Extracto
HER2 está sobreexpresado en el 15-20% de los cánceres de mama. La sobreexpresión de HER2 se sabe que reduce la apoptosis, pero los mecanismos subyacentes de esta asociación siguen sin estar claros. Para dilucidar los mecanismos de supervivencia de HER2-mediada, se investigó la relación entre HER2 y p53 upregulated modulador de la apoptosis (PUMA), un potente inductor de la apoptosis. Nuestros resultados mostraron que HER2 interactúa con PUMA, que era independiente de la activación de HER2. Además, se observó que HER2 interactuó con PUMA tanto en la mitocondria y los compartimentos no mitocondriales. A continuación examinó si HER2 fosforila PUMA. En particular, nunca se ha informado de fosforilación de la tirosina PUMA. El uso de un ensayo intracelular, encontramos PUMA ser fosforilados en células de cáncer de mama con HER2 activado. Via ensayo HER2 quinasa libre de células, se observó que PUMA se fosforiló directamente por HER2. La activación de HER2 disminuyó proteína PUMA vida media. Para identificar cuál de las tres tirosinas dentro de PUMA son el blanco de HER2, se generaron tres mutantes fosforilación no PUMA cada uno con una única sustitución de Tyr → Phe. Los resultados indicaron que cada PUMA único mutante había perdido algo, pero no todo fosforilación de HER2 que indica que los objetivos de las tres tirosinas de HER2. En consecuencia, hemos creado un mutante adicional PUMA con las tres tirosinas mutado (TM-Puma) que no pudo ser fosforilados por HER2. Es importante destacar que, TM-PUMA se encontró que tenía una vida media más larga que PUMA. Se observó una asociación inversa entre HER2 y PUMA en 93 muestras de carcinoma de mama invasivo. Hemos encontrado además que TM-PUMA suprimió el crecimiento de células de cáncer de mama en un grado mayor que PUMA. Además, TM-PUMA tenía una propensión más fuerte para inducir la apoptosis de PUMA. En conjunto, nuestros resultados demuestran, por primera vez, que PUMA puede ser fosforilada en tirosina y que la fosforilación mediada por HER2 desestabiliza la proteína PUMA. La interacción HER2-PUMA representa un nuevo mecanismo por el cual se regula PUMA y una nueva base molecular para el crecimiento HER2-mediada y la supervivencia de las células cancerosas
Visto:. Carpintero RL, Han W, de la pata I, Lo HW ( 2013) HER2 fosforila y desestabiliza pro-apoptótica PUMA, lo que antagoniza apoptosis en células cancerosas. PLoS ONE 8 (11): e78836. doi: 10.1371 /journal.pone.0078836
Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de agosto de 2013; Aceptado: September 24, 2013; Publicado: 13 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Carpenter et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención K01-CA118423 y W81XWH-11-1-0600 del Departamento de Defensa de Estados Unidos, la Fundación Pediatric Brain tumor Foundation Beez y la División de Ciencias quirúrgicas intramural Dani P. Bolognesi, Doctor en Filosofía. Premio y Clarence Gardner, Ph.D. Premio (a H-WL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las tasas de cáncer de mama están disminuyendo pero sigue siendo una amenaza significativa para la salud pública. Las estimaciones actuales indican que habrá 300.000 nuevos casos y 40.000 muertes por cáncer de mama en 2013 [1]. Se estima que habrá más casos nuevos de cáncer de mama en las mujeres que cualquier otro tipo de cáncer en 2013 [1]. HER2 está sobreexpresado en el 15-20% de los cánceres de mama humanos y esto sobreexpresión se asocia con pobres resultados de los pacientes, incluyendo la disminución de la supervivencia global, el aumento de la recaída del tumor, y la enfermedad más agresiva [2] - [4]. la activación de HER2 se produce por la heterodimerización con otros receptores de la familia erbB, tales como heregulina se unen a HER3 que luego heterodimerizan con HER2 para activar las vías HER2 aguas abajo [5].
