Extracto
Antecedentes
Aunque el cáncer de colon metastásico es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, los mecanismos moleculares que permiten a las células de cáncer de colon a la metástasis no están claros. Nuevas evidencias sugieren que las células metastásicas desarrollan usurpando transcripcional redes partir de células madre embrionarias (ES) para facilitar una transición epitelio-mesenquimal (EMT), la invasión y la progresión metastásica. Estudios previos identificaron HMGA1 como un factor de transcripción clave enriquecida en células madre embrionarias, cáncer de colon y otros tumores agresivos, aunque su papel en estos entornos es poco conocida.
Métodos /Principales conclusiones
Para determinar cómo funciona HMGA1 en el cáncer de colon metastásico, que manipulan
HMGA1
expresión en ratones transgénicos y células de cáncer de colon. Descubrimos que HMGA1 impulsa cambios proliferativos, la formación de criptas aberrantes, y poliposis intestinal en ratones transgénicos. En líneas celulares de cáncer de colon de los tumores poco diferenciados, metastásicos, derribo de los bloques de formación HMGA1 el crecimiento celular, la migración, la invasión, la tumorigénesis xenoinjerto y colonosphere tridimensional independiente de anclaje. La inhibición de
HMGA1
bloques de expresión tumorigénesis en diluciones limitantes, en consonancia con el agotamiento de las células tumorales-iniciador en las células knock-down. Knock-down de HMGA1 también inhibe la progresión metastásica al hígado
in vivo
. En las células de cáncer de colon metastásico, HMGA1 induce la expresión de
TWIST1
, un gen implicado en la embriogénesis, EMT, y la progresión tumoral, mientras que reprime HMGA1
E-cadherina
, un gen que es-regulan a la baja durante EMT y progresión metastásica. Además,
HMGA1
es uno de los genes más enriquecidos en el cáncer de colon en comparación con la mucosa normal.
Conclusiones
Nuestros resultados demuestran por primera vez que impulsa cambios proliferativos y HMGA1 la formación de pólipos en el intestino de ratones transgénicos e induce la progresión metastásica y propiedades madre como en células de cáncer de colon. Estos hallazgos indican que HMGA1 es un regulador clave, tanto en la progresión metastásica y en el mantenimiento de un estado de tallo similares. Nuestros resultados también sugieren que HMGA1 o aguas abajo vías podrían ser dianas terapéuticas racionales en metastásico, cáncer de colon pobremente diferenciado
Visto:. Un Belton, Gabrovsky A, Bae YK, Reeves R, Iacobuzio Donahue C, Huso DL, et al. (2012) HMGA1 Induce intestinal poliposis en ratones transgénicos y Drives progresión tumoral y Propiedades celular en las células del cáncer de colon del tallo. PLoS ONE 7 (1): e30034. doi: 10.1371 /journal.pone.0030034
Editor: Wafik S. El-Deiry, Instituto de Cáncer de Penn State Hershey, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Julio, 2011; Aceptado: December 12, 2011; Publicado: 20 de enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Belton et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los fondos provinieron desde los Institutos nacionales de Salud (NIH) y RO1CA092339 R21CA2149550 a L. Resar, NIH T32HL007525 a A. Belton, y el Maryland Stem Cell Research Fund a L. y A. Resar Belton. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de los recientes avances en la detección del cáncer colorrectal y el tratamiento, el cáncer colorrectal metastásico sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1] - [2]. Los mecanismos moleculares que permiten a las células cancerosas a la metástasis son poco conocidos, aunque la evidencia emergente indica que las redes de transcripción necesarios para propiedades de células madre durante la embriogénesis son cooptados durante la progresión metastásica [3] - [4]. células Estudios recientes identificaron HMGA1 como un factor de transcripción clave enriquecido en madre de embriones humanos (ES) [3], las células madre hematopoyéticas [5] - [8], leucemia refractaria [6] - [7], [9] y de alto grado /cánceres pobremente diferenciados de la mama, cerebro, vejiga y [3]. Por otra parte, los tumores que sobreexpresan
HMGA1
y otros ocho genes del factor de transcripción ES habían disminución de la supervivencia, lo que subraya la importancia de estos genes en la progresión tumoral [3]. Más recientemente, se encontró que los niveles de proteína HMGA1 correlacionan con un mal estado de la diferenciación y la disminución de la supervivencia en el cáncer de páncreas, implicando más que en un HMGA1, el estado y la progresión del tumor de tallo como indiferenciada [10]. La
HMGA1
gen codifica la remodelación de la cromatina proteínas HMGA1a y HMGA1b, que funcionan para modular la expresión génica mediante la alteración de estructura de la cromatina y montaje de complejos de factores de transcripción a los promotores específicos [11] - [18]. Estudios anteriores demuestran que HMGA1 induce propiedades oncogénicas en las células cultivadas [19] - [27] y causa tumores agresivos en ratones transgénicos [9], [28] - [32]. Las vías moleculares precisas regulados por HMGA1 en la transformación, sin embargo, sólo están comenzando a surgir y los estudios para dilucidar HMGA1 transcripcional redes son propensos a destapar las vías fundamentales implicados en la progresión tumoral y el desarrollo.
