífero cultivadas como se ha demostrado por microscopía confocal. HATL5 muestra un perfil de expresión de tejido relativamente restringido, con tanto la transcripción y la proteína presente en el cuello del útero, esófago, y la cavidad oral. El análisis inmunohistoquímico reveló un patrón de expresión donde HATL5 se localiza en la superficie celular de las células epiteliales diferenciadas en el epitelio escamoso estratificado de los tres de estos tejidos. Curiosamente, HATL5 se redujo significativamente en carcinomas de cuello uterino, esófago, y de cabeza y cuello en comparación con el tejido normal. El análisis de las matrices de tejido de cáncer de cuello uterino y del esófago demostró que las células epiteliales escamosas pierden su expresión de la proteína HATL5 después de la transformación maligna
Visto:. Miller GS, GL Zoratti, Murray AS, Bergum C, Tanabe LM, Lista K ( 2014) HATL5: una superficie celular serina proteasa expresados diferencialmente en los cánceres epiteliales. PLoS ONE 9 (2): e87675. doi: 10.1371 /journal.pone.0087675
Editor: Claudia Daniela Andl, Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Octubre, 2013; Aceptado: December 28, 2013; Publicado: 3 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Miller et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los fondos de puesta en marcha de la Escuela de Medicina de la Wayne State y Ann Instituto del cáncer Karmanos Bárbara, Detroit, MI. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el tipo II serina proteasas transmembrana se dividen en cuatro subfamilias filogenéticamente distintos: el tipo tripsina (HAT) las vías respiratorias humanas /diferencialmente expresado en el gen de carcinoma de células escamosas (DESC) subfamilia, serina hepsin /proteasa transmembrana (hepsin /TMPRSS) subfamilia, subfamilia matriptase, y la subfamilia Corin. HATL5 pertenece a la subfamilia HAT /DESC junto con el sombrero, DESC1, TMPRSS11A, y como HAT-4 [1] -. HATL5 (HATL-5, como HAT-5) está codificada por el gen TMPRSS11b colocados en un único grupo de genes que abarca todos los genes HAT /DESC en ratones y seres humanos [4]. Todos los miembros de la subfamilia HAT /DESC se componen de una región de tallo con una sola proteína de esperma de erizo de mar, enteropeptidasa, agrina dominio (SEA), y un dominio de serina proteasa C-terminal. Existe un extenso cuerpo de literatura que documenta un papel crítico de los miembros de la hepsin /TMPRSS, matriptase, y subfamilias Corin en los procesos fisiológicos y patológicos. papeles críticos para estos TTSPs se han descrito en diversas áreas e incluyen el desarrollo del epitelio y la homeostasis, metabolismo del hierro, el oído, la digestión, la regulación de la presión arterial, así como la infección viral, la inflamación y la oncogénesis [3] [5], [6]. Se han publicado relativamente pocos estudios que caracterizan las propiedades bioquímicas del sombrero /subfamilia DESC y /o explorando sus funciones fisiológicas. HAT se ha informado que tiene actividad fibrinogenolıtica, para modular el receptor de uroquinasa y para activar el receptor activado por proteasa (PAR) 2 [7] [8], [9] [10], [11]. Además, HAT puede uncoat viriones reovirus para promover la infección en cultivo celular y se une la glicoproteína de superficie, la hemaglutinina (HA), del virus de la influenza [12] [13], [14]. Recientemente, un estudio que emplea la ablación genética de TMPRSS11A y el sombrero en ratones demostró que las dos proteasas son prescindibles para el desarrollo, la salud general y la supervivencia a largo plazo en ausencia de desafíos externos o déficits genéticos adicionales [15].
