Extracto
Es bien reconocido que el factor inducible por hipoxia 1 alfa (HIF-1α) está implicada en la metástasis del cáncer, la quimioterapia y mal pronóstico. Hemos encontrado previamente que la deferoxamina, un agente de la hipoxia-mimética, induce la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en el cáncer colorrectal. Por lo tanto, aquí hemos explorado un nuevo mecanismo molecular de HIF-1α contribuyendo a EMT y la metástasis del cáncer a través de la unión a ZEB1. En este estudio, hemos demostrado que la sobreexpresión de HIF-1α con EMT infección por adenovirus promovido, la invasión y la migración celular
in vitro
y
in vivo
. En un nivel molecular, HIF-1α de unión directamente al promotor proximal de ZEB1 a través de elemento de respuesta a hipoxia (HRE) sitios aumentando así la transactivity y expresión de ZEB1. Además, la inhibición de ZEB1 fue capaz de abrogar la EMT y celular inducida por la invasión HIF-1α. la expresión de HIF-1α fue altamente correlacionado con la expresión de ZEB1 en el epitelio colorrectal normal tejidos primarios y metastásicos CRC. Curiosamente, tanto HIF-1α y ZEB1 se asociaron positivamente con la vimentina, un importante marcador mesenquimal de la EMT, mientras que asociado negativamente con la expresión de E-cadherina. Estos hallazgos sugieren que HIF-1α mejora EMT y la metástasis del cáncer mediante la unión a promotor ZEB1 en CRC. HIF-1α y ZEB1 son a la vez ampliamente considerados como factores de iniciación de tumor, pero nuestros resultados demuestran que ZEB1 es un aguas abajo directa de HIF-1α, lo que sugiere un mecanismo molecular novedoso para HIF-1α inductor de EMT y metástasis del cáncer.
Visto: Zhang W, X Shi, Peng S, M Wu, Zhang P, Xie R, et al. (2015) HIF-1α promueve la transición epitelio-mesenquimal y la metástasis a través de la regulación directa de ZEB1 en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (6): e0129603. doi: 10.1371 /journal.pone.0129603
Editor Académico: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, JAPÓN
Recibido: 3 Febrero 2015; Aceptado: 11-may de 2015; Publicado: 9 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están disponibles dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81172057, 81302159), Presidente de la Fundación del hospital Nanfang, Universidad médica del Sur (2012C003, 2012B009), y alto nivel fondos de tema correspondiente del hospital Nanfang (G201227)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un evento crucial en la metástasis del cáncer, en la que las células epiteliales polarizadas están inclinados para obtener ciertos caracteres de células mesenquimales, así como la migración y más propiedades invasivas [1]. Los hallmarkers moleculares durante la TEM son marcadores epiteliales abajo reguladas (por ejemplo, E-cadherina, plakoglobina y desmoplakina), marcadores mesenquimales hasta reguladas (por ejemplo, vimentina, N-cadherina y actina de músculo α-liso) y el aumento de la expresión de factores de transcripción tales como Snail, Slug, Twist, con dedos de zinc vinculante homeobox 1 (ZEB1) e-box, ZEB2, y /o E47, que puede unirse a promotor de la e-cadherina e inhibir su actividad de transcripción y expresión [2]. En particular, la pérdida o la regulación a la baja de E-cadherina se considera que es el primer paso y el más importante de la EMT. E-cadherina puede ser silenciada por diferentes mecanismos que incluyen la metilación aberrante y la represión transcripcional. Entre ellos, su regulación de la transcripción es ampliamente estudiado en varios de los tumores malignos [3].
hipoxia-inducible factor 1 alfa (HIF-1α) se ha reportado que la promoción de EMT en varios tipos de tumores a través de la modulación de uno o más genes EMT asociada a [4]. Como factor de transcripción, HIF-1α regula las actividades de sus genes aguas abajo a través de la unión del elemento de respuesta a hipoxia (HRE) en sus regiones promotoras. Por ejemplo, HIF-1α es capaz de transactivar metalopeptidasa matriz 9 (MMP9) en el cáncer de mama [5]. En el carcinoma hepatocelular, se activa la represión de caracol de este modo la expresión de E-cadherina [6]. Por otra parte, HIF-1α compite con factor de transcripción 4 (TCF4) para la unión directa a EMT ß-catenina mejorando de este modo en el cáncer colorrectal [7]. Por lo tanto, existe una estrecha relación entre la EMT y la expresión de HIF-1α en el cáncer con los mecanismos desconocidos.