La sobreexpresión de HER2 se conoce para reducir la apoptosis. Pro-apoptóticos y anti-apoptóticas Bcl-2 proteínas controlan la vía apoptótica intrínseca en la mitocondria. correlaciones positivas se han encontrado entre la expresión de HER2 y de las proteínas anti-apoptóticas tales como Bcl-xL, MCL-1 y Bcl-2 [6] - [8]. Además, la expresión forzada de HER2 causó aumento de los niveles de proteína de las proteínas anti-apoptóticas tales como Bcl-2 y Bcl-xL mientras que la inhibición de HER2 redujo MCL-1 y el aumento de la expresión de Bax [6], [7], [9]. HER2 también puede activar PI3K-AKT y ERK1 /2 de señalización, que puede regular la apoptosis mediante el control de la expresión génica, tales como la regulación positiva de survivina, y la regulación después de la traducción, tales como la fosforilación e inactivación de pro-apoptótico de Bad [10], [11 ]. HER2 regulación de la apoptosis se ha observado principalmente estar mediada por la señalización aguas abajo, mientras que la regulación directa de proteínas Bcl-2 por HER2 no se ha evaluado.
El
PUMA
gen fue identificado por primera vez en 2001 [ ,,,0],12], [13] como una pantalla para los objetivos de la transcripción de p53. El
BBC3
gen fue identificado poco después por levadura de dos híbridos y ADNc de este gen igualaron la de PUMA [14]. Este descubrimiento posterior de la
BBC3
gen también estableció que PUMA expresión puede ser inducida por estímulos apoptóticos independientes de p53 [14]. PUMA contiene dos dominios funcionales en el la señal de localización mitocondrial (MLS) [15], [16] C-terminal, el dominio BH3 y. La actividad funcional de PUMA es iniciada por proteína de direccionamiento a la membrana mitocondrial externa donde PUMA interactúa con los miembros de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas inhibiendo su supresión de Bax y Bak [12], [17]. La inhibición de miembros de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas conduce a la activación de las proteínas pro-apoptótica Bax /Bak desencadenantes permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MOMP) y la liberación de citocromo C [12], [16], [17]. Citoplasmática del citocromo C en última instancia, forma la apoptosome conduce a la activación de las caspasas efectoras 3/9 y la apoptosis. La pérdida de actividad PUMA se ha asociado con varios tipos de cáncer. La deleción de una porción del cromosoma 19, donde
PUMA
gen se localiza el, ha sido reportado en múltiples tipos de cáncer [13], [18], [19]. Además,
PUMA
es un gen p53 inducible y p53 tiene mutaciones en más de 40% de los cánceres [20]. En consecuencia, el deterioro de la inducción PUMA se ha observado con la mutación de p53 o supresión [13], [21]. Además, las células de cáncer con PUMA eliminados tienen una alta resistencia a las terapias de p53 inducible tales como agentes que dañan el ADN, UV, y radiación gamma entre otros [19]. Sin embargo, varios estudios han informado de que PUMA expresión puede ser inducida por mecanismos independientes de p53 [19], [22] - [25].
Un enlace directo entre HER2 y PUMA no se ha investigado. Tampoco se sabe si PUMA se somete a la fosforilación de la tirosina. En este estudio, hemos descubierto un nuevo hallazgo que PUMA puede ser fosforilada en restos de tirosina directamente por HER2. Además, la fosforilación por PUMA HER2 conduce a PUMA desestabilización y la supervivencia celular. También se muestra que un mutante de PUMA que no pueden ser fosforilados en residuos de tirosina (TM-PUMA) tiene una mayor capacidad para inducir la apoptosis. Tomados en conjunto, nuestro estudio reveló una novela HER2 → PUMA eje que representa un nuevo mecanismo por el cual se regulan las proteínas PUMA y la muerte celular mediada por PUMA señalización. Nuestros resultados también proporcionan pruebas que implican a PUMA en la regulación como una nueva base molecular para el crecimiento y la supervivencia de HER2-mediada.
Materiales y Métodos
Células y cultivo celular
MDA-MB -453, MCF-7, BT-474, y SK-BR3 líneas celulares de cáncer de mama humano se obtuvieron de American Type Culture Collection, ATCC (Manassas, VA). células MDA-MB-453 se mantuvieron en Leibovitz L-15 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en dióxido de carbono 0%. Células MCF-7 se mantuvieron en medio MEM suplementado con 10% FBS, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y la insulina bovina 10 mg /ml. células BT-474 se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% FBS. células SK-BR3 se mantuvieron en medio de McCoy 5A suplementado con 10% FBS. MCF-7 células /HER2 se mantuvieron en medio MEM suplementado con 10% FBS, piruvato sódico 1 mM, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, 10 ug insulina bovina /ml y 350 mg /ml G418.
