Se conocen
Extracto
desacetilasas de histonas (HDAC) para jugar un papel central en la regulación de varias propiedades celulares interrelacionadas con el desarrollo y progresión del cáncer. Recientemente, HDAC1 se ha informado que se sobreexpresa en el carcinoma hepatocelular (HCC), pero sus funciones biológicas en hepatocarcinogenesis aún no se han dilucidado. En este estudio, hemos demostrado la sobreexpresión de HDAC1 en un subconjunto de líneas celulares de cáncer de HCC y de hígado humano. inactivación HDAC1 resultó en la regresión del crecimiento de células tumorales y la activación de la muerte celular autofágica caspasa-independiente, a través de vía de activación LC3B-II en células Hep 3B. En la regulación del ciclo celular, HDAC1 inactivación inducida selectivamente tanto p21
WAF1 /CIP1 y p27
expresiones Kip1, y al mismo tiempo suprime la expresión de ciclina D1 y CDK2. En consecuencia, HDAC1 inactivación llevó a la hypophosphorylation de PRB en la transición G1 /S, y la actividad de transcripción /DP1 con ello inactivada E2F. Además, hemos demostrado que HDAC1 suprime p21
WAF1 /Cip1 transcripcional actividad a través de sitios de unión Sp1 en el p21
WAF1 promotor /Cip1. Por otra parte, la supresión sostenida de HDAC1 atenuada
in vitro
formación de colonias en y
in vivo
el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto en ratón. Tomados en conjunto, sugerimos la regulación aberrante de HDAC1 en el CHC y su regulación epigenética de la transcripción del gen de la autofagia y componentes del ciclo celular. La sobreexpresión de HDAC1 puede desempeñar un papel fundamental a través de la regulación sistémica de los efectores de la mitosis en el desarrollo de HCC, proporcionando un objetivo potencial particularmente relevante en la terapia del cáncer
Visto:. Xie HJ, Noh JH, JK Kim, Jung KH , Eun JW, Bae HJ, et al. (2012) La inactivación HDAC1 Induce mitótico defectos y la caspasa-independiente de autofagia muerte celular en el cáncer de hígado. PLoS ONE 7 (4): e34265. doi: 10.1371 /journal.pone.0034265
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Septiembre, 2011; Aceptado: February 24, 2012; Publicado: 4 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Xie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Medio Ambiente de Corea a través de "el Eco-21 Technopia proyecto" y Bienestar público & amp; programa de seguridad, a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (desde 2010 hasta 0.020.764); y por la Fundación Nacional de Investigación de Corea subvención (NRF), financiado por el gobierno de Corea (MEST) (Subvención Nº 2011-0010705). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) es un tumor maligno primario de hígado humano y una causa importante de morbilidad y mortalidad. Es el séptimo cáncer más común en todo el mundo, y la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer [1]. En el mecanismo molecular, hepatocarcinogenesis se acepta como un proceso de múltiples pasos que se caracteriza por la acumulación progresiva y la interacción de las alteraciones genéticas que causan crecimiento aberrante y la transformación maligna de las células parenquimatosas del hígado, seguida por la invasión vascular y metástasis [2]. Las firmas del cambio global de la expresión de genes y vías de señalización, que participan en el desarrollo de HCC, fueron investigados por muchos investigadores. Sin embargo, numerosos genes que contribuyen a estas alteraciones todavía no se caracterizan suficientemente.