Aquí, se presenta por primera tiempo que el HMGA1 impulsa cambios proliferativos y la formación de pólipos en el intestino de los ratones transgénicos y dirige vías moleculares importantes en la progresión tumoral y propiedades de células madre en células de cáncer de colon humano. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que
HMGA1
promueve la progresión tumoral en el cáncer de colon mediante la reprogramación de epitelio del colon a un estado de tallo similares.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de la Universidad Johns Hopkins y uso Animal Care (protocolo#MO08M263). Todos los animales fueron alojados en un ambiente estéril donde tenían acceso libre a comida y agua como se indica en nuestras directrices institucionales.
Análisis cuantitativo transcripción reversa-PCR (QRT-PCR).
ARN fue preparado como se describió [9], [27]. Los cebadores para la
HMGA1
[28],
torcedura
,
La vimentina
,
E-cadherina
,
FOXC2
,
snail1
,
Slug
,
TCF-3
,
TWIST1
,
Twist2
,
SFH1B
) eran previamente reportado [4].
GAPDH
cebadores están disponibles comercialmente (Applied Biosystems). QRT-PCR reacciones se realizaron por triplicado y se repitieron al menos una vez
análisis de Western
análisis Western se realizaron como se describió [9], [19] -.. [20], [33 ] utilizando un anticuerpo HMGA1 comercial (Abcam, catálogo#AB4078) diluido 1:1000 y β-actina (Cell Signaling, catálogo#4967) diluido 1:1000 como control endógeno.
Las líneas celulares.
HCT116 (CCL-247; American Type Culture Collection) y SW480 (CCL-228; la American Type Culture Collection) fueron cultivadas como se recomienda. Se seleccionaron las células transfectadas en puromicina (3 ug /ml)
Curvas de crecimiento
tasas de crecimiento celular se determinaron como hemos descrito anteriormente [19] -.. [20], [26] - [ ,,,0],29], [33]
Anchorage-independiente crecimiento de las células en ensayos de agar, la migración y la invasión suaves
Estos ensayos se realizaron como se describió [19]. -. [20], [ ,,,0],26] - [28], excepto que el ensayo de migración se llevó a cabo con 60.000 células /pocillo y ensayos de invasión se realizaron con 20 ul de factor de crecimiento reducido Matrigel
ensayo Colonosphere
Colonosphere ensayos.. se realizaron como se describe anteriormente [34].
En vivo
ensayo de metástasis.
Este ensayo se realizó como se describió anteriormente [35] con las células (10
5 ) inyectada por ratón (NOD /Shi
SCID
/IL-2Rγ
nula;.. Jackson Laboratory)
tumorigenicidad xenoinjerto
Estos estudios se realizaron en nude (nu - /-) ratones como lo hemos descrito [19] -.. [20]
Vectores
La horquilla corta de ARN (shRNA) plásmido interferencia de
HMGA1
tiene han descrito [36]. El vector de shRNA vacío se utilizó como control.
El análisis inmunohistoquímico.