Productos químicos y Reactivos
Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario. La cicloheximida se adquirió de Amresco (Solon, OH), MG132 se adquirió de Calbiochem (San Diego, CA), anisomicina se adquirió de Life Sciences Enzo (Farmingdale, NY), y Lapatinib se adquirió de LC Laboratories (Woburn, MA). anticuerpos de tubulina, β-actina, e IgG se compraron de Sigma. anticuerpo HA se adquirió de Roche (Indianápolis, IN), anticuerpo PARP-1 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), el anticuerpo de la COX IV fue adquirido de Abcam (Cambridge, MA), y el anticuerpo 4G10 se adquirió de Millipore ( Billerica, MA). PUMA, HER2, y fósforo-HER2 (Y1248) anticuerpos fueron adquiridos de Tecnologías de Señalización Celular (Danvers, MA).
Los plásmidos
El plásmido PHA-PUMA fue proporcionado amablemente por el Dr. Bert Vogelstein a través de Addgene plásmido 16588 [13]. Generación de pumas único mutante (Y58F-PUMA, Y152F-PUMA, y Y172F-PUMA), así como la triple mutante (Y58F /Y152F /Y172F-PUMA) se realizó utilizando un kit QuikChange mutagénesis dirigida (Agilent Technologies, Santa Clara , CA) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores usados para la mutagénesis fueron los siguientes: Y58F-Forward 5'-TGCCCGCTGCCTTTCTCTGCGCCCCCA-3 ', Y58F-inverso 5'-TGGGGGCGCAGA GAAAGGCAGCGGGCA-3', Y152F-Forward 5'-CTCAACGCACAGTTTGAGCGGCGGAGA-3 ', Y152F-inverso 5'-TCTCCGCCGCTCAAACTGTGCGTTGAG- 3 ', Y172F-Forward 5'-TCACCTGGAGGGTCCTGTTCAATCTCATCAT-3' y 5 'Y172F-Reverse-ATGATGAGATTGAACAGGACCCTCCAGGGTGA-3'. La mutación se confirmó por secuenciación.
inmunoprecipitación /Western Blotting (IP /WB)
Las células se lisaron con tampón RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% NP 40, 0.1% de SDS, 1% desoxicolato de sodio) suplementado con inhibidores de proteasa /fosfatasa seguido de sonicación y recogida de sobrenadante. extractos de células enteras fueron pre-borran con IgG de conejo 1 mg y 20 l de proteína-A-agarosa durante 1 hora a 4 ° C. Los lisados aclarados se incubaron con 1 mg HER2 o PUMA anticuerpo o control IgG de conejo a 4 ° C durante la noche con agitación. Después, se añadió proteína A-agarosa y se incubaron a 4 ° C durante 60 minutos con agitación. gránulos de Proteína A-agarosa se recogieron y se lavaron varias veces con tampón RIPA a 4 ° C. sedimentos lavados se hirvieron y se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia como se ha descrito anteriormente [26]. Determinación de la fosforilación de la tirosina PUMA se determina mediante inmunoprecipitación de PUMA seguido por inmunotransferencia utilizando anti-fosfo-tirosina anticuerpo 4G10 Platino (Millipore).
libre de células HER2 Ensayos de quinasa
Proteína recombinante humana PUMA ( Origene, Rockville, MD) se desfosforiló con la proteína PTP1B humana recombinante a 30 ° C seguido de PTP1B inactivación a 65 ° C. después se desfosforila PUMA se incubó con la proteína HER2 humana recombinante (Promega, Madison, WI) y ATP a 30 ° C. a continuación, la muestra se hirvió y se sometió a SDS-PAGE e inmunotransferencia utilizando anti-fosfo-tirosina anticuerpo 4G10 Platino (Millipore).
inmunoprecipitación-quinasa ensayo
Las células fueron transfectadas con plásmidos PUMA HA-etiquetados y se recogieron los lisados de células como se describe anteriormente. Inmunoprecipitadas se realizó con anticuerpo de HA como se describió anteriormente. Después de lavados, la proteína de gránulos A-agarosa se desfosforila con PTP1B humana recombinante seguido de incubación con HER2 humana recombinante como se describió anteriormente. Las muestras fueron luego hervidos y se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia usando anticuerpos anti-fosfo-tirosina anticuerpo 4G10 Platinum (Millipore).
