Extracto
Antecedentes
La multirresistencia (MDR) es una de las principales razones Los tratamientos basados en quimioterapia fallan. La hipoxia se asocia generalmente con la quimiorresistencia tumor. Sin embargo, la correlación entre el factor inducible por hipoxia-1 (HIF-1) y la resistencia a múltiples fármacos (MDR1) gen /transportador de la P-glicoproteína heterodimérica (P-gp) sigue sin estar clara. Este estudio tiene como objetivo explorar los mecanismos moleculares de la inversión de la MDR cáncer de colon, centrándose en el gen diana HIF-1α.
Métodos
Un ensayo de sensibilidad a la quimioterapia se utiliza para observar la eficiencia de la inversión de la MDR esferoides multicelulares LoVo (MCS). El nivel de apoptosis inducida por diferentes drogas fue examinado por citometría de flujo (FCM). La unión de HIF-1α al promotor del gen MDR1 se evaluó mediante inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). Se analizó la relación entre HIF-1α /expresión y la sensibilidad de P-gp a la quimioterapia.
Resultados
La sensibilidad de LoVo MCS a los cuatro fármacos de quimioterapia se redujo a varios grados bajo condiciones de hipoxia. Después de silenciar el gen de HIF-1α, se restauraron las sensibilidades de LoVo MCS a los cuatro medicamentos de quimioterapia. Los niveles de apoptosis que todos los medicamentos inducidas eran todos disminuyeron en diversos grados en el grupo hipóxica. Después de silenciamiento de HIF-1α, el nivel de la apoptosis inducida por los cuatro fármacos de quimioterapia aumenta. La expresión de HIF-1α y P-gp fue significativamente mayor en el MCS LoVo después del tratamiento con la hipoxia. La inhibición de HIF-1α disminuyó significativamente la expresión de ARNm o proteína /P-gp MDR1 tanto en las monocapas LoVo y LoVo MCS. El chip de ensayo mostró que HIF-1α estaba obligado al promotor del gen MDR1. pacientes de carcinoma de colon avanzados con expresión tanto de HIF-1α y P-gp eran más resistentes a la quimioterapia que que con la no expresión.
Conclusiones
inhibición HIF-1α revierte la resistencia a múltiples fármacos en células de cáncer de colon a través de la regulación a la baja de MDR1 /P-gp. La expresión de HIF-1α y MDR1 /P-gp se puede utilizar como un marcador predictivo para la resistencia a la quimioterapia en el cáncer de colon
Visto:. Chen J, Ding Z, Peng Y, Pan F, Li J, Zou L, et al. (2014) HIF-1α inhibición revierte la resistencia a múltiples fármacos en células de cáncer de colon a través de regulación a la baja de MDR1 /P-glicoproteína. PLoS ONE 9 (6): e98882. doi: 10.1371 /journal.pone.0098882
Editor: Michal Zmijewski, Universidad de Medicina de Gdansk, Polonia
Recibido: 7 de Diciembre, 2013; Aceptado: May 8, 2014; Publicado: 5 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.30973430 y No.81101629). (http://isisn.nsfc.gov.cn/egrantweb/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es uno de los tumores malignos más comunes en todo el mundo, y la quimioterapia desempeña un papel importante en su tratamiento. Sin embargo, la sensibilidad a diferentes regímenes de quimioterapia varía ampliamente de un individuo a otro. Muchos pacientes con cáncer desarrollan resistencia a los medicamentos, lo que lleva a pobres resultados del tratamiento. Por otra parte, la resistencia a fármacos se produce principalmente en los tumores sólidos in vivo, pero no en monocapas en vitro [1]. El microambiente tumoral juega un papel fundamental en el fracaso de la quimioterapia y la resistencia a fármacos [2] - [4].
La hipoxia es una característica común de muchos tumores malignos, incluyendo el cáncer de colon. Un microambiente tumoral hipóxico se considera cada vez más un componente crítico en la determinación de la resistencia a los medicamentos [5], [6]. Factor inducible por hipoxia-1 (HIF-1) es un factor clave en la alteración de las características biológicas de los tumores. la proteína HIF-1α se sobreexpresa en varios tipos de cáncer humano y se asocia con un peor pronóstico en muchos tipos de cáncer. Aunque muchos estudios han indicado que la hipoxia potencia la resistencia de los tumores a la quimioterapia y la radioterapia [7], [8], cómo el microambiente hipóxico contribuye a la resistencia a fármacos contra el cáncer aún no se ha establecido.