histona desacetilasas (HDACs) se histona modificando familias de enzimas que regulan la expresión y actividad de numerosas proteínas implicadas tanto en la iniciación y progresión del cáncer, mediante la eliminación de los grupos acetilo, y permitiendo así la estructura de cromatina compacta [3]. HDAC comprenden una familia de 18 genes, que se agrupan en clases I-IV sobre la base de la homología de sus respectivos ortólogos de levadura [4]. HDAC1, como un miembro de la clase que comparten un alto grado de homología de secuencia con Rpd3 de levadura, es un gen regulador global y co-represor transcripcional con la actividad de la histona deacetilasa [5]. La expresión aberrante de HDAC1 aparece común en cánceres del sistema gastrointestinal, y se asocia con la desdiferenciación, una mayor proliferación, invasión, enfermedad avanzada y mal pronóstico [4]. pacientes con HCC con alta expresión de HDAC1 mostraron una mayor incidencia de invasión de células cancerosas en la vena porta, más pobre diferenciación histológica, más avanzado del tumor-nódulo-metástasis (TNM) y la etapa de baja tasa de supervivencia [6]. También se encontró que la expresión de HDAC1 altamente en células de cáncer se correlaciona con la resistencia a la quimioterapia y de mal pronóstico en una serie de carcinomas [7],. Silencio de HDAC1 por el ARN pequeño de interferencia (siRNA) o inhibidor específico MS-275 en las células cancerosas puede o detención en la fase G1 del ciclo celular o en la transición G2 /M, lo que resulta en la pérdida de células mitóticas, inhibición del crecimiento celular, y aumentar el porcentaje de células apoptóticas [10], [11], [12]. Además, HDAC1 caída afectó la motilidad celular y la invasión mediante la regulación de la expresión de E-cadherina [13], [14], y también ha demostrado inducir la autofagia en células HeLa [15], y la senescencia celular en las células de fibroblastos humanos y células de cáncer de próstata [ ,,,0],dieciséis]. Aunque estas funciones moleculares de HDAC1 fueron bien documentados en numerosos resultados anteriores, el papel de HDAC1 en hepatocarcinogenesis no ha sido dilucidado.
En el presente estudio, con el fin de investigar las funciones biológicas de HDAC1 que confieren el potencial oncogénico en HCC humano, se evaluó la regulación aberrante de HDAC1 en un subconjunto de HCC tejidos humanos y examinamos los mecanismos de regulación de HDAC1 en la apoptosis, autofagia y el ciclo celular de las células de HCC. Además,
in vitro
y
in vivo
potencial tumorigénico experimental de HDAC1 se analizaron utilizando líneas celulares estables HDAC1 desmontables.
Resultados
causas de extinción de HDAC1 en mitótico defectos en células de HCC
Hemos informado anteriormente de cambios transcriptómica a gran escala de la lesión preneoplásicas a los HCC humanos manifiestos [17]. A partir de los datos de microarrays primarios, se recapitulan la expresión de HDAC1 en un proceso histopatológico de varios pasos, de los nódulos displásicos de bajo grado (LGDNs) y nódulos displásicos de alto grado (HGDNs) a HCC primaria (grados 1-3) Edmondson. Como se muestra en la Figura 1A, la expresión correspondiente de HDAC1 se aumentó gradualmente de no tumoral para el cáncer manifiesta. Para confirmar la sobreexpresión de HDAC1 en HCC, se realizó un análisis de inmunotransferencia de HDAC1 en un subconjunto de los HCC humanos. Como se muestra en la Figura 1B, HDAC1 parecía estar altamente sobreexpresado en todos los tejidos HCC seleccionados en comparación con los tejidos no cancerosos correspondientes. La expresión de HDAC1 también fue analizado en diez líneas celulares de HCC diferentes (HepG2, Hep3B, PLC /PRF /5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU423, SNU449 y SNU475) y se comparó con tres líneas normales inmortalizadas selectivos celular de los hepatocitos del hígado (THLE -2, THLE-3 y MIHA). Como se muestra en la Figura 1C, la expresión endógena de HDAC1 en todas las líneas celulares de HCC exhibió relativamente mayor que el de las líneas celulares de hepatocitos del hígado normales.
(A) expresión de ARNm de HDAC1 muestra aumento gradual de pre-cáncer a los HCC manifiestos (* p & lt; 0,05). LGDN, bajo grado de los nódulos displásicos; HGDN, de alto grado de los nódulos displásicos; G1-3, Edmondson grados 1-3. (B) Diez pares de tumor (T) y sus tejidos de hígado correspondientes no tumoral (N) se obtuvieron de resecciones quirúrgicas. El nivel de proteína de HDAC1 se evaluó mediante análisis de transferencia Western. (C) Los niveles endógenos de HDAC1 en diez cáncer de hígado y tres líneas de células normales. Un anticuerpo contra GAPDH sirvió como control de carga. (D)-interrupción dirigida de HDAC1 hace que el retraso del crecimiento de líneas celulares de HCC. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT en las líneas celulares indicadas transfectadas con cualquiera de scramble (si-Scr) o HDAC1 siRNA (si-HDAC1). Los datos se expresan como media ± desviación estándar (* p & lt; 0,01). Todas las mediciones se realizaron por triplicado, y cada experimento se repitió al menos dos veces.