Ensayos de formación de colonias
Después de la transfección de las células plásmidos indicados fueron sembradas en 6 -Bueno placas de cultivo para determinar el crecimiento clonogénico dependiente de anclaje como hemos descrito anteriormente [27]. Después de la transfección, las células también se sembraron en placas de 6 pocillos con agarosa para determinar el crecimiento clonogénico independiente de anclaje. Wells pre-revestido con una capa inferior de 0,5% de agarosa y las células se sembraron en la capa superior con 0,35% de agarosa. Después de 2-4 semanas, las colonias con o sin agarosa se tiñeron con solución de azul de cristal violeta (Sigma) durante 1 hora y se contaron las colonias con un microscopio. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Evaluación de la apoptosis
Las células se transfectaron con plásmidos indicados, tratados con los compuestos indicados, y se recogieron con tripsina /EDTA. La apoptosis se determinó entonces utilizando FITC-anexina V /yoduro de propidio kit de detección de BD Pharmingen (San Jose, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células fueron analizadas por citometría de flujo utilizando un flujo BD FACSCalibur citómetro. PARP-1 de escisión se determinó usando inmunotransferencia de los lisados celulares después de la transfección y el tratamiento indicado.
Determinación de niveles PUMA mitocondriales
fraccionamiento mitocondrial se realizó usando un kit de ensayo de Pierce /Thermo Scientific (Rockford, IL), según las instrucciones del fabricante, tal como se ha descrito anteriormente [26]. Brevemente, la proteína se aisló a partir del extracto mitocondrial (ME) y el extracto no mitocondrial (NME). El ME y NME se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia. Banda intensidades fueron medidos utilizando el software ImageJ NIH. El grado de PUMA localización mitocondrial (Índice mtPUMA) se calcula utilizando la densidad de la banda con la siguiente ecuación:.% ME es el porcentaje del total de EM cargado y NME% es el porcentaje del total de NME cargado para inmunotransferencia
La inmunohistoquímica de muestras tumorales clínicas
Las láminas fueron comprados de nosotros Biomax (Rockville, MD). Evaluación de la intensidad de HER2 (0-3 +) fue completada por los Estados Unidos Biomax. PUMA detección se realizó como se describió anteriormente [28]. Las láminas fueron incubadas con anticuerpos PUMA (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA). puntajes histológicos (H-scores) se calcularon a partir tanto porcentaje de positividad (A%, A = 1-100) y la intensidad (B = 0-3 +) mediante la siguiente ecuación: H-Puntuación = A × B. Se utilizó el análisis de chi-cuadrado para determinar relación entre la intensidad de HER2 y PUMA H-Score.
Análisis estadísticos
Los datos se presentan como media ± SE. Las diferencias se determinaron mediante ANOVA de un factor con el test post-hoc de Tukey o prueba t de Student en su caso. El análisis de chi-cuadrado se llevó a cabo por los resultados de IHC. La significación se fijó en p. & Lt; 0,05
Resultados
HER2 Físicos Asociados con PUMA
Para investigar si HER2 tiene ninguna interacción con PUMA, primero se evaluó si HER2 pueden interactuar físicamente con PUMA mediante inmunoprecipitación /Western Blot (IP /BM). Se utilizó células de cáncer de mama BT-474 SK-BR3 y ya que sobreexpresan HER2 debido a la amplificación del gen HER2. Immunoprecipitated HER2 partir de estas células y se encontró que PUMA se pudo detectar con HER2 tire hacia abajo en ambas líneas celulares (Figura 1a). Esto indica un hallazgo novedoso que HER2 interacciona físicamente con PUMA. Vale la pena señalar que no detectamos una interacción entre HER2 y malo o BMF otras proteínas BH3-sólo, lo que sugiere la interacción con HER2 es específico de PUMA (Figura 1a). El próximo evaluó si era necesaria la actividad quinasa de HER2 para la interacción con PUMA. Para esto, las células fueron tratadas con o sin heregulina como un medio de activar la actividad quinasa de HER2. Es de destacar que HER2 no tiene ligandos obvias y se basa en la unión a HER3 heregulina con destino a la activación; HER3 no tiene actividad quinasa [5]. Como se muestra en la Figura 1b, HER2 fue activado por la heregulina, pero esto no cambia significativamente la interacción de HER2 con PUMA. Las células se trataron entonces con o sin lapatinib, que inhibe la activación de HER2 [29]. Lapatinib disminución de la activación de HER2, sino también no afectó significativamente la interacción de HER2 y PUMA (Figura 1c). En conjunto, estos datos indican que el HER2 puede interactuar físicamente con PUMA y esta interacción no es dependiente de la actividad quinasa de HER2.