Las secciones de tejido (4 m de espesor) a partir de intestinos delgado y grueso de ratones transgénicos y de control se generan y se desparafinaron en xileno y luego hidratado en una serie graduada de alcohol. recuperación del epítopo inducida por calor se llevó a cabo en un autoclave durante 10 minutos en tampón de citrato de sodio (pH 6,0). La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante incubación de las secciones en 4% H
2O
2 durante 5 minutos. Después de lavado en solución salina tamponada con fosfato, las secciones se incubaron con anticuerpo monoclonal de conejo anti-Ki-67 (clon 30-9, Ventana, Tucson, AZ, nº de catálogo 790-4286) durante 1 hora a temperatura ambiente. La tinción positiva se visualizó con el kit de detección DAKO EnVision Plus-HRP (DAKO, Carpinteria, CA) según las instrucciones del fabricante. Ki-67 células positivas fueron contados en 5 campos seleccionados al azar de las áreas comparables en el intestino delgado y grueso de los ratones transgénicos y de control a 20 × magnificación. Un total de 100 criptas para cada ratón fueron contados a partir de secciones teñidas de ratones transgénicos y de control (2 ratones /grupo).
morfología y el tamaño de la célula determinaciones.
Las células se sembraron y se dejaron crecer a 80% de confluencia. Las fotografías para las mediciones de evaluación morfológica y diámetro se obtuvieron utilizando el Zeiss invertido M-scope con el DP72 Olympus y el software (JHMI Fondo confocal). Al menos cinco campos al azar fueron fotografiados para cada línea celular con o sin HMGA1 knock-down. El mayor diámetro (m) se midió para 700-1000 células de cada grupo. Los mayores diámetros se representan como la media ± la desviación estándar; significación se determinó utilizando la prueba t de estudiante.
Resultados
HMGA1a
transgénicos desarrollan pólipos y expansión en el compartimiento de células madre
Para definir el papel de HMGA1 en la tumorigénesis, hemos diseñado ratones transgénicos con el murino
HMGA1a
transgén dirigido por el promotor H2K y mu inmunoglobulina potenciador [9], [27] - [29]. Como se informó anteriormente, todos los ratones sucumben a la malignidad linfoide agresiva [9] y las hembras desarrollan los sarcomas uterinos [28] - [29]. Para determinar si HMGA1 promueve la transformación neoplásica en el epitelio intestinal, se investigó el intestino de estos ratones. El transgén se expresa en los intestinos delgado y grueso por 4-7 veces por encima de la que se encuentra en los controles (Fig. S1). En la necropsia, los intestinos son hiperémica con una mucosa engrosada y el aumento de peso en comparación con los controles (Fig. 1A-D). Histológicamente, ambos intestinos grueso y delgado que presentan grandes cambios proliferativos, la formación de criptas ectópico, y la formación de pólipos (Fig. 1C-D). Hubo un aumento significativo en Ki-67, tanto en el intestino delgado y grueso, un marcador de proliferación (Fig. 2A-B). El aumento en el número de criptas sugiere que estos ratones podrían tener la expansión del compartimento de células madre intestinales [37].
(A) El
HMGA1
intestinos transgénicos son hiperemia con aumento de peso en comparación con los controles ( n = 7 en cada grupo;. p = 0,000000138 por la prueba t de Student) (B) el número de pólipos en los transgénicos y controles (n = 7 en cada grupo; p = 0,000426 por la prueba t de Student). Los diferenciales intestinales (paneles de la derecha) se tiñeron con azul de metileno al 1,5% para acentuar los pólipos para contar. (C) con hematoxilina y eosina del intestino delgado y grueso muestra un acusado cambios proliferativos en los transgénicos (barra = 50 micras). (D) La ampliación de la zona proliferativa resultando en una apariencia difusa hiperplasia de la mucosa y criptas cystically dilatados en los transgénicos. El mayor poder de opinión de la mucosa del intestino delgado muestra la formación de focos ectópicos cripta (flechas).
(A) Ki-67 tinción de los intestinos delgado y grueso de
HMGA1
transgénicos ( paneles inferiores) y los ratones de control (paneles superiores) muestran un aumento significativo de Ki-67 inmunoreactividad en el
HMGA1
transgénicos (20 aumentos). (B) Ki-67 células positivas en
HMGA1
ratones transgénicos y de control fueron enumerados en las criptas del intestino delgado y grueso a 20 × magnificación. Se muestra la media ± la desviación estándar de Ki-67 células positivas por cripta para 100 criptas para cada par de ratones en cada ubicación. Fácilmente se demostraron diferencias significativas entre los transgénicos y controles tanto en los intestinos delgado y grueso (p & lt; 0,00001, prueba t de Student) (C)
HMGA1
expresión se evaluó mediante qRT-PCR y el aumento en la primaria, alto grado (grado 3-4) adenocarcinomas de colon en comparación con tejido del colon adyacente, normal.