En este estudio, hemos realizado una caracterización y expresión análisis bioquímico de HATL5. La larga duración HATL5 cDNA dirige la expresión de una proteína de 60 kDa N-glicosilada que se localiza en la superficie celular de células de mamífero. El dominio de serina proteasa HATL5 activado purificado hidroliza sustratos peptídicos sintéticos, y es inhibida por miembros de dos familias diferentes inhibidor de serina proteasa: los de tipo Kunitz; HAI-1, HAI-2 y aprotinina, y el miembro de la familia de la serpina; SERPINA1. HATL5 proteína de localización es muy similar en los tres tejidos diferentes analizados: cérvix, esófago, y la mucosa oral. Por lo tanto, HATL5 se detecta principalmente en la superficie de las células epiteliales en estos epitelio escamoso estratificado. Durante la carcinogénesis, la expresión de la proteasa de la superficie celular se reduce en gran medida, y en muchos casos, indetectable en las células de carcinoma escamosas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
La uso de matrices de parafina de tejidos humanos fue aprobado de acuerdo con las directrices institucionales de la Revisión institucional de la Universidad Administración de la Junta Estatal de Wayne (# 2013-43).
clonación y expresión de larga duración HATL5 humano
RNA de esófago humano se obtuvo de Biochain (Newark, CA). síntesis de la primera cadena de ADNc se realizó con oligo (dT) primers utilizando un kit RETROscript de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY). cebadores específicos de genes fue diseñada para HATL5 humano de longitud completa usando la secuencia depositada por
Homo sapiens
transmembrana de la proteasa, 11B serina, ARNm, GenBank#BC126195.1. Los cebadores 5 'GCCACCATGTAC-AGGCACGGCATATC-3' y 5 'GAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3' se utilizaron para amplificar el ADNc usando una alta fidelidad-Platinum®Taq polimerasa (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) que a continuación se insertan en pcDNA 3.1 /V5-His TOPO® TA (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) en marco con un C-terminal de His-tag y V-5 epítopo. Las construcciones fueron verificadas por secuenciación (ABI Prism 3730 DNA Analyzer, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). La transfección de células HEK293 y células COS-7 (ATCC, Manassas, VA) se realizó utilizando Lipofectamine 2000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Atlanta Biológicos, Lawrenceville, GA). La transfección se realizó con ADN de plásmido que contiene HATL5-4,0 g de longitud completa. Las células se lisaron usando tampón RIPA: NaCl 150 mM, 50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 0,1% de SDS, 1% NP-40, y inhibidor de la proteasa cóctel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se aclaró por centrifugación a 12.000 x g a 4 ° C °. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un kit de Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Waltham, MA). Las muestras de proteína se separaron mediante SDS-PAGE usando 4-12% de geles de NuPAGE Bis-Tris (Life Technologies, Grand Island, NY) en condiciones reductoras y se analizaron por transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal de ratón primario V-5 (Invitrogen, Life Technologies, grand Island, NY) y un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina secundario anti-ratón de cabra (Millipore, Billerica, MA).
clonación y expresión del humano HATL5 de serina proteasa de dominio-Pro Trial forma
La proteasa serina HATL5 humana (SP) de dominio se clonó en el plásmido pSecTag2A (Life Technologies, Grand Island, NY) para la expresión y análisis en cultivo de células de mamífero. HATL5 secuencia de dominio de serina proteasa de la humana de longitud completa HATL5-V5-His plásmido se amplificó por PCR usando los siguientes cebadores: 5'-CCAAGGATCCATGTTGTGGGAGACAAGTAGCCAAC-3 'y 5'-CCAAGCGGCCGCGAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3'. El fragmento de PCR resultante se clonó en el vector pSecTag2A entre los sitios BamHI y NotI utilizando técnicas estándar. Se realizó la transfección de células CHO (ATCC, Manassas, VA), la extracción de proteínas, y el análisis de transferencia Western como se describe anteriormente. Un anticuerpo anti-Myc monoclonal de ratón (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) se utilizó para la detección mediante Western Blot.