resistencia a múltiples fármacos (MDR) es una de las principales razones por las que ocurre el fracaso del tratamiento a base de quimioterapia. De los muchos mecanismos de MDR, la alta expresión del gen MDR1 humana y la P-glicoproteína (P-gp) transportador codificada por MDR1 es un objetivo importante de la investigación [9]. Las células tumorales que sobreexpresan MDR1 /P-gp por lo general muestran resistencia a varios agentes quimioterapéuticos [10], [11]. Nuestro estudio anterior mostró que la expresión de proteína HIF-1α se correlaciona con MDR1 /P-gp expresión en tejido de carcinoma de colon y una línea celular de cáncer de colon, y los niveles de mRNA de expresión de HIF-1α y MDR1 son significativamente mayores en el mismo tipo de células en condiciones hipóxicas que en condiciones de normoxia [12]. No está claro si y cómo HIF-1α está involucrado en la MDR en el cáncer de colon a través de la interacción de MDR1 /P-gp.
La exploración de la influencia de la hipoxia sobre el cáncer de colon MDR ayudará a mejorar el efecto de la quimioterapia. En microambiente hipóxico, suponemos que HIF-1α puede inducir directamente la expresión de MDR1 /P-gp que conduce a la TB, así como la reversión de cáncer de colon MDR se puede lograr cuando la expresión de HIF-1α es específicamente inhibido. En el presente estudio, nuestro objetivo es explorar los mecanismos moleculares potenciales y la viabilidad de revertir la MDR cáncer de colon, centrándose en el gen diana HIF-1α. Esperamos proporcionar una base teórica y la evidencia experimental para las aplicaciones más adelante relacionados en el tratamiento clínico.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Se obtuvo la línea celular de cáncer de colon humano LoVo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en alta glucosa del medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, EE.UU.), suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, EE.UU.) y antibióticos (1% de penicilina y 1% de estreptomicina). Por exposición a la hipoxia, las células se cultivaron durante 24 horas en una cámara de modulador incubadora a 37 ° C con 1% O
2, 5% de CO
2, y 94% N
2. esferoides multicelulares (MCS) se obtuvieron mediante el uso de la técnica de superposición de líquido [13]. En resumen, se añadieron células en crecimiento exponencial LoVo con placas de medio de cultivo que anteriormente se recubrieron con agarosa al 2%. Las placas se arremolinaron suavemente y horizontalmente durante 10-15 minutos por 2-3 horas en las primeras 24 horas, y luego durante 10 minutos cada 4 horas. medio apropiado se actualiza cada dos días. Para los experimentos de hipoxia, apropiada MCS se establecieron en normoxia durante 48 horas y después se cultivan en la hipoxia durante otras 24 horas.
Productos químicos
adriamicina (ADR, Hisun Pharmaceutica, China), vincristina (VCR, Hisun Pharmaceutica, china), 5-fluorouracilo (5-FU, Sigma, MO, EE.UU.), o irinotecan (CPT-11, Hengrui Medicina, china) fueron recién preparada el día de utilización por disolución de la concentración requerida en DMEM con 10% de suero fetal bovino.
quimioterapéutico sensibilidad del ensayo
LoVo se tripsinizaron las células, se resuspendieron y se contaron, y 1000 células fueron sembradas en placas de 96 pocillos previamente recubiertos con 2% de agarosa para obtener MCS en normoxia. Para los experimentos de hipoxia, apropiado MSC se transfirieron a hipoxia durante 24 horas y después se incubó con concentraciones de gradiente de medicamentos para otras 24 horas en hipoxia. La viabilidad celular se midió por el 3- (4, 5-dimetiltiazol-z-il) -3, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT, BD Biosciences, NJ, EE.UU.) de ensayo. Las placas se incubaron con MTT a 37 ° C durante 4 horas, y la absorbancia a 490 nm se midió por el Modelo 550 lector de microplacas (Bio-Rad, CA, EE.UU.).