β-actina
se utilizó para el control de la carga y el tejido normal se le asignó arbritrarily un valor de 1,0. (D) Análisis de transferencia Western para HMGA1 y control de la proteína (GAPDH) se realizó en 3 tumores con muestra suficiente y mostró el aumento de proteína HMGA1 con la disminución de la diferenciación y el aumento de la invasividad o metástasis Frank. El grado, estado de diferenciación, invasión, y la presencia de enfermedad metastásica se indican.
HMGA1
se enriquece en carcinomas de colon humanos
Los altos niveles de proteína o HMGA1 ARNm se registraron en líneas celulares de cáncer de colon o tumores primarios en un pequeño estudio piloto [38]. Para determinar si
HMGA1
se sobreexpresa en estudios más amplios de los cánceres primarios de colon, nos preguntó gen análisis de perfiles de expresión de los cánceres primarios de colon a partir de seis estudios independientes a través de la base de datos pública Oncomine ™ (Compendio Bioscience, Ann Arbor, MI). Hemos encontrado que
HMGA1
es altamente enriquecido en el adenocarcinoma de colon en comparación con tejido normal en 5/5 estudios previos. En todos estos estudios, HMGA1 estaba entre el 10% superior de los genes enriquecido, y en 4 estudios, que se encontraba entre la parte superior 1-3% de genes enriquecido. En un piloto de 10, de alto grado de primaria (grado III-IV), cánceres de colon (un generoso regalo de Bert Vogelstein), se encontró que la expresión HMGA1 se aumentó en la mayoría de las muestras de cáncer de colon (8/11) en comparación con el tejido normal adyacente de el mismo paciente. Además, la expresión HMGA1 media de todos los tumores se incrementó en 3 veces en comparación con el tejido de control adyacente (Fig. 2C). También se evaluó la expresión de proteínas en un subgrupo de tumores primarios de colon con material suficiente y encontramos los más altos niveles de la proteína HMGA1 en el alto grado, los tumores metastásicos con niveles no detectables en el tejido normal adyacente (Fig. 2D).
se requiere HMGA1 para el crecimiento independiente de anclaje celular, la migración, la invasión y la tumorigénesis en células de cáncer de colon
para investigar el papel funcional de HMGA1 en el cáncer de colon, inhibimos
HMGA1
expresión en los dos puntos consecutivos líneas celulares de cáncer derivados de pobremente diferenciado (grado 4), cánceres de colon metastásico (HCT116 y SW480) usando un enfoque shRNA. La transfección de células con un
HMGA1
shRNA vector resultó en una disminución significativa y estable en proteínas HMGA1 (Fig. 3A) en las células de ARNhc comparación con las células transfectadas con el vector control. Se encontró que el knock-down de HMGA1 bloqueado el crecimiento celular independiente del anclaje o formación de focos en agar blando, la migración y la invasión en las células HCT116 y SW480 (Fig. 3B-C). Por otra parte, no hay tumores formados en ratones desnudos después de la inyección de las células HCT116 con HMGA1 knock-down (10
5 o 10
4 células), mientras que los tumores formados a partir de las células transfectadas con vectores de control (Fig. 3D). No hubo diferencia significativa en las tasas de crecimiento en las líneas celulares con o sin HMGA1 knock-down
in vitro gratis (Fig. S2), lo que indica que el
HMGA1
shRNA no era tóxico para el colon Células cancerígenas. Estos resultados demuestran que HMGA1 impulsa propiedades celulares requeridos tanto para la iniciación del tumor (crecimiento celular independiente de anclaje, la tumorigénesis) y la progresión del tumor (migración, invasión).
(A) transfección con un vector de caída shRNA para
HMGA1
en células altamente agresivos, pobremente diferenciados humanos de cáncer de colon (HCT116 y SW480) resulta en una disminución significativa de la proteína HMGA1. (B) La migración y la invasión fueron evaluados en control (barras oscuras) y HMGA1 knock-down (barras blancas) las células de cáncer de colon (HCT116 y SW480). El gráfico muestra la media ± la desviación estándar de 2 experimentos realizados por triplicado. (P-valores determinados por pruebas de la t de Student están presentados). (C) independiente del anclaje crecimiento celular en agar blando en el control (barras oscuras) y HMGA1 knock-down (barras abiertas) células de cáncer de colon (HCT116 y SW480). Todos los focos & gt; se contaron 50 micras. El gráfico de barras muestra la media ± la desviación estándar a partir de dos experimentos realizados por triplicado. (P-valores determinados por pruebas de la t de Student están presentados). (D) La tabla muestra que knock-down de la formación de bloques HMGA1 tumor en diluciones limitantes. La fotografía muestra representativa ratones desnudos 4 semanas después de la inyección con control o HMGA1 knock-down en las células HCT116 (10
5 /inyección). No se formaron tumores en las células knock-down HMGA1.