Clonación y expresión de la proteasa serina de dominio de Active HATL5 en
Pichia pastoris
El dominio serina proteasa activa HATL5 humana fue producida en la levadura utilizando un kit de Expresión de Pichia (Invitrogen Tecnologías, vida, Grand Island, NY). Para la clonación en el vector pPIC9, HATL5 secuencia de serina proteasa de la pcDNA 3.1 V5 /HIS /TOPO plásmido humano-HATL5 fue mutado para eliminar un sitio XhoI mediante el sitio Agilent Quick-Change ™ II kit de mutagénesis dirigida (Agilent Technologies, Inc. de Santa Clara, CA). Los cebadores para la mutagénesis fueron: 5'-gccaggtgtctatactcgggtgacttcttatcgcaattgg-3 'y 5'-ccaattgcgataagaagtcacccgagtatagacacctggc-3'. La mutagénesis dio como resultado un único punto de mutación sinónimo, reproduciendo así la secuencia de aminoácidos nativa. Después de la mutagénesis, dominio de serina proteasa HATL5 humano se amplificó y se clonó en el vector pPIC9 en los sitios XhoI y NotI, usando los cebadores 5'-tctctcgagaaaagaattgtgaatggaaaaagctccc-3 'y 5'-attcgcggccgctcagagtccagtcttgg-3'. Clonación resultado en HATL5 activa secuencia de serina proteasa de dominio (Ile-Val-Asn) que se inserta inmediatamente después de un sitio de escisión KEX2 Leu-Glu-Lys-Arg codificada por el vector. El Leu-Glu-Lys-Arg-Ile-Val-Asn se escinde entre Arg y Ile por la proteasa KEX2 de levadura que es una proteasa transmembrana se encuentra en el aparato de Golgi, lo que hace un dominio de serina proteasa activada HATL5 secretada. Expresión de dominio de serina proteasa activa matriptase en
Pichia pastoris
se realizó en paralelo como se describe [19]. La transformación se realizó en el TOP-10 células competentes (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) y pPIC9-HATL5 clones positivos fueron aislados y se amplifica usando técnicas estándar. Para la transformación de
Pichia pastoris
, 40 g de pPIC9 de humano HATL5, pPIC9-matriptase, pPIC9 vector vacío fue digerido con SalI, y se purificó por extracción con fenol-cloroformo. La electroporación del plásmido linealizado en la cepa de levadura GS115 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) se realizó a 1,5 kV utilizando 0,2 cubetas cm (BioRad, Hercules, CA) en un BTX-Transporator Plus (Harvard Apparatus Holliston, MA). La expresión de proteasas recombinantes en el medio condicionado de clones de levadura individuales se analizó por SDS-PAGE y transferencia Western usando un anticuerpo de conejo anti-TMPRSS11b (Abcam, Cambridge, MA) o un anticuerpo anti-matriptase de conejo (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) . HATL5 proteínas y Matriptase se purificaron por cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna HiTrap Q HP (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) como se describe [16].
cromogénico proteinasa Ensayos
Los ensayos se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos en un volumen total de reacción de 100 l usando 50 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,01% de Tween-20, 0,01% de BSA para la dilución de todas las muestras. 5 nM purificó dominio HATL5 o matriptase serina proteasa recombinante activa se incubó a 37 ° C durante 60 min con 100 micras del péptido sintético L-1720 Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Bachem, Bubendorf, Suiza) en el ausencia o presencia (inhibidor y sustrato añadido de forma concomitante) de HAI-1 (60 nM) (amplificador de I + D; D, Minneapolis, MN), HAI-2 (40 nM) (amplificador de I + D; D, Minneapolis, MN), aprotinina (2 micras) , leupeptina (20 micras), benzamidina (2 mM), o SERPINA1 (60 nM) (todos de Thermo Scientific, Waltham, MA). Los cambios en la absorbancia a 405 nm monitorizados mediante un lector de placas Pro Magellan NanoQuant Infinito M200 (Tecan US, Inc., Morrisville, Carolina del Norte).
desglicosilación de HATL5
Las proteínas en lisados o medio condicionado preparado como se ha indicado anteriormente fueron desglicosilada utilizando un Kit Protein desglicosilación enzimática de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma, St. Louis, MO).