Cuantitativo PCR en tiempo real
el ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores usados fueron: 5'-GTTTGATTTTACTCATCCAT-3 'y 5'-TTCATAGTTCTTCCTCGG-3' para HIF-1α; 5'-CTTGGCAGCAATTAGAAC-3 'y 5'-TCAGCAGGAAAGCAGCAC-3' para MDR1; 5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA 3 'y 5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC -3' para 18sRNA. La síntesis de la primera cadena de ADNc se realizó con el kit de síntesis de ADNc (Takara, Dalian, China). Quantitative PCR en tiempo real se realizó utilizando el kit SYBR Green PCR en tiempo real (Takara). Todas las normalizaciones se realizaron utilizando niveles 18sRNA y los cambios veces se calcularon por el método de Ct delta-delta. Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas.
análisis de transferencia Western
La proteína total (50 g) se separó por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Después de la transferencia de proteínas a fluoruro de polivinilideno membranas microporosas (Bio-Rad), las membranas se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% y se incubaron secuencialmente con los anticuerpos primarios (HIF-1α 1:500; actina ß-1; P-gp 1:200 :5000), seguido de incubación con la fluoresceína vinculado anti-ratón (anti-conejo) IgG (1:1000) y después de la incubación con anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina anti-fluoresceína (1:5000). Todos los anticuerpos fueron comprados a Santa Cruz, CA, EE.UU.. Los complejos inmunes se detectaron con el reactivo de quimioluminiscencia (Pierce, EE.UU.). Para la cuantificación, las señales eran densitométrica normalizado a ß-actina por Cantidad Uno de software de análisis de imagen (Bio-Rad).
Construcción y transfección siRNA
secuencias de RNAi-miARN Pre HIF-1α para el objetivo genes HIF-1α y MDR1 se diseñaron y sintetizaron. Después de los dos vectores específicos de expresión de los genes miARN de ARNi con el EmGFP gen indicador de la orientación del HIF-1α humana y los genes MDR1, respectivamente, se construye y se identificó mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación, los plásmidos de ARNi de HIF-1α y MDR1 se transfectaron en células LoVo usando el liposoma Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, EE.UU.). clones positivos estables fueron seleccionados mediante blasticidina. Los grados de desmontables de HIF-1α y MDR1 se identificaron mediante PCR. Se seleccionaron los plásmidos de ARNi con mejores efectos de supresión para la posterior construcción de clones de expresión de los genes miARN lentivirus. Dos miARN clones de expresión lentivirus, pLenti6 /V5-GW /EmGFP-miR-HIF-1α y pLenti6 /V5-GW /EmGFP-miR-MDR1, fueron construidos utilizando técnicas de recombinación Gateway (Invitrogen) y se co-transfectaron en 293FT células con el ViraPower mezcla de empaques (Invitrogen). El título se examinó después de la infección de células NIH /3T3 con sobrenadante de virus. Luego, las células LoVo se infectaron con los dos sistemas miRNA RNAi vector lentiviral mediada de forma estable y seleccionados por blasticidina.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
Las células se sembraron en placas de 100 mm de diámetro y , después de 24 horas, se incubaron con 1% de formaldehído durante 10 minutos a 37 ° C a las proteínas de enlace transversal al ADN. La reacción de reticulación se interrumpió mediante la adición de volumen de un décimo de 1,25 mol /l de glicina. Las células se lavaron dos veces con helado de 1 × PBS; se volvieron a suspender en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación y se mantuvo en hielo durante 30 minutos. A continuación, los lisados celulares se sometieron a ultrasonidos en hielo con un sonicador de ultrasonidos Hielscher UP200S (Hielscher Ultrasonidos GmbH, Alemania) hasta que las cromatinas reticulados fueron cizalladas para producir fragmentos de ADN entre 200 y 1000 pb. Los sobrenadantes se incubaron con la suspensión de agarosa de ADN de esperma de salmón /proteína-50% para reducir el fondo no específico. a continuación, inmunoprecipitación se realizó la noche a 4 ° C con 5 mg de anticuerpo anti-HIF-1α (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Estos sobrenadantes fueron suplementados con 5 mol /l de NaCl y se calentaron durante la noche a 65 ° C para revertir proteínas de ADN enlaces cruzados. Los inmunocomplejos se trataron adicionalmente con libre de DNasa y RNasa libre de proteinasa K, y el ADN se purificó por extracción con fenol /cloroformo y precipitación con etanol. Se realizó la PCR con cebadores específicos para la región que contiene el sitio de la hipoxia sensible potenciador (5'-GCGTG-3 ') del promotor MDR1 [14]. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: 5'-GGAGCAGTCATCTGTGGTGA-3 'y 5'-CTCGAATGAGCTCAGGCTTC-3'. Como se informó anteriormente [24], factor de crecimiento vascular endotelial humano (VEGF, establecido un gen diana HIF-1) se utilizó como control positivo y los cebadores que flanquean la hipoxia potenciador de respuesta del promotor de VEGF fueron 5'-GCCTCTGTCTGCCCAGCTGC-3 'y 5 '-GTGGAGCTGAGAACGGGAAGC-3'. La inmunoprecipitación con IgG no específica (Santa Cruz) se realizó como control negativo. Una muestra que representa la amplificación lineal de la entrada de ADN total se utiliza como control de entrada.