A continuación, para explicar las consecuencias biológicas de la expresión aberrante de HDAC1 en hepatocarcinogénesis, la expresión HDAC1 fue abrogada por la interferencia del ARN génica mediada por knock-down en cuatro líneas celulares de HCC diferentes; células HepG2, Hep3B, SNU182 y SNU449. Como se muestra en la Figura 1D, el agotamiento de HDAC1 dio lugar a la reducción significativa del crecimiento de células tumorales (HepG2, Hep3B y SNU449). Este efecto anti-crecimiento podría explicarse en parte por la interrupción de la regulación del crecimiento celular, tales como la detención del ciclo celular, la senescencia celular o apoptosis. Por lo tanto, la próxima explorado los efectos de la supresión de HDAC1 en la regulación del ciclo celular y la apoptosis celular.
La expresión aberrante de HDAC1 mediada por la proliferación de células de cáncer de hígado a través de la desregulación de la expresión de proteínas del ciclo celular G1 /S
el hecho de que la supresión de HDAC1 causó la regresión del crecimiento de células de cáncer de hígado implica que HDAC1 está implicado en la regulación de la progresión del ciclo celular. Por lo tanto, se realizó un análisis del ciclo celular de las células teñidas con PI en transfectantes HDAC1 siRNA usando citometría de flujo. agotamiento HDAC1 condujo a un aumento en la fase G1 por 17,0% con una disminución concomitante en la fase S y G2 /M fase de 1,1% y 15,9%, respectivamente, en comparación con el control (si-Scr) a las 48 h después de la transfección (Figura 2A) . El hecho de que la supresión de HDAC1 causó la detención del ciclo celular en la fase G1 implica que HDAC1 puede modular las actividades de los componentes del ciclo celular que regulan. Por lo tanto, se examinaron los efectos del agotamiento de HDAC1 en las proteínas reguladoras del ciclo celular transición G1 /S. En transición G1 /S, que ha sido bien establecido que los reguladores del ciclo celular negativos, tales como p15
INK4B, p16
INK4A, p18
Ink4c, p19
Ink4d, p21
WAF1 /Cip1 y p27
Kip1, son los moduladores clave que suprimen la ciclina D1 /CDK4 y 6, o ciclina e /CDK2 complejos. Cuando se examinaron estos moduladores del ciclo celular, HDAC1 agotamiento causado selectivos de la inducción de p21
WAF1 /Cip1 y p27
Kip1 entre los reguladores negativos de la transición del ciclo celular en células Hep 3B (Figura 2B). Notablemente HDAC1 inactivación mediante el uso de HDAC1 siRNA no afectar a la expresión endógena de HDAC2, y también causado acumulación de la histona H3 acetilada y H4 HDAC1 lo que implica la inducción-agotamiento específico de p21
WAF1 /Cip1 y p27
Kip1 en células Hep 3B. Además, HDAC1 agotamiento también provocó la supresión concomitante de CDK2 y ciclina D1 (Figura 2C). En general, el complejo de CDK /ciclina activado puede provocar la hiperfosforilación de pRb, que pierde su actividad supresora de tumores, y que permite el aumento de la actividad transcripcional E2F /DP1. Por lo tanto, el próximo investigó si la desregulación de CDK y ciclinas por HDAC1 afecta a la actividad transcripcional de E2F /DP1 en células Hep 3B. Targeted-interrupción de HDAC1 suscitó hypophosphorylation de p130, una isoforma de pRb (Rb2). En consecuencia, algunos de los genes diana aguas abajo del factor de transcripción E2F /DP1, como E2F4, CDC2 y ciclina A, fueron significativamente las reguladas (Figura 2D). Además, para validar estos resultados y para confirmar los niveles de transcripción de los genes expresados diferencialmente, hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para
HDAC1
,
CDKN1A gratis (p21
WAF1 /Cip1),
CDKN1B gratis (p27
Kip1),
CDK2
y los genes
CCND1 gratis (ciclina D1). Como se muestra en la figura 2E, las células Hep 3B HDAC1-agotado mostraron expresión muy bajo HDAC1 endógeno. También pudimos confirmar que ambos
CDKN1A gratis (p21
WAF1 /Cip1) y
CDKN1B gratis (p27
Kip1) fueron significativamente hasta reguladas por la inactivación HDAC1. A la inversa,
CDK2
y
CCND1
se parecía ser baja regulado por HDAC1 inactivación (Figura 2E). Estos resultados sugieren que la regulación exclusiva de proteínas del ciclo celular, tales como p21
WAF1 /Cip1, p27
Kip1, ciclina D1 y CDK2 por la sobreexpresión HDAC1 ejerce una estimulación mitogénica muy potente durante la progresión del cáncer de hígado.