ZEB1 es un factor transcripcional crucial de la EMT [8-10]. Sin embargo, la asociación entre HIF-1α y ZEB1 es poco conocida. En este estudio, hemos demostrado que la sobreexpresión de HIF-1α inducida EMT y fenotipos metastásicos en el CCR. HIF-1α directamente regula la expresión ZEB1 a través del elemento de respuesta a hipoxia 3 (HRE-3) que se encuentra en el promotor ZEB1 proximal. Supresión de ZEB1 invierte estos efectos inducidos por overexpresssion HIF-1α. Los perfiles de expresión de HIF-1α, ZEB1 y vimentina fueron mucho similar en pacientes con CRC, lo cual era contrario a la expresión de E-cadherina. Estos resultados indican que la progresión y metástasis CRC, inducida por HIF-1α, está mediada por la regulación directa de ZEB1.
Materiales y Métodos
Las células y las muestras clínicas
CRC líneas de células HT29 y HCT116 se mantuvieron en nuestro laboratorio, bajo la condición con RPMI 1640 (GIBCO) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) como se describe anteriormente [26]. CRC humana y los tejidos normales adyacentes según se obtuvieron a partir de diez pacientes con CCR que se sometieron a colonoscopia; CRC humana y los tejidos de los ganglios linfáticos metastásicos emparejados se obtuvieron de treinta y dos pacientes con CRC que se sometieron a hemicolectomía en el Hospital Nanfang (Guangzhou, China). Estos individuos nos dieron su consentimiento informado por escrito (como se indica en el formulario de consentimiento PLOS) para participar en este estudio y publicar estos detalles del caso. Los estudios que utilizan tejidos humanos fueron revisados y aprobados por los Comités de Ética de la opinión de la investigación en seres humanos en el Hospital Nanfang, Universidad Médica del Sur (Número de Permiso: NFYY-2012-75).
Construcción y producción de adenovirus recombinante
plásmido HIF-1α-expresión, pDC316-HIF-1α-EGFP, se construyó insertando el ADNc de HIF-1α de longitud completa en los sitios de restricción NheI y NotI entre endonucleasas del vector de expresión pDC316 que contenía EGFP (pDC316-EGFP). Por caída estable de ZEB1, las siguientes secuencias se clonaron en pDC316-HIF-1α-EGFP. shZEB1 hacia adelante: 5'-GATCCCCAGATGATGAATGCGAGTCGttcaagagaTGACTCGCATTCATCATCTTTTTTGGAAA-3 'y shZEB1 inversa: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGATGATGAATGCGAGTCAtctcttgaaCGACTCGCATTCATCATCTGGG-3' como se describe anteriormente [8]. Ambos plásmidos se verificaron mediante secuenciación de ADN.
Todos los adenovirus, incluyendo adenovirus 5 expresar HIF-1α (Ad5-HIF-1α), la sobreexpresión de HIF-1α y ZEB1 desmontables (Ad5-HIF-1α-shZEB1) y la control, Ad5-EGFP, se generaron utilizando sistema de envasado adenovirus ADMAX (Microbix Biosystems Inc., Ontario, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la amplificación a gran escala de los vectores adenovirales anteriores se llevaron a cabo en células HEK293T mediante recombinación homóloga entre un plásmido lanzadera (pDC316) y un plásmido columna vertebral (pBHGlox_E1, 3Cre). Los títulos de los virus purificados se determinó por el ensayo de formación de placas estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Virapur, San Diego, CA).
Las infecciones por adenovirus in vitro
células
HT29 y HCT116 se hicieron crecer hasta 80% de confluencia. Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se incubaron con Ad5-EGFP y Ad5-HIF-1α en la MOI de 0,1, 1, 10, 100 y 1000, respectivamente. Noventa minutos después de la infección, los virus fueron sustituidos por medio de crecimiento regular. se observó 24 o 48 horas después de la infección, la eficiencia de transducción de las construcciones que expresan EGFP bajo microscopía de inmunofluorescencia y la expresión de HIF-1α se analizó por PCR o Western blot.