Detección de la apoptosis por citometría de flujo (FCM)
se prepararon y trataron células como se describió anteriormente y después se tiñeron con aloficocianina (APC) conjugada con anexina V y yoduro de propidio (PI) durante 10 minutos a temperatura ambiente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kit anexina V-APC /PI apoptosis Detección; Jingmei Biotech, china). La población de células apoptóticas anexina V-negativas viables y anexina V-positiva fue evaluada por FCM. Los datos fueron recogidos en un instrumento FACSCalibur (BD Biosciences) y analizados mediante el software CellQuest (BD Biosciences).
Pacientes y muestras de tumor
Ciento veinte pacientes con diagnóstico histológico de carcinoma de colon avanzado y que se sometieron quimioterapia basada en 5-FU en el hospital del suroeste, Tercera Universidad médica Militar, Chongqing, china, entre 2004 y 2008 fueron elegibles para este estudio. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité Ético y de Revisión de Protocolos del Hospital del Suroeste, Tercera Universidad Médica Militar y todos los pacientes proporcionados formulario de consentimiento por escrito. Los pacientes tenían edades comprendidas entre 30 y 79 años (edad media, 54 años); 73 eran hombres y 47 eran mujeres. respuesta a la quimioterapia se evaluó mediante tomografía computarizada o por otros medios radiográficos después de dos ciclos de tratamiento, la adopción de los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos criterios de grupo. Sobre la base de su respuesta a la quimioterapia, los pacientes fueron clasificados como respondedores o no respondedores. Las muestras de tejido fueron fijadas en formol al 10%, embebidos en parafina, y se cortaron en secciones seriadas de 4 micras. La expresión de HIF-1α y P-gp se examinó mediante inmunohistoquímica, como se describe anteriormente [12]. Claro tinción marrón-amarillo restringido a los núcleos, citoplasma o membrana de la célula indica la expresión positiva de HIF-1α o P-gp. expresión positiva se registró como (+) y negativo de la expresión como (-).
Análisis estadístico
Todos los datos se proporcionan como la media ± desviación estándar. Los resultados se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado, prueba de la t de Student y el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA).
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 13.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
LoVo MCS son más resistentes a la quimioterapia que en monocapas hipóxicas Condiciones
Para imitar el microambiente hipóxico de un tumor in vivo [15], [16], LoVo MCS se obtuvieron mediante el uso de la técnica de superposición líquido. células LoVo aglomeran entre sí y proliferaron rápidamente. Después de ser cultivadas durante 48 horas, LoVo MCS se compone de un número de células aglomeradas (Figura 1B). Cuantitativa en tiempo real PCR mostró que la expresión de HIF-1α fue significativamente mayor en LoVo MCS que en monocapas LoVo, no sólo en condiciones de hipoxia, sino también en normoxia (
p
& lt; 0,05) (Figura 1C). Se evaluaron la sensibilidad de drogas a 5-FU, y los resultados mostraron que LoVo MCS eran más resistentes a 5-FU que eran monocapas en hipoxia (
p
& lt; 0,05). Además, tanto LoVo MCS y monocapas eran más resistentes a 5-FU en condiciones hipóxicas que en normoxia (Figura 1D).
(A) La morfología de las monocapas LoVo. Barra de escala = 50 micras. (B) La morfología de LoVo MCS. Barra de escala = 50 micras. (C) cuantitativa en tiempo real PCR detectó la expresión de ARNm de HIF-1α en LoVo MCS y en monocapas en condiciones de normoxia y condiciones de hipoxia. Los niveles 18sRNA se utilizaron como control interno y los cambios de plegado se calcularon por el método de Ct delta-delta. Los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas y PCR para cada gen se realizó por duplicado (*
p
& lt; 0,05). (D) la sensibilidad de drogas (media ± SD, n = 3) de MCS LoVo y LoVo monocapas de 5-FU en normoxia o hipoxia (*
p Hotel & lt; 0,05, N: normoxia, H: hipoxia).