inmunocitoquímica
formación de imágenes de la superficie celular se realizó mediante HEK293 o COS -7 células transfectadas con larga duración HATL5-V5 humana. Las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos con la rata de tipo 2 del colágeno (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se dejaron adherir y crecer durante 36 h, momento en el cual, se eliminó medios y las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. HATL5-V5 se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal anti-V5 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) o un anticuerpo control de isotipo (Sigma, St. Louis, MO) y un AlexaFlour-568 conjugado de cabra anti-ratón secundaria anticuerpo (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). tinción de células Se obtuvieron imágenes por microscopía confocal utilizando una Leica TCS SP2 microscopio confocal (Leica, Buffalo Grove, IL)
Bioinformática Análisis
La base de datos de microarrays Oncomine (http:. //www.oncomine. org) [17] fue utilizado para llevar a cabo un meta-análisis de la expresión del ser humano
TMPRSS11b
a través de cuatro estudios del transcriptoma en los carcinomas de cuello del útero, esófago, cabeza y cuello, en comparación con los tejidos normales de control (Tabla S1).
Las muestras de tejidos e inmunohistoquímica
El "CR802", "ES482", y "T271" cuello de útero, esófago, y las matrices de tejido de cáncer orales, incluido el cáncer normal o normal adyacente tejido, se obtuvieron de US Biomax, Inc. (Rockville, MD).
arrays de tejidos se desparafinaron con xileno e hidratado con soluciones de etanol graduado. La recuperación del antígeno se llevó a cabo usando tampón de citrato, pH reducido (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Los arrays se bloquearon con suero normal de caballo 2,5% (Vector Laboratories, Burlingame, CA) en PBS, y se inmunotiñeron durante la noche a 4 ° C con conejo 4 mg /ml de anti humano TMPRSS11b /HATL5 (Sigma, St. Louis, MO). Como control negativo, IgG de conejo no inmune (4 mg /ml) (Millipore, Billerica, MA) se utilizó. Los anticuerpos unidos se visualizaron utilizando conjugado con biotina anti-conejo (Vector Laboratories, Burlingame, CA) anticuerpos secundarios, y un kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). El 3,3'-diaminobencidina se utilizó como sustrato (Sigma, St. Louis, MO) y las matrices se contratiñeron con hematoxilina. Todas las imágenes microscópicas se adquirieron en un A.1 Alcance Zeiss utilizando la imagen digital.
Evaluación de la tinción intensidades y Análisis Estadístico
Evaluación de la intensidad de la tinción de muestras de tejido del esófago y del cuello del útero se llevó a cabo por un investigador conscientes de la identidad de la muestra. Las puntuaciones se asignan sobre la base de la intensidad y extensión de la tinción epitelial en 20x campos microscópicos utilizando una escala arbitraria de cero a tres, donde 0 = no tinción positiva en células epiteliales detectado, 1 = algunas células epiteliales teñidas débilmente, 2 = algunas células epiteliales manchado moderadamente o la mayoría de las células epiteliales teñidas débilmente, 3 = algunas células epiteliales teñidas fuertemente o la mayoría de las células epiteliales teñidas moderadamente. se utilizó de dos colas análisis χ2 para determinar la significación estadística de las diferencias en la frecuencia de tinción HATL5 entre los grupos. La significación estadística de la diferencia en la intensidad de la tinción HATL5 entre los grupos se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney U de dos colas.