a) Se lisaron las células SKBR3 y BT-474 y la proteína total sometieron a inmunoprecipitación, ya sea con IgG de control o anticuerpos HER2, seguido de inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Lisados de células enteras también se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. b) las células MDA-MB-453 se incubaron en medio libre de suero durante 16 horas seguido de tratamiento con heregulina (100 ng /ml) durante 30 minutos. Las células fueron lisadas y las proteínas totales se sometieron a inmunoprecipitación con IgG de control o anticuerpos HER2, seguido de inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Lisados de células enteras también se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. c) las células MDA-MB-453 se incubaron con lapatinib (10 M) durante dos horas. Las células fueron lisadas y las proteínas totales se sometieron a inmunoprecipitación con IgG de control o anticuerpos HER2, seguido de inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Lisados de células enteras también se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. d) El mitocondrial (ME) y extracto no mitocondrial (NME) se aislaron a partir de células BT-474 y los dos extractos se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos indicados. ME y NME también se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos indicados.
PUMA localiza principalmente en la mitocondria, ya que contiene una señal de localización mitocondrial [12], [16] pero PUMA también se ha observado para promover la apoptosis sin localización mitocondrial [15]. Además, HER2 se localiza principalmente en la membrana plasmática, pero recientemente se ha encontrado para localizar a la mitocondria donde influye el metabolismo celular y promueve la resistencia de trastuzumab [30]. Por lo tanto, próximos a determinar donde interactúan físicamente PUMA y HER2. Mitocondrial (ME) y extractos no mitocondriales (NME) se aislaron de BT-474 células y la inmunotransferencia de α-tubulina y COX IV confirmaron que había un aislamiento eficaz de las fracciones mitocondriales y no mitocondriales (Figura 1d). Figura 1d muestra que PUMA y HER2 se detectaron tanto en el ME y el NME confirmando observaciones anteriores [30]. A pesar de la carga de cantidades iguales de proteínas (60 g), no parece haber mayores niveles de PUMA y HER2 en el ME que el NME. Sin embargo, este desequilibrio aparente se debe al hecho de que 60 mg es 80% de la ME cosechado pero sólo 2% de la NME cosechado. Para determinar la interacción entre HER2 y PUMA, HER2 se inmunoprecipitó a partir de cantidades iguales de la ME y NME seguido de inmunotransferencia. Hemos observado interacción entre HER2 y PUMA, tanto en el ME y el NME (Figura 1d). Estos son los datos que indican primera HER2 interacciona físicamente con PUMA y que esta interacción se produce en y fuera del compartimiento mitocondrial.
HER2 fosforila directamente PUMA
Después de la detección de una interacción directa entre HER2 y PUMA , el próximo fin de determinar si PUMA podría ser fosforilada por HER2. A lo mejor de nuestro conocimiento, la fosforilación de tirosina PUMA no se ha informado anteriormente. Para evaluar en primer lugar si se puede PUMA tirosina fosforila, nos moríamos de hambre células que sobreexpresan HER2 durante 16 horas y después se trataron las células con o sin herregulina para activar HER2. Sometimos los lisados celulares a IP /WB utilizando un anticuerpo PUMA para IP y immunoblotted con anticuerpos anti-fosfo-tirosina. Como se muestra en la Figura 2a, PUMA tirosina fosforilada se detectó fácilmente en las células de heregulina estimulada que expresaban activan HER2 fosforilado (p-HER2). Sin embargo, las células MCF-7, que expresan bajos niveles de HER2, no respondieron a heregulina y no mostraron fosforilación de la tirosina PUMA significativa (Figura 2b). Por el contrario, células MCF-7 con estable, la sobreexpresión de HER2 forzada (células MCF-7 /HER2) muestra PUMA fosforilación de tirosina en respuesta a heregulina (Figura 2c). Estos resultados son los primeros en demostrar que PUMA puede ser fosforilados en residuos de tirosina y esto ocurrió con la estimulación HER2 por heregulina.