HIF-1α inhibición revierte la resistencia a múltiples fármacos en LoVo MCS
Debido a LoVo MCS mostró más resistencia a la quimioterapia que hicieron en monocapas hipoxia, quisimos investigar si la resistencia a los medicamentos cambió cuando HIF expresión 1α se inhibió específicamente. Hemos establecido con éxito un modelo LoVo MCS y estable LVV-HIF-1α y grupos infectados por el miR-LVV MDR1. En condiciones hipóxicas, la sensibilidad de LoVo MCS a la quimioterapia con cada uno de los cuatro fármacos disminuyó en diversos grados. La concentración -inhibiting 50% (IC
50) los valores del grupo hipóxico eran más altos que los del grupo de normoxia (ADR, VCR, y 5-FU,
p Hotel & lt; 0,01; CPT 11,
p Hotel & gt; 0,05) (Figura 2). Después de silenciar el gen de HIF-1α, las sensibilidades de LoVo MCS a los cuatro fármacos de quimioterapia se restauraron en diferentes grados. La relación relativa entre reversión grupo infectado-MIR LVV-HIF-1α (hipoxia) y el MCS (hipoxia) para cada fármaco fue la siguiente: ADR, 82,8% (
p
& lt; 0,01); VCR, el 83,8% (
p Hotel & lt; 0,01); 5-FU, el 70,7% (
p Hotel & lt; 0,01); y CPT-11, el 48,5% (
p Hotel & gt; 0,05). Después de silenciar el gen MDR1, la relación relativa entre reversión grupo infectado-MIR-LVV MDR1 (hipoxia) y el MCS (hipoxia) para cada fármaco fue la siguiente: ADR, 74,2% (
p
& lt; 0,01) ; VCR, el 70,9% (
p Hotel & lt; 0,01); 5-FU, el 58,1% (
p Hotel & lt; 0,05); y CPT-11, el 15,2% (
p Hotel & gt; 0,05)
(A) ADR.. (B) VCR. (C) 5-FU. (D) CPT-11. (E) IC50 de diferentes grupos LoVo MCS a quimioterápicos (media ± SD, n = 3, **
p Hotel & lt; 0,01, *
p Hotel & lt; 0,05, N: normoxia, H :. hipoxia) guía empresas
la inhibición de HIF-1α Mejora la apoptosis inducida por fármacos de quimioterapia en LoVo MCS
a continuación, observamos la apoptosis inducida por fármacos de quimioterapia en LoVo MCS cuando la expresión de HIF-1α fue inhibida específicamente. El análisis de la apoptosis por FCM demostró que (Figura 3), en comparación con LoVo MCS en condiciones de normoxia, los niveles de apoptosis inducida por los cuatro fármacos fueron menores en diversos grados en el grupo de hipoxia (ADR, VCR, y 5-FU,
p Hotel & lt; 0,01; CPT-11,
p Hotel & gt; 0,05). Después de silenciar de manera eficiente el gen diana HIF-1α, el nivel de la apoptosis inducida por ADR, vídeo y 5-FU se incrementó notablemente (
p Hotel & lt; 0,01) y era 9,2 veces, 7,4 veces, y 2.6- veces, respectivamente, en contraste con la de LoVo MCS (grupo de hipoxia). Sin embargo, el nivel de la apoptosis inducida por CPT-11 fue sólo 1,1 veces al grupo hipoxia, sin significación estadística (
p Hotel & gt; 0,05).
La proporción de anexina V-apoptótica positivo células (cuadrante inferior derecho) se evaluó por citometría de flujo utilizando aloficocianina anexina V (APC) y tinción con yoduro de propidio (PI) de LoVo MCS después del tratamiento con (B) ADR (25 mg /ml), (C) VCR (25 g /ml), (D) 5-FU (200 mg /ml) y (e) CPT-11 (200 mg /ml). Las células no tratadas se utilizaron como control negativo. Los datos de cada gráfico estadístico de Anexina V-APC /PI tinción se expresa en% de las células en el cuadrante inferior derecho y representan la media ± SD de tres experimentos independientes. Los gráficos de barras en la parte inferior de la citometría de flujo de dispersión representan el% de apoptosis en las células en el cuadrante inferior derecho. (**
p Hotel & lt; 0,01, N: normoxia, H: hipoxia) guía
MDR1 /P-gp expresión de la proteína se reduce en LoVo MCS después LVV-HIF-1α MIR la transfección de hipoxia
Para explorar los mecanismos moleculares potenciales de inversión de la MDR, centrándose en el gen diana HIF 1α, se detectó la expresión de genes relacionados con la MDR en LoVo MCS cuando la expresión de HIF-1α se inhibió específicamente. Western blot mostró que la expresión de HIF-1α y P-gp en LoVo MCS fue significativamente mayor después del tratamiento durante 24 horas en hipoxia (
p Hotel & lt; 0,01). Cuando HIF-1α fue derribado en el LVV-HIF-1α MIR infectado MCS, tanto HIF-1α y la expresión de la proteína P-gp fue regulado por disminución en comparación con el grupo control negativo (
p Hotel & lt; 0,01). Y, en el LVV-MDR1 MIR infectados MCS, el nivel de expresión de la proteína HIF-1α de no mostraron diferencias mientras que P-gp se redujo significativamente en comparación con el grupo control negativo (Figura 4). Los resultados indicaron que MDR1 fue el gen aguas abajo de HIF-1α y MDR1 /P-gp expresión se reducirá en LoVo MCS mientras que HIF-1α se inhibió.