Resultados
Secuencia de aminoácidos y el dominio Estructura de HATL5
análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteasa putativa HATL5 humano reveló ocho sitios potenciales de N-glicosilación; cinco de los cuales están situados en el dominio de serina proteasa (fig. 1A y B). El dominio catalítico de HATL5 ratón contiene los residuos de tríada catalítica esencial serina proteasa, H
225, D
270, S
366, y el sustrato residuos del bolsillo de unión, D
360, S
386 y G
388. El motivo SWG en el dominio catalítico se conserva en todos los miembros de la HAT /subfamilia DESC y se predice que se encuentra en la parte superior del bolsillo de unión del sustrato, el posicionamiento de la enlace escindible del sustrato en la orientación correcta (S
386WG en HATL5). La activación proteolítica de HATL5 se prevé que se produzcan dentro de un motivo (K
184IVNG) en el cruce de la pro-y dominios catalíticos. Estos hallazgos sugieren que el
TMPRSS11b
gen probablemente codifica una serina proteasa funcional
secuencia de ácido (A) Amino de HATL5 humano (UniProtKB /Swiss-Prot: Q86T26.3).. residuos de aminoácidos que codifica el dominio de transmembrana están subrayados. La región con homología con la proteína de esperma de erizo de mar, enteropeptidasa, dominios (SEA) agrina se indica mediante una caja de línea sólida y el dominio de serina proteasa similar a la tripsina se indica con un cuadro de línea discontinua. El catalizador residuos Su
225 (H), Asp
270 (D), y Ser
366 (S) se indican con cuadrados. Los sitios potenciales de N-glicosilación se indican con círculos. El sitio de escisión de activación se indica con una flecha, y los dos residuos de cisteína predijo para formar un puente disulfuro que une la región de tallo hasta el dominio de serina proteasa tras la escisión de activación se indican con triángulos. (B) Representación esquemática de la arquitectura de dominio predicho de HATL5. TM = dominio de transmembrana, SEA = sitios de N-glicosilación Sea proteína erizo de esperma, enteropeptidasa, dominio Agrin, N indica predicho, el sitio de corte de activación se indica con una flecha, y SS representa el puente disulfuro que une los dominios de la proteasa MAR y serina [31 ].
HATL5 es una proteína glicosilada de 60 kDa
Para la caracterización de la proteína HATL5 codificada por el gen
TMRSS11b
, el ADNc humano de longitud completa fue generado por PCR de alta fidelidad utilizando una biblioteca de ADNc de esófago humano. El ADNc fue secuenciado, confirmado que ser idéntica a la secuencia de ADNc predicho, y se insertó en un plásmido de expresión de mamífero que suministra la proteína expresada con una-His V5 etiqueta de epítopo en el extremo C-terminal (Fig. 2A, la parte superior). Además, un vector de expresión de mamífero que contiene la pro-forma de la dominio de serina proteasa, incluyendo 15 aminoácidos aguas arriba del sitio de activación, y una Myc-tag C-terminal fue generado (Figura 2A, medio), así como un
Pichia pastoris
vector para la secreción de la forma activa escindido del dominio de serina proteasa (Figura 2A, la parte inferior). Después de la transfección del vector de longitud completa HATL5 en HEK293, COS-7, o células CHO, respectivamente, los lisados celulares se analizaron por SDS-PAGE y Western blot. En las tres líneas celulares, se detectó un producto de proteína de aproximadamente 60 kDa (Fig. 2B). Esta masa molecular aparente es significativamente mayor que la masa molecular predicha de 46 kDa, lo que sugiere que HATL5 está sujeta a modificaciones post-traduccionales. Para examinar si la HATL5 expresada puede ser modificado después de la traducción por glicosilación, extractos de proteínas de transfectadas HEK293, COS-7, o células CHO se sometieron a desglicosilación enzimática antes del análisis de transferencia de Western. La desglicosilación de larga duración HATL5 dio lugar a la aparición de un ~48 kDa especies que estaban presentes en los extractos de las tres líneas celulares (Fig. 2B). Tomando en consideración que el V5-His tag añade aproximadamente 5 kDa a la proteína recombinante, la forma desglicosilada de longitud completa HATL5 tiene una masa molecular aparente muy cerca de la masa molecular predicha. Cinco de los ocho sitios potenciales de N-glicosilación se encuentran en el dominio de serina proteasa. Para determinar si el dominio de serina proteasa de HATL5 está glicosilada, la pro-forma de la serina proteasa secretada por las células CHO transfectadas se trató con las enzimas de desglicosilación y analizada por Western Blot. Antes de desglicosilación esta forma tenía una masa molecular aparente de 45 kDa (Fig. 2C, izquierda). La masa molecular predicha de esta forma secretada de HATL5 es 30 kDa, incluyendo el tag-myc. Tras la desglicosilación, se observó una reducción de la masa molecular aparente, a una forma de 30 kDa. Una observación similar se hizo en desglicosilación del dominio sin etiquetar escindido activa HATL5 serina proteasa secretada por transfectadas
Pichia pastoris gratis (masa molecular predicha = 26 kDa) que resultó en un formulario con una masa molecular aparente de ~28 kDa ( La Fig. 2C, derecha). En conjunto, este análisis demuestra que HATL5 humana es una glicoproteína de 60-kDa y que uno o más de los cinco
N
sitios de glicosilación = Conectado potenciales en el dominio de serina proteasa se utilizan.