MDA-MB-453 (a), o MCF-7 (b), o MCF 7 /células (c) HER2 se incubaron en medio libre de suero durante 16 horas seguido de tratamiento con heregulina (100 ng /ml) durante 30 min. Las células fueron lisadas y las proteínas totales se sometieron a inmunoprecipitación con IgG de control o anticuerpos PUMA seguido de inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Lisados de células enteras también se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Tirosina fosforilada PUMA se detectó con anticuerpos fosfo-tirosina 4G10. proteína PUMA recombinante se sometió al ensayo de HER2 quinasa (como se indica en los Métodos & amp; Materials) en presencia o ausencia de lapatinib (d) o con el aumento de los niveles de proteína PUMA recombinante (e). f) recombinante HER2 se inmunoprecipitó en presencia o ausencia de PUMA purificada seguido de inmunotransferencia con anticuerpos indicados.
próximo querían determinar si HER2 podría fosforilar directamente PUMA. Con este fin, se utilizó Proteínas purificadas puma y HER2 recombinantes disponibles en el mercado para llevar a cabo un ensayo de quinasa libre de células. Como se muestra en la Figura 2d, PUMA era fuertemente fosforilados en residuos de tirosina en la presencia de HER2. Como era de esperar, HER2 se sometió a auto-fosforilación. En presencia de lapatinib, HER2 fosforilación se había perdido, y, por consiguiente, no había fosforilación de la tirosina de PUMA. También se observó un aumento de la dosis-respuesta en la fosforilación de tirosina de PUMA con el aumento de los niveles de proteína PUMA en presencia de HER2 (Figura 2e). El uso de IP-WB, se muestra además que pulldown de HER2 recombinante también resulta en pulldown de PUMA purificada (Figura 2f) confirmando HER2 asocia directamente con PUMA en el contexto del ensayo de quinasa libre de células. Estos resultados muestran por primera vez que PUMA puede ser fosforilados en residuos de tirosina directamente por HER2.
HER2 fosforila PUMA en tres residuos de tirosina
Una búsqueda de la secuencia de la proteína humana PUMA reveló la presencia de tres residuos de tirosina, es decir, Y58, Y152, Y172 y (Figura 3a). Se encontró que todos los tres residuos de tirosina en PUMA ser conservadas a través de múltiples especies de mamíferos (Figura 3A), lo que indica que estos residuos son potencialmente funcionalmente importante. Para determinar qué residuo de tirosina PUMA específico (s) que fosforila HER2, se realizó mutagénesis dirigida al sitio para mutar cada tirosina (Tyr; Y) a la fenilalanina (Phe; F) usando un vector de expresión que lleva marcada con HA PUMA como la plantilla. La fenilalanina tiene el mismo grupo R como tirosina sin el oxígeno para unir fosfato y, por lo tanto, no puede ser fosforilado. Estos mutantes puma (Y58F-, Y152F-, Y172F-PUMA), junto con el tipo salvaje PUMA (WT-PUMA), se expresaron en células, se inmunoprecipitaron utilizando un anticuerpo HA-tag, y se someten al ensayo de quinasa HER2. Como se muestra en la Figura 3B, WT-PUMA fue fuertemente fosforilado por HER2 recombinante mientras que todos los mutantes mostraron un bajo nivel de fosforilación, lo que indica que las tres tirosinas pueden ser fosforilados. Para entender completamente las consecuencias biológicas de la fosforilación de la tirosina PUMA hemos creado un mutante PUMA adicional, un triple mutante PUMA (TM-PUMA), en el que las tres tirosinas (Y58, Y152, Y172 y) se mutaron a la fenilalanina. Usando el ensayo de quinasa HER2 libre de células (Figura 3b), WT-PUMA mostró bandas fosfo-tirosina mientras que ninguno se detectaron con TM-PUMA, indicando la TM-PUMA no es fosforilada por HER2. Para descartar la posibilidad de que la MT-PUMA no puede ser tirosina fosforilada debido a su incapacidad para interactuar con HER2, el próximo fin de determinar si TM-PUMA puede interactuar físicamente con HER2. IP /WB con un anticuerpo HER2 (Figura 3c) demostró que HER2 interactuó con ambos WT-PUMA y TM-PUMA igualmente que indica la falta de fosforilación TM-PUMA por HER2 no se debe a la disminución de la interacción entre las dos proteínas. Tomados en conjunto, los resultados en las figuras 2 y 3 son la primera evidencia que muestra que PUMA sufre fosforilación de la tirosina y que HER2 puede fosforilar directamente PUMA.