(A) Se realizaron análisis de Western blot. β-actina se utilizó como control interno. (B) los niveles de proteína relativos (media ± DE, n = 3) de HIF-1α y P-gp se determinaron en cada uno de los grupos (**
p Hotel & lt; 0,01, N: normoxia, H: hipoxia) .
MDR1 /P-gp ARNm y la expresión de la proteína se reducen en LoVo monocapas después de LVV-HIF-1α MIR La transfección de hipoxia
Debido a que la expresión de proteínas MDR1 /P-gp se redujo en LoVo MCS después LVV-HIF-1α MIR transfección, se detectó además la expresión de genes relacionados con la MDR en las monocapas LoVo en la hipoxia. Después de infectar de forma estable monocapas LoVo con LVV-HIF-1α MIR y LVV-MDR1 MIR, cuantitativa en tiempo real PCR y Western blot (Figura 5) demostraron que en la hipoxia, los niveles de ARNm y la expresión de la proteína de HIF-1α y del MDR1 en la LVV -HIF-1α grupo MIR fueron significativamente inferiores a los de los grupos de miR control no tratados y negativo (
p Hotel & lt; 0,01). Sin embargo, en el grupo de LVV-MDR1 Mir, sólo los niveles de mRNA y expresión de la proteína del gen MDR1 fueron estadísticamente inferiores a los de los grupos no tratados y negativos de control de miR en hipoxia (
p
& lt; 0,01) , mientras que no hubo diferencias en la HIF-1α ARNm y proteínas se observaron (
p Hotel & gt; 0,05).
(a, B) cuantitativo en tiempo real PCR detectó HIF-1αor MDR1 expresión de ARNm en monocapas LoVo (hipoxia) con LVV-HIF-1α MIR (A) o LVV-MDR1 MIR (B) establemente transducidas. monocapas no tratadas en normoxia se utilizaron como control de normoxia. Los niveles 18sRNA se utilizaron como control interno y los cambios de plegado se calcularon por el método de Ct delta-delta. Los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas y PCR para cada gen se realizó por duplicado (**
p
& lt; 0,01). (C-F) Western blot detectado HIF-1α y la expresión de la proteína P-gp en monocapas LoVo (hipoxia) con LVV-HIF-1α MIR (C) o LVV-MDR1 MIR (E) establemente transducidas. monocapas no tratadas en normoxia se utilizaron como control de normoxia. (D, F) La comparación de los niveles de expresión (media ± SD, n = 3) de HIF-1α y la proteína MDR1 de cada grupo (**
p Hotel & lt; 0,01).
la unión de HIF-1α al promotor del gen MDR1
a continuación, se utilizó un chip de ensayo para evaluar en LoVo MCS (tanto en normoxia e hipoxia) si HIF-1α une a la región promotora del gen MDR1. Después de la precipitación de los lisados celulares con un anticuerpo específico anti-HIF-1α, el promotor del gen MDR1 y promotor del gen de VEGF (establecido un gen diana HIF-1) se amplificaron por PCR con cebadores específicos. Los resultados (Figura 6) mostraron que HIF-1α se une al promotor del gen MDR1 en LoVo MCS no sólo en condiciones de hipoxia, pero también en condiciones de normoxia.