células Hep3B se transfectaron con control (ninguno), lipofectamina solamente (Reag), 100 nmol /L revueltos siRNA (si-Scr) o 100 nmol /L de siRNA-HDAC1 específico (si-HDAC1). (A) El análisis de citometría de flujo se llevó a cabo con yoduro de propidio (PI) tinción en la supresión de HDAC1 en células Hep 3B. Se realizaron dos experimentos independientes con los mismos resultados. (B) Para determinar la supresión de la actividad HDAC1, expresiones de proteínas de H3 acetil-histona H4 y se determinó por inmunotransferencia. expresiones de proteína de los reguladores negativos de la transición del ciclo celular G1 /S también se evaluó en células Hep 3B HDAC1-agotado. (C) La supresión de las CDK y ciclinas de G1 /S de transición por el agotamiento HDAC1. (d) los efectos del agotamiento de la HDAC1 en pRb y E2F /DP1 expresiones de genes diana. (E) Validación de la expresión de mRNA de HDAC1 genes regulados por análisis de PCR cuantitativa en tiempo real. El nivel de expresión relativa de cada gen se normalizó a GAPDH mRNA en la misma muestra. nivel de expresión de la proteína se cuantificó mediante ImageJ y normalizado para GAPDH. Los valores se dan como factor de cambio con relación a los tansfectants si-Scr. El nivel de proteínas relativa se muestra como gráficos de barras en el lado derecho de cada inmunoblot (* p & lt; 0,05). Todos los experimentos se repitieron tres veces con los mismos resultados. Se muestra un resultado típico de tres experimentos realizados.
Varios estudios han demostrado que los inhibidores de HDAC activan fuertemente la expresión de p21
WAF1 /Cip1 mediante el aumento de la acetilación de histonas de la p21
WAF1 /promotor Cip1 incluyendo SP1- sitio de unión mediante la liberación de la HDAC represor de su unión [18], [19]. Además, hubo algunas evidencias de que la expresión endógena de p21
WAF1 /Cip1 está regulada a nivel de transcripción mediante la contratación de HDAC1 a la p21
WAF1 /Cip1 promotor de la región [20], [21]. Nuestros resultados actuales sugieren también que la represión transcripcional de p21
WAF1 /Cip1 través de HDAC1 unión en su región promotora es predominante en las células de cáncer de hígado. Para validar esta implicación, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina con la PCR cuantitativa (chip-qPCR) para p21 indicada
WAF1 /CIP1 regiones promotoras que habían sido analizados en nuestro informe anterior (Figura 3A) [22]. Se encontró que HDAC1 está muy asociada con la región proximal de la p21
promotor WAF1 /Cip1 (región D en la Figura 3B). Este resultado fue validado por análisis de chip-qPCR con la misma región promotora de p21
WAF1 /Cip1 (región D), y que mostraron que el estado de acetilación de la histona H3 y /o H4 se mejora en el locus genómico por la abrogación de HDAC1 (Figura 3C).
(A) Un esquema del p21
WAF1 promotor /Cip1 que representa a las regiones analizadas por chip-qPCR (barras negras, A-D). (B) La asociación de HDAC1 en el p21
promotor WAF1 /Cip1 se evaluó mediante la amplificación de cada región se inmunoprecipitaron con HDAC1. La cantidad de ADN precipitado por cualquiera de anti-HDAC1 o IgG de control se expresó como porcentaje de la entrada de ADN genómico total. El resultado de cuatro experimentos independientes se muestran como media ± desviación estándar. (C) acetilaciones de la histona H3 y H4 asociado con el p21 proximal
promotor WAF1 /Cip1 se incrementó mediante la inhibición de asociación de HDAC1. células Hep3B se transfectaron transitoriamente con el control (si-Scr) o HDAC1 siRNA (si-HDAC1) durante 48 h, y se sometieron a análisis de chip-qPCR utilizando H3 histona acetil-(anti-Ac-H3) o H4 (anti-Ac- H4) anticuerpo o control IgG. ADN genómico precipitado se amplificó para el promotor proximal de la p21
WAF1 /Cip1 locus (región D) por PCR en tiempo real. La cantidad de ADN precipitado se expresó como porcentaje de la entrada de ADN genómico total. El resultado de tres experimentos independientes se muestran como media ± desviación estándar. (D) HDAC1 regula p21
transcripción WAF1 /Cip1 a través de sitios de unión Sp1 en el p21
promotor WAF /Cip1. Los constructos indicados, PWWP, pWPdel-BstXI, pWP101, pWPmt-Sp1-3, pWPmt-Sp1-5,6, pWPdel-SmaI y Sp1-luc se transfectaron transitoriamente en células Hep 3B, con 100 nmol /L revueltos siRNA (Si- Scr) o 100 nmol siRNA /L HDAC1 específico (si-HDAC1), respectivamente. Se midió la actividad del promotor, y se calculó veces de inducción por el agotamiento HDAC1. A la izquierda, se muestra el esquema de cada construcción. Todos los datos se muestran como la media ± SD (n = 3) (* p & lt; 0,05).