inversa-reacción en cadena de la polimerasa de transcripción (RT-PCR) , Cuantativo-PCR en tiempo real (qPCR) y el análisis de transferencia Western
Estos ensayos se realizaron esencialmente como se describe anteriormente [27-29]. Los cebadores utilizados para la RT-PCR fueron las siguientes: HIF-1α sentido: 5'-TCCATGTGACCATGAGGAAA-3 'y antisentido: 5'-CCAAGCAGGTCATAGGTGGT-3'; cebadores utilizados para qPCR fueron los siguientes: HIF-1α: 5'-TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA -3 '(sentido) y 5'-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG -3' (antisentido); ZEB1: 5'-CCTGTCCATATTGTGATAGAGGC-3 '(sentido) y 5'-ACCCAGACTGCGTCACATGT-3' (antisentido); deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH): 5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 '(sentido) y 5' CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3 '(antisentido). Los anticuerpos primarios, HIF-1α (Novus Productos Biológicos, Littleton, CO), ZEB1 (Santa Cruz), E-cadherina (Santa Cruz), vimentina (prediluido, Abcam), Plakoglobin (Abcam), N-cadherina (Santa Cruz) y GAPDH (Abcam) eran todos los productos comerciales.
migración, invasión y ensayos de cicatrización de heridas
se utilizaron cultivos polarizados sin recubrimiento Costar (Corning Costar Co., Corning, NY) durante los ensayos de migración y Matrigel recubierto cultivos polarizados (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) utilizados para los ensayos de invasión. Las células se privaron de suero durante la noche y luego se sembraron en la cámara superior con medio RPMI 1640 libre de suero. RPMI 1640 suplementado con 10% FBS se añadió a la cámara inferior. Las células que habían migrado a través de la membrana Transwell fueron teñidas y cuantificados. Para el ensayo de cicatrización de la herida, el rayado se hace a través de la monocapa de células utilizando una punta estéril. La capacidad de las células para migrar se controló a diferentes puntos de tiempo utilizando un microscopio de luz
histológico e inmunohistoquímico análisis
hematoxilina y eosina (H & amp; E). E inmunohistoquímica (IHC) se realizaron como anteriormente se describe [28]. En breve, las muestras se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante la noche y posteriormente se embebieron en cera de parafina. Se cortaron secciones de un espesor de 5 micras y se tiñeron con H & amp; E para el análisis histológico. IHC análisis se realizó para la expresión de HIF-1α, ZEB1, E-cadherina y vimentina. El tejido en el que & gt; 10% de las células cancerosas están positivamente teñidas se considera como positiva. Para el análisis cuantitativo, se calculó la proporción de células teñidas positivamente a todas las células tumorales en cinco áreas al azar con un aumento de 200 veces. Todas las evaluaciones histológicas incluyendo el porcentaje de células positivas se llevaron a cabo de una manera de doble ciego por dos patólogos para minimizar el sesgo observacional.
movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA)
EMSA se realizó utilizando una oligonucleótido de doble cadena que contiene una secuencia de unión de consenso para HIF-1α como se describe anteriormente [27, 28]. Las siguientes secuencias de cadenas con sentido se utilizaron para los ensayos de unión y de competencia: secuencias que contienen HRE de tipo salvaje (P1: 5'-GAGGCGTGGGACTGATGGTAGCC -3 ', -521 -517 ~ nt; P2: 5'-GGGGGCGGACACGCGAGG -3' -529 ~ - 525 nt; P3: 5'-CCGGTCGCCGCGTGTCCTCGCC -3 ', -634 -630 ~ nt; P4: 5'-ATACTCCGGTCACGTTTCAGTTTTCTC -3', -1.347 -1.342 ~ nt) y las secuencias HRE según mutantes (P1-mut: 5 ' - GAGGCACAGGACTGATGGTAGCC -3 '; P2-mut: 5'-GGGGGCGGATGTGCGAGG -3'; P3-mut: 5'-CCGGTCGCCGCACATCCTCGCC -3 'y P4-mut: 5'-ATACTCCGGTTGTGTTTCAGTTTTCTC -3'). Los nucleótidos se marcaron extremo con [γ-32P] ATP (PerkinElmer Life Sciences y analítica, Fremont, CA) y T4 polinucleótido quinasa (Promega). Los extractos nucleares de células infectadas con Ad5-HIF-1α-EGFP y el control se prepararon y utilizaron en EMTS como hemos descrito anteriormente [28]. Y se incubaron en 1 x tampón de unión que contiene 2,5% de glicerol, 50 ng /poli l (dI-dC), 5 mm MgCl2, 0,05% de Nonidet P-40 y 4 pmol de oligonucleótido marcado con biotina en un volumen total de 20 l a temperatura ambiente durante 20 min. Las mezclas unidas eran de un tamaño fraccionado en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6% a 180 V en 0,5 x tampón TBE. El gel se secó y posteriormente se autorradiografía.