La unión de HIF-1α en el MDR1 y el gen VEGF promotores se midió por chip. el análisis de PCR para la región promotora del gen MDR1 se realizó en muestras de inmunoprecipitación (IP) con anticuerpo anti-HIF-1α y con purificada ADN total de entrada de la LoVo MCS (normoxia e hipoxia). El promotor del gen de VEGF (establecido un gen diana HIF-1) se utilizó como control positivo. La inmunoprecipitación con IgG no específica se realizó como control negativo. Una muestra representativa de la amplificación lineal del ADN total de entrada se utilizó como control de entrada.
Los pacientes con HIF-1α (+) /P-gp (+) son más resistentes a la quimioterapia
Nuestro estudio previo ha demostrado que HIF-1α y MDR1 /P-gp niveles de expresión se correlacionan en los tejidos tumorales de carcinoma de colon [12]. Para determinar si la expresión de HIF-1α y MDR1 /P-gp en pacientes con cáncer de colon se diferencia, así como la sensibilidad relacionada con la quimioterapia, se emplearon técnicas de inmunohistoquímica para detectar la expresión de HIF-1α y P-gp en los tejidos tumorales de 120 pacientes con carcinoma de colon avanzado que recibieron quimioterapia basada en 5-FU. Se encontró que 73 de los 120 casos (60,8%) expresaron tanto HIF-1α y P-gp, y esto HIF-1α (+) /P-gp (+) población de pacientes era más resistente a la quimioterapia que era el HIF-1α ( -) /P-gp (-.) población (
p = 0,001
, OR 5.647, 95% IC 1,920 a 16,606) (Tabla 1)
Discusión
Nuestro estudio anterior mostró que la expresión de proteína HIF-1α se correlaciona con la expresión de P-gp en tejidos de carcinoma de colon y líneas celulares de cáncer de colon, y HIF-1α y MDR1 ARNm se encontró que eran significativamente mayores en las mismas células en condiciones hipóxicas que en condiciones de normoxia [12]. En el presente estudio, mostramos que HIF-1α puede influir directamente en la expresión de MDR1 /P-gp en el microambiente hipóxico y luego mediar resistencia a la quimioterapia no sólo en monocapas de células cultivadas, sino también en esferoides multicelulares, y HIF-1α inhibición puede revertir a múltiples fármacos la resistencia a través de la regulación a la baja de MDR1 /P-gp. Hay mucha evidencia ha demostrado que un microambiente hipóxico es propicio para el desarrollo y mantenimiento de los tipos de cáncer [17]. Por otra parte, las células cancerosas en condiciones de hipoxia muestran más resistencia a los fármacos antineoplásicos [18], [19]. Algunos estudios que han tratado de explicar este fenómeno han encontrado que las células en condiciones hipóxicas generalmente se dividen más lentamente que las de las condiciones de normoxia, lo que hace las terapias que se dirigen a células que crecen rápidamente menos eficaces [17]. Mientras tanto, un estudio demostró que la hipoxia puede inducir un cierto número de genes, incluyendo MDR1 /P-gp, en esferoides multicelulares [16]. En nuestro estudio, encontramos que HIF-1α unido al promotor del gen MDR1 en LoVo MCS no sólo en condiciones de hipoxia, pero también en condiciones de normoxia.
Hemos establecido con éxito un modelo LoVo MCS para imitar el microambiente hipóxica de los tumores en vivo. La sensibilidad de la quimioterapia y los cambios apoptóticos de LoVo MCS a ADR, VCR, 5-FU y CPT-11 se examinaron en normoxia e hipoxia. Los resultados mostraron que las sensibilidades de quimioterapia y la apoptosis de las LoVo MCS en respuesta a los cuatro fármacos eran todos disminuyó a diferentes grados en condiciones de hipoxia. De los cuatro fármacos citotóxicos, 5-FU y CPT-11 son los que más se utiliza en el cáncer de colon, mientras que la resistencia a la ADR y VCR se cree que está estrechamente relacionada con MDR1 /P-gp [20]. Silenciando el gen de HIF-1α restaurado las sensibilidades de LoVo MCS para el ADR, VCR, y 5-FU e indujo un marcado aumento en el nivel de apoptosis de cada fármaco correspondiente (
P Hotel & lt; 0,01). Estos resultados indican que la resistencia a fármacos de LoVo MCS se puede revertir con una combinación del sistema de miR-LVV HIF-1α y los fármacos anteriores. Este hallazgo está de acuerdo con los hallazgos previos de que la inhibición de HIF-1α puede mejorar la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos en células cancerosas tales como fibrosarcoma, cáncer gástrico, y el carcinoma de mama [21] - [23]. Desde Unruh
et
al.