Como se describió anteriormente, no se enriquecen los sitios Sp1-Licitación en la región D. Por lo tanto, el próximo investigó si HDAC1 suprime p21
WAF1 expresión /Cip1 a través de sitios de unión Sp1 en el p21
WAF1 /Cip1promoter. Para confirmar esto, se realizó el ensayo de indicador con construcciones indicadoras se describe en Materiales y métodos. Como se muestra en la figura 3D, las células Hep 3B HDAC1 deficiente (SI-HDAC1) exhiben una mayor actividad de la luciferasa en la presencia de sitios de unión Sp1-, que contiene al menos Sp1-3 a Sp1-6 (PWWP, pWPdel-BstXI y pWP101). Sin embargo, p21
actividad de transcripción WAF1 /Cip1 no fue inducida por formas mutantes de Sp1-5,6 (pWPmt-Sp1-5,6) en las células del SI-HDAC1. Curiosamente, p21
WAF1 /Cip1 transcripción todavía se indujo mediante dos plásmidos mutantes (es decir, pWPdel-SmaI y Sp1-luc) que tienen dos o tres repeticiones en tándem del sitio Sp1 de unión cerca de la caja o de la transcripción de inicio del sitio TATA. Este resultado indica que la región proximal alrededor de la caja TATA de p21
Se espera que el promotor WAF1 /Cip1 ser un importante regulador de p21 sitio
WAF1 /Cip1 la transcripción por HDAC1 en células Hep 3B.
Targeted- la inhibición de la HDAC1 induce la muerte celular por autofagia de las células Hep 3B
estudios recientes sugieren que el tratamiento con inhibidores de la histona deacetilasa inducida no sólo, sino también la muerte celular por autofagia apoptosis [23], [24], [25]. También se encontró que desmontables de HDAC1 induce la muerte celular autofágica en células HeLa [15]. Por lo tanto, hemos explorado los efectos de la supresión de HDAC1 en la activación de la muerte celular en células Hep 3B. Como se muestra en la Figura 4A, el análisis de citometría de flujo para la medición de las células con anexina V teñidas no mostraron inducción significativa de células apoptóticas en comparación con el control (si-Scr). Además, HDAC1 agotamiento no afectó la expresión de componentes de pro-apoptóticos, tales como AIF, Bax y Apaf-1, ni tampoco causar la caspasa-3 y PARP de escisión (Figura 4B). Estos resultados indicaron que la sobreexpresión de HDAC1 no afectó principalmente la señal apoptótica en HCC.
(A) El análisis de citometría de flujo se llevó a cabo a través de Anexina V-FITC y PI etiquetado tinción en la supresión de HDAC1. Doble tinción con Anexina V-FITC y PI indica que la cantidad de células en la etapa tardía de la apoptosis se incrementó ligeramente (superior derecha) en las células Hep 3B HDAC1-agotado. Se realizaron dos experimentos independientes con los mismos resultados. (B) Tanto PARP y caspasa 3 escisión no fueron detectados por inhibición HDAC1. Todos los experimentos se repitieron tres veces con los mismos resultados.