( a) representación esquemática de las tres proteínas diferentes HATL5 recombinantes generadas para este estudio. V5-H = V5-His etiqueta de epítopo (B) de lisados de proteínas de células enteras de HEK293, COS-7, o células CHO que expresan de longitud completa V5-His HATL5 humana etiquetados. (C)
Pichia pastoris que expresan
troceados, se analizaron los medios condicionados de células CHO que expresan dominio de serina proteasa-myc etiquetados HATL5 o medios acondicionados de activo de la proteasa serina HATL5. (B y C) Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se analizaron por Western Blot utilizando anti-V5, anti-myc o anticuerpos anti-HATL5 como se indica. Lanes con extractos de proteínas tratados con enzimas de desglicosilación antes de la SDS-PAGE se indican (+), y los extractos no tratados (-). Las puntas de flecha negras indican la posición de las formas glicosiladas de HATL5, y las puntas de flecha en blanco indican la posición de las formas desglicosiladas.
HATL5 es un catalíticamente activo de la proteasa
Para investigar el enzimática propiedades de HATL5, el dominio de serina proteasa, incluyendo el sitio de corte de activación y 15 aminoácidos adicionales aguas arriba desde el sitio de escisión, se expresó en células CHO (Fig. 2 medio). La proteína HATL5 se secreta en el medio como una sola cadena pro-enzima. Un enfoque similar previamente empleado para matriptase-3 dio lugar a una proteína secretada capaz de experimentar auto-activación como se evidencia por un ligero aumento en la movilidad electroforética y por su actividad proteolítica adquirida [18]. La forma secretada de HATL5 no, sin embargo, parecen tener propiedades auto-catalítica ya que la incubación en diversas condiciones diferentes (composición del tampón, la temperatura y tiempo) no dió ningún cambio de movilidad detectable o la actividad catalítica (datos no mostrados). Con el fin de expresar HATL5 y mediar escisión proteolítica en el sitio de activación, la
se empleó Pichia pastoris
sistema de expresión de la utilización de la proteasa de levadura intracelular, KEX2. La serina proteasa KEX2 transmembrana pertenece a la familia de la convertasa pro-proteína subtilisina-como con especificidad para la escisión después de aminoácidos básicos apareados y se localiza en el compartimento de Golgi tarde. Clonando el dominio de serina proteasa HATL5 en el vector pic9 con la secuencia del dominio de serina proteasa activa HATL5 (
185IVNG) inmediatamente después del sitio de escisión LGKR KEX2 codificada por el vector, un nuevo sitio de escisión de fusión se genera (Fig. 2, parte inferior ). La secuencia LGKRIVNG se escinde entre Arg (R) y Ile (I) por KEX2, haciendo que un dominio de serina proteasa activa HATL5 secretada. Expresión de dominio de serina proteasa activa matriptase en
Pichia pastoris
se realizó en paralelo como se describe [19]. La presencia de HATL5 serina proteasa en los medios de condicionado de
Pichia pastoris
clones transfectados con el vector pic9-HATL5 se confirmó por transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-HATL5 (Fig. 3A, izquierda). No se detectó señal en los medios de condicionado de clones transfectados con el vector vacío o el pic9 vector pic9-matriptase. Del mismo modo, el anticuerpo anti-matriptase detectó el dominio de serina proteasa matriptase secretada en medio acondicionado a partir de células transfectadas con el vector pic9-matriptase (Fig. 3A, a la derecha) y no a partir de clones transfectados con el vector de expresión pic9-HATL5 o el vector pic9 sin inserción de la proteasa. La actividad catalítica de HATL5 y matriptase, respectivamente, se confirmó usando la serina proteasa sustrato cromogénico peptidolítica Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Fig. 3B). El medio condicionado de células transfectadas con vector vacío pic9 se incluyó como un control negativo para garantizar la ausencia de interferir proteasas de levadura secretadas.