Generación de plásmidos de informes, la transfección transitoria y Luciferase ensayo
Producción de tipo salvaje y mutante reportero construcciones se realizó como ya hemos descrito anteriormente [29]. A 567 pb del fragmento de promotor ZEB1 que contiene el elemento HRE-3 fue clonado en pGL3 vector para generar la construcción informadora de tipo salvaje, nombrado como pluc-567. Mutación en los HRE-3 motivos (pluc-567-mut) se introdujo en pluc-567 luciferasa construir con la QuikChange Site-Directed Mutagénesis Kit (Stratagene, La Jalla, CA, EE.UU.). Tanto de las construcciones fueron verificadas por secuenciación. Las células se infectaron con Ad5-EGFP o Ad5-HIF-1α durante 48 h seguido por la transfección con pluc-567 o pluc-567-mut y PRL-CMV (
Renilla luciferasa
). El potencial de transactivación se puso a prueba con el Sistema Dual-Glo de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) mediante la medición de la actividad de luciferasa después de 48h.
Los ratones desnudos y ensayo de metástasis
Este experimento animal era llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el IACUC (Institucional Cuidado de Animales y el empleo), y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del hospital de experimentos con Animales de Nanfang (Número de Permiso: NFYY-2013-56) . Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Después de la cirugía, todos los ratones desnudos fueron sacrificados por anestesia con pentobarbital sódico. Seis semanas de edad BALB /c ratones desnudos fueron adquiridos de Guangdong Provincial Experimental Animal Center (Guangzhou, China) y se dividieron al azar en cuatro grupos (Ad5-EGFP: N = 8; Ad5-HIF-1α: N = 12; Ad5 HIF-1α-shRNA: N = 5; Ad5-HIF-1α-shZEB1: N = 5) antes de la inyección. Los animales se sometieron a anestesia intraperitoneal con solución de 40 mg /kg amobarbital sódico. Después de que los ratones fueron profundamente anestesiados, una pequeña incisión en el flanco longitudinal superior izquierda se hizo y el bazo se expuso con suavidad. Se inyectaron células suspendidas individuales (1,5 x 106 células /ratón) en 70 l de PBS bajo la cápsula del bazo. Después de la retirada de la aguja, el sitio de inyección se presionó con una esponja de algodón aséptico para evitar fugas. Después de eso, el bazo fue devuelto en la cavidad abdominal y la periotneium y la pared abdominal se sutura con seda [30-32]. Los ratones se sacrificaron después de 5 semanas, la posibilidad de metástasis analizado y los sitios de metástasis se recogieron para H & amp;. E tinción y el ensayo qPCR
El análisis estadístico
El análisis se realizó utilizando el software GraphPad Prism 6. Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar. La significación estadística de las diferencias se determinó por el estudiante de
t-test
. Todos los análisis fueron de dos caras, emparejado (por IHC resultados en muestras clínicas) o no apareados y un
P
valor & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
sobreexpresión de HIF-1α EMT inducida in vitro
Para obtener una mejor eficacia de la infección por adenovirus en líneas celulares de cáncer de CRC, HT29 y HCT116 las células se transdujeron primero con adenovirus 5 que expresan proteína fluorescente verde potenciada (Ad5-EGFP) o Ad5-HIF-1α-EGFP en la multiplicidad de infección (MOI) de 10, 100 y 1000, respectivamente, con los efectos registrados por microscopía en 48 hora (Fig 1A). Casi el 100% de las células expresó EGFP con un MOI de 100, que era mucho más similar a un MOI de 1000. RT-PCR (Fig 1B izquierda) y Western blot (Fig 1B derecha) resultados confirmaron el aumento dramático de la expresión de HIF-1α . El mismo efecto se encuentra en las células HCT116 (datos no mostrados). Por lo tanto, el Ministerio del Interior de 100 fue adoptado en todos los siguientes experimentos.
Células HT29
(A) fueron transducidas con Ad5-HIF-1α en el MOI indica los valores para 48 horas. La intensidad de fluorescencia y campo claro en la misma zona se observaron en el aumento del original como 100X. (B) ARNm (izquierda) y proteínas (derecha) las expresiones de HIF-1α se detectaron mediante RT-PCR y Western Blot, respectivamente. GAPDH se utilizó como control de carga. (C) La morfología celular de las células HT29 de tipo salvaje o HT29 transducidas con los adenovirus indicados (Aumento original = 400X). (D) Análisis de transferencia Western de HIF-1α, E-cadherina, Plakoglobin, vimentina y N-cadherina en células HT29 y HCT116 infectadas por adenovirus. GAPDH se utilizó como control interno. (E) Doble cambio de la invasión y la migración de las células indicadas. La cuantificación de los resultados se muestra en el gráfico de barras con medios ± SD. *
P Hotel & lt; 0.05. (F) Herida ensayo de curación. monocapas de células se rascaron con una punta de pipeta y las imágenes fueron tomadas 0, 24 y 48 horas después de la formación de la herida. *
P Hotel & lt; 0.05.