[24] encontró que la eficacia antiproliferativa de carboplatino y etopósido se mejora significativamente por la inactivación de HIF-1α en fibroblastos de embriones de ratón, la contribución de HIF-1α de resistencia a los medicamentos se ha observado en varios tipos de células neoplásicas en los últimos años [21], [25] - [29]. Sin embargo, los datos disponibles sobre la relación entre HIF-1α y la quimio-resistencia de las células cancerosas son contradictorios. Por ejemplo, algunos estudios han demostrado que la inactivación de HIF-1α en normoxia no tiene efecto en las respuestas de drogas en células de neuroblastoma y de adenocarcinoma de pulmón [30], [31]. Estudios recientes también han abogado por un efecto de resistencia-mediación de HIF-1α, al menos en algunos cánceres humanos [4]. Además, se encontró que había una tendencia hacia una mayor sensibilidad después de HIF-1α o inhibición MDR1, pero las sensibilidades de quimioterapia a CPT-11 no fueron significativamente diferentes en los grupos LoVo MCS. El resultado indicó que el mecanismo de quimiorresistencia a CPT-11 no dependía de P-gp, sino más bien pasó por otra vía, tal como el producto CPT-11 metabólica SN-38 [32] - [34].
El mecanismo por el cual HIF-1α contribuye a MDR es compleja y sigue siendo poco clara. HIF-1α puede mediar MDR mediante la regulación de eflujo de fármaco, la alteración de la proliferación celular y la supervivencia, la inhibición de daño en el ADN, o la reprogramación de metabolismo. Como uno de los miembros principales de la familia de transportadores ABC, MDR1 /P-gp reduce las concentraciones intracelulares de fármacos citotóxicos mediante el bombeo de forma activa los fármacos fuera de las células y por lo tanto la protección de las células de cáncer de sus efectos antitumorales [35]. MDR1 es un gen diana de HIF-1. En los últimos años, la contribución de HIF-1 mediada por la expresión de P-gp en la resistencia a fármacos inducida por hipoxia se ha observado en muchas células tumorales, tales como cáncer gástrico, gliomas, y carcinoma de mama [14], [21], [26 ], [36]. En este estudio, hemos demostrado que la expresión de HIF-1α y P-gp fue significativamente mayor en el MCS LoVo después del tratamiento en la hipoxia. inhibición HIF-1α mediante la transfección de células con un siRNA específico para HIF-1α disminuyó significativamente la expresión de mRNA MDR1 /P-gp y de la proteína en los dos monocapas LoVo y LoVo MCS. Además, HIF-1α estaba obligado al promotor del gen MDR1 directamente. Hemos indicado que la activación de HIF-1α puede inducir directamente la expresión de MDR1 /P-gp y luego dar lugar a MDR.
Para determinar si la expresión de HIF-1α y MDR1 /P-gp en pacientes con cáncer de colon difiere , así como la sensibilidad a la quimioterapia relacionada, se emplearon técnicas de inmunohistoquímica para detectar la expresión de HIF-1α y P-gp en los tejidos tumorales de 120 pacientes con carcinoma de colon avanzado que recibieron la quimioterapia basada en 5-FU. Se encontró que 73 de los 120 casos (60,8%) expresaron tanto HIF-1α y P-gp, y esto HIF-1α (+) /P-gp (+) población de pacientes era más resistente a la quimioterapia que era el HIF-1α ( -) /P-gp (-) de la población. Por lo tanto, HIF-1α /MDR1 puede ser un objetivo prometedor en el tratamiento del cáncer de colon, así como la reversión de cáncer de colon MDR se puede lograr cuando la expresión de HIF-1α /MDR1 se inhibe específicamente. Sugerimos que la expresión de HIF-1α y MDR1 /P-gp puede ser utilizado como un marcador predictivo para la resistencia a la quimioterapia en el cáncer de colon
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En conclusión, nos informan de que la inhibición de HIF-1α revierte la MDR en el cáncer de colon las células, que se asocia con la regulación a la baja de MDR1 /P-gp. Nuestros resultados podrían tener amplias implicaciones clínicas para pacientes de colon con HIF-1α (+) /P-gp (+) patrones de expresión, y las terapias combinadas dirigidas a modular la expresión de HIF-1α en concierto con los regímenes de quimioterapia estándar puede proporcionar una estrategia para superar tumoral resistencia.