(A) las muestras de medios acondicionados de
Pichia pastoris
clones transfectadas con cualquiera de el vector de expresión sin inserto proteasa (vector), con HATL5 cDNA dominio de serina proteasa (HATL5#1 y#2) o el dominio matriptase serina proteasa de ADNc se analizaron por transferencia Western usando un anticuerpo anti-HATL5 (panel izquierdo) o un anti-matriptase anticuerpo (panel derecho). Las posiciones de HATL5 (cabeza de flecha abierta) y el dominio de serina proteasa matriptase (cabeza de flecha negro) se indican. (B) Las muestras de los medios acondicionados que se describen en (A) se incubaron a 37 ° C durante 60 min con el péptido cromogénico sintético Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA se registró (100 micras) y la absorbancia a 405 nm (C) 5 nM purificada HATL5 recombinante activa (barras blancas) o matriptase (barras negras) dominio de serina proteasa se incubó a 37 ° C durante 60 min con el péptido cromogénico sintético MeOSuc-Glu-Val-Lys-Met-pNA (100 micras ) en ausencia o presencia (inhibidor y sustrato añadido de forma concomitante) de HAI-1 (60 nM), HAI-2 (40 nM), aprotinina (2 micras), leupeptina (20 micras), benzamidina (2 mM), o SERPINA1 (60 nM). Las actividades enzimáticas para cada enzima se representan con relación a la actividad cuando no se añadió inhibidor.
El efecto de diversos inhibidores de serina proteasa de la actividad hidrolítica del dominio de proteasa de serina HATL5 purificada hacia Suc-Ala-Ala- Pro-Arg-pNA se analizó también, de nuevo utilizando matriptase como TTSP referencia bien caracterizado (Fig. 3C). actividad HATL5 se redujo en los inhibidores de moléculas genéricas de serina proteasas, leupeptina y benzamidina. La inhibición completa se logró con el polipéptido globular, inhibidor de la proteasa Kunitz tipo serina, aprotinina (bovina inhibidor de tripsina pancreática). Los inhibidores de tipo serina proteasa de Kunitz macromoleculares, de crecimiento de hepatocitos inhibidor del factor activador (HAI) -1 y 2, han sido previamente demostrado para inhibir varios miembros de la familia TTSP incluyendo matriptase, matriptase-2, HAT, hepsina y TMPRSS13 [20] [21 ], [22] [23] [24] [25] [26] [27]. HAI-1 y HAI-2 inhiben la actividad de HATL5 por 50% y 75%, respectivamente. Además, HATL5 fue inhibida por un miembro de la superfamilia de la serpina, SERPINA1 (α
1-1-antitripsina).
HATL5 se localiza en la superficie celular de las células cultivadas y en el epitelio escamoso estratificado
el análisis de la secuencia de la proteína HATL5 reveló la presencia de un único dominio transmembrana, indicando que la proteína HATL5, similar a la anteriormente caracterizada miembros de la familia TTSP, pueden estar situados en la superficie celular. Para investigar la localización subcelular de HATL5, las células HEK293 que expresan la longitud completa de la proteasa V5-etiquetados se analizaron mediante inmunocitoquímica fluorescente. células transfectadas nonpermeabilized teñidas con un anticuerpo anti-V5 primario y un anticuerpo secundario conjugado con 568 AlexaFluor se analizaron por microscopía de fluorescencia confocal. células HEK293 transfectadas muestran una señal fluorescente de color rojo intenso que se limita a la membrana plasmática (Fig. 4A, panel izquierdo). Cuando los anticuerpos primarios fueron sustituidos con IgG no inmune, no se observó tinción detectable (Fig. 4A, panel derecho). Una tinción de membrana similar se observó en un experimento paralelo utilizando células COS-7 transfectadas las células (datos no presentados).