Curiosamente, al observar las células infectadas por adenovirus, encontramos células HT29-Ad5-HIF-1 eran mucho más, como fibrobalsts, en comparación con las células de tipo salvaje HT29 que eran redonda con bien en forma de huso adhesión célula-célula (Fig 1C). La transición por encima de la morfología celular en realidad era como el mismo que el cambio en el proceso de EMT. Por lo tanto, el próximo detectó la expresión de marcadores de EMT y encontramos que E-cadherina y Plakoglobin, dos importantes marcadores epiteliales de la EMT, fueron regulados a la baja de manera significativa en HT29 infectados HIF-1α-Ad5 y las células HCT116 en comparación con sus células de control. Por el contrario, las moléculas mesenquimales, vimentina y N-cadherina se aumentaron drásticamente después de la infección Ad5-HIF-1α-EGFP (Fig 1D). Además, un aumento en la invasión y la migración (rasgos cruciales de EMT fenotipo) de ambas líneas celulares con sobreexpresión HIF-1α también se detectó (Fig 1E). Consistentemente, la herida ensayo de curación demostró que la anchura en las células HT29-Ad5-HIF-1a eran mucho más estrecha que la de las células HT29-Ad5-EGFP en las parcelas de tiempo indicados, respectivamente (Fig 1F). Los resultados anteriores sugieren que la sobreexpresión de HIF-1α induce EMT y promueve la invasión y la migración en las líneas celulares de CRC.
HIF-1α sobreexpresión metástasis in vivo promovido
Para evaluar el efecto de la sobreexpresión de HIF-1α en la metástasis del cáncer
in vivo
, HT29 células fueron transducidas con Ad5-HIF-1α-EGFP o Ad5-EGFP, respectivamente, a una MOI de 100. Cuarenta y ocho horas más tarde, se cosecharon y se inyectaron en suspensiones de células individuales BALB /c ratones desnudos a través de un método subsplenic. Como se muestra en la figura 2A, múltiples nódulos tumorales intrahepáticos fueron inspeccionados fácilmente groseramente en el grupo con inyección de Ad5-HIF-1α-EGFP, mientras que menos o incluso ningún nódulos fueron encontrados en los ratones de control. Para confirmar la diferencia anterior, hemos examinado H & amp; E tinción y encontramos regiones del tumor basófilos mucho más desarrollados en los hígados de ratones inyectados con células HT29-Ad5-HIF-1a en comparación con el grupo de control, como se muestra en 2B fig. análisis Cantidad mostró que un aumento significativo (5,3 veces) de la metástasis hepática se observó en el grupo de Ad5-HIF-1α-inyectado, en comparación con el grupo control (Figura 2C). En tiempo real PCR resultados confirmaron que el nivel de HIF-1α en lesiones de hígado de ratones inyectados con HT29-Ad5-HIF-1α era mucho más alto que el inyectado con HT29-Ad5-EGFP (Fig 2D). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de HIF-1α promueve la metástasis de hígado de CRC en modelo animal
imágenes fotográficas representativos (A) y H & amp;. E tinción (B) de hígado de ratones BALB /c de cinco semanas después de la inyección subsplenic de las células HT29 transducidas con virus Ad5-HIF-1 o de control. Las flechas blancas indican nódulos metastásicos. (C) La comparación de las metástasis hepáticas entre los ratones HT29-Ad5-HIF-1α (N = 12) y de control de ratones (N = 8). *
P Hotel & lt; 0.05. (D) La confirmación de la sobreexpresión de HIF-1α de nódulos metastásicos en ratones inyectados con Ad5-HIF-1α por qPCR, en comparación con los inyectados con el virus de control.