A continuación, para determinar si la inactivación HDAC1 provoca la activación de la muerte celular autofágica, hemos examinado la estructura microscópica de las células por microscopía electrónica de transmisión (TEM) en HDAC1 células Hep 3B -agotadas. Como era de esperar, aproximadamente el 40-45% de las células transfectadas con siRNA HDAC1 desarrollado vacuolas autofágicas después de 72 h de post-transfección (Figura 5A). A mayores aumentos, la mayoría de las vacuolas contenían material electrón denso y orgánulos degradadas. En contraste, el control de siRNA (si-SCR) las células transfectadas se meramente vacuoladas, y se observaron menos células que contienen vacuolas en el citoplasma (derecha dos paneles en la Figura 5A). 1 proteína de cadena ligera asociada a los microtúbulos 3 (LC3) es un marcador común para la detección de la autofagia. LC3 es modificada después de la traducción por la eliminación de su C-terminal para producir LC3-I (~ 18 kDa), con lipidación fosfatidiletanolamina dando lugar a LC3-II (~ 16 kDa). Enriquecimiento de membrana LC3-II en autofagosomas es un fenómeno característico de muerte celular autofágica y la cantidad de LC3-II se correlaciona bien con el número de autofagosomas. En nuestros experimentos, HDAC1 knockdown aumentó significativamente la conversión de LC3B-I en LC3B-II tanto como ceramida, un inductor potente autophgy, hizo en células Hep 3B (Figura 5B). En contraste, el tratamiento con 3-metiladenina (3-MA; un inhibidor específico de la autofagia) impidió la conversión LC3B-I a LC3B-II por la inactivación HDAC1 en células Hep 3B (carril 5 en la Figura 5B). Además, la tinción de inmunofluorescencia para LC3B reveló que las manchas en forma de anillo inducidas HDAC1 inactivación distribuidas de manera uniforme a lo largo de citoplasma, lo que indica una asociación entre LC3 y las membranas autophagosomal, y esta asociación fue bloqueada significativamente por el tratamiento 3-MA (Figura 5C). De acuerdo con este resultado, la reducción de la viabilidad celular causada por la inactivación HDAC1 fue bloqueada eficazmente por tratamiento 3-MA (Figura 5D). Estos resultados sugieren que la HDAC1 desmontables activa la muerte celular autofágica en células de HCC. Curiosamente, también se encontró que HDAC1 inactivación no afectó Beclin-1, que participa en las primeras etapas de la autofagia, y que promueve la nucleación de vesículas autofágicos, y el reclutamiento de proteínas de citosol [26]. Este implicado que la inactivación inducida HDAC1 Beclin-1 autophay independiente en células Hep 3B. Para verificar que la inactivación HDAC1 media la muerte celular por autofagia LC3B-dependiente, LC3B fue silenciado en células Hep 3B. Como se muestra en la Figura 5E, la conversión LC3B-II inducida por HDAC1 inactivación fue completamente bloqueado por caída LC3B en células Hep 3B. Además, la disminución de la viabilidad celular mediante la inactivación HDAC1 se restauró significativamente por la co-transfección de LC3B siRNA en células Hep 3B (Figura 5F). En conjunto, estos resultados sugieren que la HDAC1 inactivación contribuye la muerte celular independiente de caspasas a través de la autofagia LC3-dependiente en células Hep 3B.
células (A) Hep3B se transfectaron con HDAC1 siRNA (100 nmol /L) durante 72 h, se fijaron y examinado bajo el microscopio electrónico de transmisión (TEM) (izquierda) dos paneles. Con un aumento mayor, se observaron autofagosomas que contienen material electrón denso y orgánulos en las células degradadas HDAC1 deficiente. En contraste, se observó una gran cantidad de mitocondrias intactas en células Hep 3B transfectadas por si-Scr (derecha) dos paneles. Las flechas indican la presencia de autofagosomas. (B) Después de desmontables de HDAC1, la conversión LC3 (LC3B-I a LC3B-II) se incrementó notablemente, mientras que el nivel de Beclin 1 no cambió. Tratamiento paralelo con 5 mM de 3-MA durante 48 h inhibieron la activación LC3B-II inducida por HDAC1 caída. células Hep 3B también se trataron con 25 ceramida mu M durante 24 h como control positivo para la autofagia. El resultado densitometría de las inmunotransferencias se muestra como un gráfico de barras (media ± DE). expresiones de proteína relativos de HDAC1, LC3B-II y Beclin 1 se normalizaron con el nivel de expresión de control (si-Scr) (* p & lt; 0,05). (C) En el análisis de inmunofluorescencia, la expresión citosólica de LC3B fue inducida por la caída HDAC1, y que fue revertida por el tratamiento con 3-MA en células Hep 3B. análisis (D) MTT muestra que la viabilidad celular fue una regresión por caída HDAC1 en células Hep3B. El número de células viables se incrementó en el tratamiento paralelo de 3-MA durante 48 h (* P & lt; 0,05). (E) La co-transfección de siRNA dirigidos LC3B y /o HDAC1. La conversión LC3B fue inducida por la si-HDAC1 en ausencia de si-LC3B. El nivel de proteínas se cuantificó mediante ImageJ y normalizado para GAPDH. Gráfico de barras que muestra la relación relativa a si-Con transfectante (* p & lt; 0,05). (F) MTT análisis muestra que la viabilidad de células se recuperó al parecer en presencia de Si-LC3B en HDAC1 desmontables células Hep 3B (* P & lt; 0,05, si-si-HDAC1 + LC3B vs si-HDAC1).