(A) Las micrografías de análisis confocal fluorescente que muestran la expresión de la superficie celular en los ejemplos representativos de células HEK293 transfectadas transitoriamente con una de longitud completa plásmido de expresión HATL5-V5 humano. células nonpermeabilized se incubaron con un anticuerpo anti-V5 (panel izquierdo) o un anticuerpo de control no inmune (panel derecho), seguido de incubación con AlexaFluor 568 marcado con anticuerpos secundarios y tinción Hoechst para visualizar los núcleos (azul; ambos paneles). Las células se visualizaron por microscopía de fluorescencia confocal a 543 nm (AlexaFluor 568) y 405 longitudes de onda de excitación nm (Hoechst). Se muestran las imágenes fusionadas obtenidas en las dos longitudes de onda de excitación. Las barras de tamaño son 100 micras. (B) Expresión de HATL5 (panel superior) o GAPDH (panel inferior) mensaje por análisis de RT-PCR de ARNm extraído de órganos enteros de ratón. (C) El análisis inmunohistoquímico de la expresión HATL5 en tejidos humanos normales. proteína HATL5 se detectó con un anticuerpo de conejo anti HATL5 en musoca esofágico (C1, D1), mucosa cervical (E), la mucosa oral (lengua) (F) y la epiglotis (parte de la laringe supraglótica) (G). Los anticuerpos primarios fueron sustituidos con IgG de conejo no inmune en secciones en serie de todas las muestras y no se observó tinción significativa (puntas de flecha en C2, D2 y no mostrados). se detecta tinción epitelial Strong (puntas de flecha) en las células apicales, escamosas epiteliales en el esófago normal (C1, D1), el cuello uterino normal (E), y la lengua (F) sin tinción significativa en el compartimiento mesenquimales (indicado con asteriscos). A gran aumento, la proteína HATL5 está claramente localizada en la superficie celular de las células epiteliales apical (flecha de cabeza en D1). En la epiglotis (G) de tinción se observó en las células del epitelio suprabasal escamosas además de las células apicales. Epi = epitelio normal. Tamaño barras de todos los paneles; 50 micras.
Para determinar la expresión de HATL5 en los tejidos, se realizó un análisis de RT-PCR de ARN total extraído de una serie de tejidos de ratón adulto (Fig. 4B). Este análisis reveló que HATL5 muestra un perfil de expresión de tejido relativamente restringido, con el ARNm detectado en 4 de los 19 tejidos analizados: el esófago, el cuello uterino, la lengua y los testículos. Una característica común entre el esófago, cuello del útero, y la lengua es que los revestimientos de la mucosa de estos tejidos contienen todos epitelio escamoso estratificado. Esto nos llevó a examinar la distribución y la localización celular de la proteína HATL5 en estos tejidos mediante inmunohistoquímica (IHC). secciones representativas de normal del esófago, cuello uterino, y la cabeza y el cuello (lengua y la epiglotis) mucosa se muestran en la Figura 4C. El uso de secciones en serie, los portaobjetos se probaron con una proteína anti-conejo o HATL5 utilizaron como controles negativos en el que el anticuerpo primario fue sustituido con IgG de conejo no inmune (Fig. 4C y datos no presentados). En los tres tipos de tejidos se detecta una fuerte tinción epitelial en las células escamosas apicales sin tinción significativa en los compartimentos de la submucosa o mesenquimales. proteína HATL5 se localiza principalmente en las superficies celulares de las células escamosas más grandes. Esta localización de la superficie celular está de acuerdo con la distribución esperada de la topología de la membrana anclada predicho de HATL5.