HIF-1α expresión regulada ZEB1
Tanto HIF-1α y ZEB1 se han implicado en la metástasis del cáncer y EMT [4, 9, 11]. Continuación, se investigó si la sobreexpresión de HIF-1α tuvo un efecto sobre la expresión de ZEB1. De hecho, la regulación positiva de ARNm y los niveles de proteína de ZEB1 se encontró acompañados con la sobreexpresión de HIF-1α en células HT29 tal como se muestra en la Figura 3A & amp; 3B. Por otra parte, las tendencias de HIF-1α y expresión ZEB1 en líneas celulares de CRC (SW480, HCT116, HT29, LoVo y DLD1) fueron muy similares (Figura 3C). En consonancia, este hallazgo también fue presentado en muestras pareadas de CRC y los tejidos epiteliales de colon normales adyacentes que fueron detectados por Western blot y tinción IHC (Figura 3D y 3E amp;). También se encontró que los niveles de ambas proteínas fueron mucho más altas en el tumor que en los tejidos normales adyacentes. En el nivel celular, tanto HIF-1α y ZEB1 se expresaron principalmente en núcleo y el citoplasma, especialmente en el núcleo, que eran teóricamente consistente con el sitio de ubicación del factor de transcripción. Y también, las observaciones de su co-localización revelan que HIF-1α podría interactuar con ZEB1 físicamente.
(A) los niveles de expresión endógena de HIF-1α y ZEB1 en las cinco líneas celulares indicadas fueron detectados por qPCR con GAPDH se usa como control interno. (B & amp; C) Las células HT29 fueron transducidas con virus Ad5-HIF-1 o de control durante 48 horas, después de qPCR y western blot para detectar la expresión de HIF-1α y ZEB1. GAPDH se utilizó como control interno. niveles (D) HIF-1a y proteínas ZEB1 en los tejidos neoplásicos emparejados /cancerosas colorrectales. N: normal; T: tumor. El nivel de cada proteína se normalizó contra GAPDH. (E) imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica en muestras humanas CRC fijado en formol e incluidos en parafina para HIF-1α y ZEB1. El panel izquierdo muestra los tejidos normales adyacentes colorrectales. Panel derecho mostró muestras de CRC. Aumento original, 200X.
Reglamento de ZEB1 por HIF-1α a través HRE-3
Para evaluar si ZEB1 se regula directamente por HIF-1α, se analizaron las secuencias promotoras de ZEB1 con métodos bioinformáticos. Se encontró que había cuatro sitios potenciales de EDH en el promotor proximal (~ 3500 nt aguas arriba; el codón de iniciación ATG se define como 0) del gen ZEB1 (figura 4A). Había HRE-1 a -517 -521 ~ nt; HRE-2 a -525 -529 ~ nt; HRE-3 a -630 -634 ~ nt y HRE-4 en -1.342 -1.347 ~ nt. Sobre la base de estos, sondas P1, P2, P3 y P4 con los sitios de tipo salvaje y mutante de EDH fueron diseñados, respectivamente, como se describe en materiales y métodos. Los resultados de ensayo de EMSA revelaron que HIF-1α de unión se incrementó significativamente después de la incubación de extractos nucleares a partir de células HT29-Ad5-HIF-1α con el oligonucleótido HRE-3-que contiene de promotor ZEB1 (Fig 4B). Sin embargo, sólo había bandas de semana muy o incluso ninguna banda que se presentan en células HT29-Ad5-HIF-1a u otras células de control con el HRE-1, 2 o un oligonucleótido que contiene 4-(datos no mostrados). Por otra parte, la competencia por HIF-1α vinculante de oligonucleótidos no marcados que contienen HRE-3 y sondas que contienen mutado HRE-3 no mostró ninguna banda de HIF-1a vinculante (Figura 4B). Estos resultados sugieren que HIF-1α fue capaz de unirse promotor ZEB1 a través de la EDH-3 sitio.
(A) Representación esquemática del promotor proximal (~ 3500 nt aguas arriba) del gen ZEB1. HRE: hipoxia elemento de respuesta. (B) Los oligonucleótidos para EMSA fueron de tipo salvaje (carril 1-3) y mutante (carril 4-5) de la sonda 3 a partir del promotor ZEB1, que contenía un consenso HRE-3. Los extractos nucleares preparados a partir de HT29-Ad5-HIF-1α (carril 3 y 5) o las células control (carril 2 y 4) se incubaron con [γ-32P] ATP sonda marcadas antes de la electroforesis. El control negativo se realizó con la sonda de tipo salvaje sin extracto nuclear (carril 1). (C) Representación esquemática de la región promotora del ZEB1 y las construcciones de informe utilizados en experimentos infectadas con adenovirus. Las construcciones de tipo salvaje contenida (pluc567-WT) o mutante (pluc567-mut) HRE-3 situado -634 -630 ~ nt aguas arriba del sitio de inicio de transcripción de ZEB1. (D) La activación de plu567 o pluc567-Mut en las células HT29 con infección por Ad5-EGFP (experimentos replicados N = 3) Ad5-HIF-1α- o. *,
#
P Hotel & lt; 0.05.