a) representación lineal de la proteína PUMA con cada tirosina, el dominio BH3, y la señal de localización mitocondrial (MLS) de dominio indicado (panel superior). Tirosinas 58, 152, y 172 en la proteína PUMA se conservan a través de múltiples especies de mamíferos, que se indican (panel inferior). b) la proteína PUMA marcada con HA de tipo salvaje fue mutado de manera que cada tirosina se cambió a la fenilalanina (Y58F, Y152F, Y172F) o todas las tirosinas fueron mutados (triple mutante: TM). Células MCF-7 fueron transfectadas con WT-PUMA o cada mutante PUMA y lisado de células enteras se sometió inmunoprecipitación, ya sea con IgG de control o anticuerpos dirigidos-HA. Después de la inmunoprecipitación, el producto se sometió al ensayo de quinasa HER2 tal como se indica en la sección Materiales y Métodos. c) WT-PUMA o TM-PUMA se transfectaron en células MDA-MB-453. Las células fueron lisadas y las proteínas totales sometieron a inmunoprecipitación e inmunotransferencia con anticuerpos indicados. lisados de células enteras también se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos indicados.
TM-PUMA tiene una vida media más larga que WT-PUMA
A continuación, pretendemos determinar si PUMA fosforilación de HER2 alterado la estabilidad PUMA. Con este fin, se evaluó la semivida de la proteína utilizando la cicloheximida, que inhibe la síntesis de proteínas que permite la detección de cuando las proteínas se degradan. La cicloheximida es un método común para determinar la estabilidad de proteínas como varios documentos pertinentes han utilizado este método en los últimos años [31] - [34]. Así, las células MDA-MB-453 con sobreexpresión de HER2 se trataron con cicloheximida para hasta 16 horas en la presencia o ausencia de herregulina para activar HER2. Como se muestra en la Figura 4a, heregulina inducida por la activación de HER2 en estas células y también dio lugar a una mayor degradación de la proteína PUMA. Para examinar aún más la estabilidad de PUMA, PUMA se evaluó la vida media utilizando células MCF-7, que tienen una baja expresión de HER2, o células /HER2 MCF-7, que tienen sobreexpresión de HER2 estable. La figura 4b muestra que PUMA se degrada más rápidamente en las células MCF-7 /células HER2 en comparación con células MCF-7 que indican la sobreexpresión de HER2 reduce la estabilidad de PUMA. A continuación se determinó si la vida media de TM-PUMA, que no puede ser fosforilada en tirosina, difiere de la de WT-PUMA. Las células fueron transfectadas con cualquiera de WT-PUMA o TM-PUMA seguido por el tratamiento con cicloheximida. Como se muestra en la Figura 4c, los niveles de WT-PUMA disminuyeron de forma significativa a las 16 horas, mientras que los niveles de TM-PUMA no disminuyeron sustancialmente. Tras la cuantificación de las señales de banda de PUMA y el trazado con el tiempo, se encontró que la vida media para el WT-PUMA fue de aproximadamente 7 horas, mientras que la de TM-PUMA fue de más de 16 horas. Se ha demostrado previamente que PUMA puede dirigirse a la proteasoma para la degradación [31]. Para determinar si el WT-PUMA o TM-PUMA está regulada por el proteasoma, se realizó el experimento de vida media en presencia del inhibidor del proteasoma MG132. Como se muestra en la figura 4d, se observó que WT-PUMA vida media podría ampliarse con la inhibición del proteasoma de confirmar los resultados anteriores [31]. Estos resultados sugieren la fosforilación de HER2 mediada reduce la vida media de PUMA.