sostenida supresión de HDAC1 atenúa potencial tumorigénico de las células Hep 3B tanto
e in vitro
in vivo
Nuestros resultados mostraron que la interrupción transitoria de HDAC1 causó
in vitro
muerte celular por autofagia y la detención del crecimiento en células Hep 3B. Por lo tanto, para investigar si la supresión estable de HDAC1 conduce a la supresión de hepatocarcinogenesis, establecimos líneas celulares de HDAC1 desmontables estables (HDAC1KD#1 y HDAC1KD 2 #), y confirmó la inactivación de HDAC1 mediante la detección de p21
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Kip1 la inducción y la reducción de CDC2 en líneas celulares establecidas (Figura 6A). Luego se evaluó la tasa de crecimiento de las líneas celulares establecidas. Como se muestra en la Figura 6B, HDAC1KD células#1 mostró la tasa de crecimiento reducida, en comparación con ya sea Mock-transfectante (Mock#1) o células parentales Hep3B (ninguno). Sobre la base de este resultado, el próximo realizó la formación de colonias de ensayo como se describe en materiales y métodos. El crecimiento celular clonal fue significativamente atenuada por la supresión sostenida de HDAC1 en HDAC1KD células#1, en comparación con el control (Mock#1) (Figura 6C, p & lt; 0,05). Por último, para demostrar que la sobreexpresión HDAC1 contribuye a hepatocarcinogénesis
in vivo
, nosotros, las líneas celulares establecidas inyectada por vía subcutánea (es decir HDAC1KD nº 1 o Mock#1) en ratones desnudos atímicos. La tasa de crecimiento de tumores en general y el volumen se redujo significativamente en HDAC1 línea celular deficiente (HDAC1KD#1) en comparación con el control (Mock#1) (Figura 6D, p & lt; 0,05). A los 37 días después de la inoculación, la masa tumoral fue detectable en el grupo Mock. Por el contrario, en los ratones que fueron inyectados con HDAC1KD#1, la masa del tumor fue detectable solamente en 48 días después de la inoculación. El volumen medio del tumor en el sacrificio fue mucho menor en el grupo inyectado con HDAC1KD#1 que las células Mock#1 (Figura 6E, p & lt; 0,05). Además, el análisis de inmunotransferencia reveló que la expresión de p21
WAF1 /Cip1, p27
Kip1 y LC3B-II se indujeron de manera significativa en los tejidos de xenoinjerto HDAC1 deficientes (Figura 6F, p & lt; 0,05). Estos resultados implican que la supresión de HDAC1 contribuye a la inhibición de la hepatocarcinogenesis
in vivo
.