A continuación, se determinó el efecto de la sobreexpresión de HIF-1α en la actividad de transcripción de ZEB1. Sobre la base de los resultados de EMSA, un plásmido que contiene el promotor HRE1-3 (pluc567) y la mutagénesis dirigida al sitio de HRE-3 plásmido (pluc567-mut) se generaron y transfectadas transitoriamente en células HT29 que eran pre-incubaron con Ad5-HIF -1α o Ad5-EGFP durante 24 h, el ensayo de luciferasa Dual-mostró que la actividad de pluc567 en células HT29-Ad5-HIF-1a aumentó más de 5 veces en comparación con células de control, mientras que la ampliación se degradó significativamente con la transfección pluc567-mut (Fig 4C & amp; 4D). Estos resultados demostraron que HIF-1α ZEB1 activado directamente por la unión al sitio de HRE-3 en el promotor ZEB1 proximal.
ZEB1 es crítica para EMT y metástasis HIF-1α inducida
Para detectar si se requiere ZEB1 para EMT inducida por HIF-1α y el fenotipo metastásico, se generó un plásmido con HIF-1α expresión y desmontables ZEB1, y luego empaquetados en adenovirus (Ad5-HIF-1α-shZEB1). Debido a que el nivel endógeno de ZEB1 en células HT29 era mucho menor que la de las células HCT116 (Fig 3C, derecha), que era consistente con sus niveles de proteína en nuestros datos anteriores [12]. Por lo tanto, se designaron las células HCT116 para llevar a cabo todos los experimentos ZEB1 desmontables.
in vitro
, HCT116 células fueron transducidas con Ad5-HIF-1α-shZEB1 y Ad5-HIF-1α, respectivamente . ensayos de transferencia, de invasión y migración occidentales se llevaron a cabo después de 48 horas. Como se muestra en la figura 5A, la expresión de E-cadherina se upregualted y la expresión de vimentina se downregulated acompañada con la caída de ZEB1. En consonancia, la capacidad de invasión y migración se redujeron en un 34% y 45%, respectivamente.
In vivo
, se observó múltiples nódulos tumorales en la superficie de los hígados y H & amp; E tinción mostró regiones tumorales basófilos en los hígados de los ratones inyectados con células HCT116-Ad5-HIF-1α. En contraste, los animales inyectados con las células HCT116-Ad5-HIF-1α-shZEB1 había disminuido dramáticamente cargas tumorales con una reducción en el número y tamaño de los nidos tumorales residuales, acompañado de necrosis más masivo con la región inflamación (Fig 5D & amp; 5E).
(a) Western blot de ZEB1, e-cadherina y vimentina en células HCT116-HIF-1α-shZEB1 HCT116-Ad5-HIF-1α o. GAPDH se utilizó como control de carga. Invasion (B) y de migración ensayos (C) se realizaron en las mismas dos líneas celulares. Las imágenes representativas de células invadidas en los insertos transwell de cámaras se muestran en aumento original = 200X. *
P Hotel & lt; 0.05. (D) imágenes fotográficas representativas y H & amp; E tinción de hígado de ratones Balb /c de 5 semanas después de la inyección de las células HCT116 subsplenic-HIF-1α-shZEB1 HCT116-Ad5-HIF-1α o. (E) Cuantificación de los números medios de focos metastásicos en el hígado de ratones (N = 5). *
P Hotel & lt; 0.05.