a) células MDA-MB-453 se incubaron en medio libre de suero durante 16 horas seguido de tratamiento con heregulina (100 ng /ml) y cicloheximida (10 ug /ml). lisado de células enteras se sometió a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. b) MCF-7 y MCF-7 /células HER2 se incubaron en medio libre de suero durante 16 horas seguido de tratamiento con heregulina (100 ng /ml) y cicloheximida (10 ug /ml). lisado de células enteras se sometió a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. C, D) células MCF-7 fueron transfectadas con HER2 y ya sea WT-PUMA o TM-PUMA. Las células se incubaron en medio libre de suero durante 16 horas seguido de tratamiento con heregulina (100 ng /ml) y cicloheximida (10 ug /ml) sin (c) o con MG132 (10 M) co-tratamiento (d). lisado de células enteras se sometió a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. e) células MCF-7 fueron transfectadas con WT-PUMA o TM-PUMA y se aislaron las mitocondrias. ME y NME se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. f) Las tablas de Chi-cuadrado para el análisis de muestras clínicas de cáncer. Med-alta HER2 + = 2-3. Bajo HER2 + = 0-1. g) Muestra imágenes IHC de muestras clínicas de cáncer de alta HER2 + Low PUMA (caso 1) y Low HER2 + alta PUMA (caso 2).
A continuación pregunta si la TM-PUMA conserva la capacidad de someterse a translocalization a la mitocondria, donde PUMA promueve la apoptosis. Por lo tanto, WT-PUMA o TM-PUMA se transfectaron en las células, seguido de aislamiento de la ME y NME con inmunotransferencia posterior. Como indica la figura 4e, TM-PUMA retuvo la capacidad de sufrir localización mitocondrial. Asimismo, se observó un mayor nivel de TM-PUMA en comparación con WT-PUMA en el ME, lo cual fue confirmado por el cálculo del Índice de mtPUMA (ver Materiales y Métodos) que resulta en 3,3 veces más TM-PUMA en la mitocondria que WT-PUMA. Un mayor nivel de TM-PUMA en la mitocondria es probablemente el resultado de la estabilidad de proteínas mejorado de la proteína TM-PUMA en presencia de HER2. En conjunto, estos datos muestran que PUMA estabilidad de la proteína se reduce con la activación de HER2 y el bloqueo de la fosforilación de tirosina PUMA PUMA mejora la estabilidad y da como resultado mayores niveles mitocondriales de PUMA.
Para evaluar si esta relación se mantiene
in vivo
, se realizó inmunohistoquímica en un conjunto de muestras clínicas de cáncer (n = 93) para detectar HER2 y PUMA. Después de anotar, hemos dividido las muestras en baja HER2 (0-1 + intensidad) o de medio a alto HER2 (2-3 + intensidad). PUMA se dividió en alta PUMA (ya sea ≥150 H-Score o ≥100 H-Score) o baja PUMA (ya sea & lt; 150 H-Score o & lt; 100 H-Score). A continuación realizó un análisis de chi-cuadrado para determinar la relación entre la expresión de HER2 y PUMA (Figura 4f). El análisis de Chi cuadrado utilizando barrera de PUMA (150 H-Score o 100 H-Score) dio lugar a la significación estadística (p = 0,045 yp = 0,027, respectivamente). Estos datos sugieren que los tejidos con alta expresión de HER2 tienden a tener menor PUMA expresión
in vivo gratis (Figura 4 g) el apoyo a nuestros datos a partir de líneas celulares que HER2 puede regular a la baja la expresión de PUMA.
TM-Puma ha un efecto más fuerte que el WT-PUMA en la supresión del crecimiento clonogénico
Figura 4 se indica que la MT-PUMA tuvo una mayor estabilidad de la proteína y mayores niveles de proteína en la mitocondria, lo que puede indicar que la MT-PUMA tiene una mayor capacidad para promover la apoptosis . Para examinar el efecto de la MT-PUMA sobre la viabilidad celular, expresamos un vector vacío, WT-PUMA o TM-PUMA en dos líneas celulares de cáncer de mama con sobreexpresión de HER2 diferentes, a saber, BT-474 (Figura 5e) y MDA-MB-453 (Figura 5f) de las células, y se controló la capacidad de estas células para formar colonias.