(A) La confirmación de la supresión HDAC1 mediante la detección de sus genes diana específicos en la regulación del ciclo celular. Se mostró un resultado típico de tres experimentos independientes. Las expresiones de proteína se cuantificaron y se normalizaron a GAPDH, y se muestran como relación relativa a Mock. (B) la tasa de crecimiento celular de las células Hep 3B expresan de forma estable un shRNA revueltos (Mock#1) o HDAC1 shRNA (HDAC1KD#1) se determinó por recuento de ensayo en cada punto de tiempo indicado. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos. (C)
in vitro
ensayo de formación de colonias en. clones de células que expresan revueltos shRNA (Mock#1) o HDAC1 shRNA (HDAC1 KD#1) se mantuvieron en placas de 6 pocillos. El gráfico de barras indica el número de colonias. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (* p & lt; 0,05, HDAC1KD#1 vs Mock#1). (D) el crecimiento tumoral global de xenoinjertos de células Hep 3B. (E) Los ratones se sacrificaron a los ochenta días después de la inyección, y se midió el peso del tumor. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (* p & lt; 0,05). (F) En el momento del sacrificio, los tumores de xenoinjertos fueron extirpados, y la proteína total extraído de cinco ratones seleccionados al azar de cada grupo se sometió a análisis de transferencia de Western usando los anticuerpos indicados. Las expresiones proteína se normalizaron a los de GAPDH, y el nivel de expresión relativa de cada proteína se representan como gráfico de barras (* p & lt; 0,05)
Discusión
desacetilasas de histonas (HDAC. ) representan una familia de enzimas que cooperan con la histona acetiltransferasa de modular la estructura de la cromatina y la actividad transcripcional a través de cambios en el estado de acetilación de las histonas del nucleosoma [27]. La acumulación de evidencias han sugerido que las HDAC regulan tanto la expresión y actividad de numerosas proteínas implicadas tanto en la iniciación y progresión del cáncer [27], [28]. Recientemente, varios estudios han demostrado que ciertas familias de HDAC se expresan de manera aberrante en tumores y tienen la función redundante en el desarrollo del cáncer [4], [29]. Consistentemente, la creciente evidencia sugiere la expresión aberrante de HDAC1 en las enfermedades neoplásicas, y demostró que HDAC1 agotamiento provoca la detención del crecimiento y la apoptosis de ciertas células cancerosas humanas [10], [27], [29]. Sin embargo, el papel de HDAC1 en hepatocarcinogenesis no se ha aclarado todavía. En este estudio, hemos sugerido que la abrogación de la expresión aberrante de HDAC1 activa la muerte celular autofágica caspasa-independiente y detuvo la transición del ciclo celular G1 /S en células Hep 3B humanos, y por lo tanto suprime el crecimiento de células tumorales en el modelo animal de xenoinjerto.
En un estudio reciente de cáncer gástrico, se informó de la expresión HDAC1 que se sobreexpresa y tenía un valor pronóstico para el cáncer gástrico [8]. La inducción de HDAC1, 2, 3 niveles de expresión también implicado significativamente redujo la supervivencia del paciente en el cáncer de colon [30]. La contribución de la expresión HDAC1 a la transformación maligna de hígado normal también se estudió en un modelo de ratón transgénico [31]. Por otra parte, un informe reciente sugiere que tanto HDAC1 y HDAC2 regula cooperativamente la proliferación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y tuvo un papel esencial para la diferenciación hematopoyética [32]. En el carcinoma hepatocelular, la expresión de alto HDAC1 se asoció con la invasión de células de cáncer en la vena portal, pobre diferenciación histológica y baja supervivencia de los pacientes [6]. Esto también fue confirmado por nuestros datos previamente publicados microarrays de expresión basada en el ARNm completos [17]. De estos genes atípicos asociados con múltiples pasos hepatocarcinogénesis, hemos recapitulado expresión HDAC1 y mostró altamente sobreexpresión en HCC manifiesta. El análisis por inmunotransferencia de HDAC1 en un subgrupo de tejidos HCC humanos y líneas celulares de cáncer de hígado demostró la sobreexpresión de HDAC1 en los HCC, y-interrupciones dirigidas de HDAC1 causado el retraso del crecimiento en varias líneas celulares de HCC (Figura 1). Las evidencias sugieren que la sobreexpresión de acumulación HDAC1 aparece especialmente común en cánceres del sistema gastrointestinal y se asocia con la desdiferenciación, una mayor proliferación, invasión, enfermedad avanzada y mal pronóstico. Sin embargo, se ha hecho ningún intento de explicar los mecanismos subyacentes responsables de la potencial oncogénico de HDAC1 en el CHC. por lo tanto, se evaluaron los efectos de la inactivación HDAC1 en las proteínas reguladoras en el mecanismo de crecimiento de las células y la muerte.
Ha sido bien informado de que la represión mediada por HDAC de genes puede causar el crecimiento celular incontrolado, como HDACs reprimen la transcripción de ciclina inhibidores dependientes de quinasa (CDKIs), permitiendo continua proliferación [27]. En las células de osteosarcoma y cáncer de mama, se informó de que la caída de HDAC1 resultó en la detención del ciclo celular, ya sea en el G1 o fase de transición G2 /M, y aumentó el porcentaje de células apoptóticas [10]. Nuestros resultados indican que la interrupción de p21 inducida HDAC1
WAF1 /Cip1 y p27
Kip1 expresiones que ello implique la inhibición de la transición G1 /S del ciclo celular (Figura 2B). Además, HDAC1 knockdown suprimió la expresión de la ciclina D1 y CDK2 (Figura 2C).