La expresión de HIF-1α, ZEB1, E-cadherina y vimentina en las muestras primarias y metastásicas CRC
Para evaluar la relación entre HIF-1α, ZEB1 y EMT marcadores clave en tejidos clínicos, IHC tinción se realizó en 32 pares de muestras primarias CRC y ganglio linfático metastásico (Fig 6A). El porcentaje medio de células teñidas positivamente a todas las células tumorales en cada tejido se evaluó de forma independiente por dos investigadores como se describe en Material y método. Se encontró que los porcentajes de ambas células CRC HIF-1α- y ZEB1-positivas eran más del 65%, mientras que el porcentaje de ganglios linfáticos metastásicos aumentó aproximadamente un 86% de HIF-1α y el 78% para ZEB1 (figura 6B). Al mismo tiempo, el nivel de vimentina era también bastante alta en ambos tejidos primarios y metastásicos; Aunque no hubo una diferencia significativa entre estos dos grupos. Para E-cadherina, el porcentaje de células tumorales E-cadherina-positivas en el tejido de CRC primario fue aproximadamente 29%, mientras que disminuyó significativamente a 12,7% en el grupo metastásico (Fig 6B). Estos resultados apoyan nuestras observaciones con las líneas celulares de CRC que la expresión de HIF-1α se asoció positivamente con ZEB1 y vimentina, y negativamente asociado con E-cadherina, y HIF-1α y ZEB1 pueden contribuir diferencialmente a EMT y la metástasis.
imágenes representativas de IHC (A) y la cuantificación de células tumorales positivas (B) en ambos especímenes de CRC primarios y el ganglio linfático metastásico de acuerdo. Aumento original, 200X. *
P Hotel & lt; 0,05 y
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Discusión
Uno de los aspectos fundamentales para el tratamiento del cáncer es la comprensión de los mecanismos moleculares de la tumorigénesis y metástasis del cáncer. En este estudio, se reveló que ZEB1 es un objetivo corriente abajo de HIF-1α y tiene un papel crítico en EMT y metástasis fenotipos inducidos por la sobreexpresión de HIF-1α. Proponemos que HIF-1α se une directamente al promotor de ZEB1 y sirve como su regulador positivo crítico, promoviendo así la EMT y metástasis del cáncer. Nuestros hallazgos descubren un nuevo mecanismo por el cual HIF-1α regula la progresión del tumor y la invasión.
HIF-1α expresión es comúnmente aumentada en una gran cantidad de tumores malignos, y muchas publicaciones han informado de la estrecha correlación entre la expresión de HIF-1α y aumento de la agresividad y una mayor capacidad metastásica en los carcinomas de ovario, mama, pulmón, próstata, colon y páncreas [11-14]. Para el nivel molecular, HIF-1α ejerce su función biológica a través de la activación de los genes diana tales como Caracol, Twist and TCF3, los cuales están asociados con la EMT y la metástasis [15-18]. Sin embargo, es importante para la identidad objetivos más desconocidos y para revelar la relación entre la activación de HIF-1α y otros supresores de oncogenes o tumorales.
ZEB1, un factor de transcripción pro-metastásico, está implicado en la progresión del cáncer y la metástasis [ ,,,0],19, 20]. Mecánica, la expresión ectópica de ZEB1 es suficiente para regular a la baja la E-cadherina e inducir la EMT en el cáncer de mama mediante la unión a las cajas E conservadas en el promotor de la E-cadherina. La función de la inhibición de la ZEB1 en E-cadherina promoviendo así EMT se observa también en modelos de xenoinjerto de CRC [8]. Por otra parte, los cambios ZEB1 media regulados por la claudina-1 en la invasión celular y Anoikis en el CCR [21]. Al igual que en ZEB1, Caracol y torsión también son importantes factores de transcripción EMT por silenciar E-cadherina través de la unión al elemento de caja E en el promotor de la E-cadherina [22]. Snail se identifica como un gen diana HIF-1α en ratón [23]; Giro se regula directamente por HIF-1α en la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) [18, 24]. En otras palabras, los que también quiere decir que la vía de HIF-1α puede regular la represión E-cadherina, presumiblemente a través de caracol o torcedura. Por lo tanto, debido a las capacidades similares de HIF-1α y ZEB1 para inducir EMT y los fenotipos superpuestos de HIF-1α y ZEB1 en ratones nulos, es probable que estos dos genes se encuentran en la misma vía para regular la metástasis del cáncer. Por lo tanto, la hipótesis de que podría haber un fuerte vínculo interactivo entre ZEB1 y HIF-1α. De hecho, encontramos que HIF-1α fue capaz de unirse promotor ZEB1 través HRE-3 y regulada positivamente transactivity ZEB1. Estos resultados también sugieren que Snail, Twist and ZEB1, los tres principales reguladores de la EMT pueden regular la EMT y la metástasis con unos mecanismos muy similares. Curiosamente, Peinado et al informaron de que Snail, Slug, ZEB1 y ZEB2 reclutar complejos específicos remodelación de la cromatina apoya un vínculo dinámico entre la represión de la transcripción y genes epigenéticos silenciamiento de E-cadherina durante la progresión tumoral y EMT [25].