propiedades de células madre HMGA1 dependiente en células de cáncer de colon
Debido a
HMGA1
se enriquece en células madre [ ,,,0],5] - [8] y provoca cambios en el intestino del ratón que podría ser consistente con la expansión en el compartimiento de células madre intestinales, hemos tratado de determinar si
HMGA1
está implicado en propiedades de células madre en células de cáncer de colon. Con este fin, se evaluó la formación colonosphere tridimensional en las líneas celulares de cáncer de colon con o sin derribo de HMGA1. Descubrimos una disminución significativa en el número de colonospheres en células tanto el HCT116 y SW460 con HMGA1 knock-down comparación con los controles (Fig. 4A). Estos hallazgos indican que HMGA1 es necesario para este fenotipo de células madre (crecimiento tridimensional) en células de cáncer de colon. En la limitación de los experimentos de carcinogénesis de dilución, knock-down de HMGA1 bloqueó la formación de tumores cuando se inyectaron 104 o 105 células, mientras que los tumores forman en las células de control. Los tumores formados en los dos grupos de derribo de control y si se inyectaron 106 células (Fig.3D). Estos resultados indican que el derribo de HMGA1 agota las células tumorales-iniciador
.
(A) la formación tridimensional colonosphere en el control (barras oscuras) y HMGA1 por ronda (barras blancas) las células de cáncer de colon (HCT116 y SW480). Las esferas se contaron después de 10 días. El gráfico muestra la media ± la desviación estándar de 3 experimentos realizados por triplicado. (P-valores determinados por pruebas de la t de Student están presentados). (B) los focos metastásicos en el hígado se contaron 5 semanas después de la inyección del control (barras oscuras) o células HCT116 HMGA1 knock-down (barras abiertas) (1 × 10
5) en los bazos de ratones desnudos. El gráfico de barras muestra la media ± la desviación estándar de los focos metastásicos a partir de dos experimentos realizados por triplicado. Los ratones inyectados con células de control (barras negro) se compararon con los ratones inyectados con células HMGA1 knock-down (barras abiertas; p-valores determinados por pruebas de la t de Student están presentados). (C) fotografías manifiestas de focos metastásicos en el hígado después de la inyección de las células HCT116 en el bazo de los ratones jude. El hígado izquierda se toma de un ratón representativo inyectados con células de control; el derecho del hígado se toma de un representante del ratón inyectado con células knock-down HMGA1. Fotografías muestran hígados representativas de los ratones que recibieron células
HMGA1
knock-down o el control. (D) El examen histológico de los hígados confirmó que los focos metastásicos se incrementan significativamente a partir de los bazos inyectados con células de control en comparación con las células knock-down HMGA1 (Barra = 100 micras).
se requiere para HMGA1 la progresión metastásica en el cáncer de colon
para determinar si es necesario HMGA1 para la progresión tumoral, se utilizó un modelo preclínico para la progresión metastásica en el cáncer de colon [35]. Se inyectaron células de cáncer de colon HCT116 directamente en el bazo de los ratones inmunodeficientes y metástasis hepáticas se evaluaron después de 5 semanas. Sorprendentemente, encontramos una marcada disminución de focos metastásicos en los hígados de los ratones inyectados con células HMGA1 knock-down (Fig. 4B-C). Estos resultados ponen de relieve el papel fundamental de HMGA1 en la progresión metastásica en este modelo.
HMGA1 induce la expresión de los genes de la EMT
TWIST1
y
La vimentina
Debido estudios recientes vinculan EMT epitelial propiedades de células madre [3] - [4], hemos tratado de determinar si HMGA1 regula los genes de la EMT en el cáncer de colon. Con este fin, se evaluaron los niveles de expresión de 11 genes previamente demostrado que desempeñan un papel importante en la EMT y células iniciadoras del cáncer [4]. En las células HCT116, se encontró que ambos
TWIST1
y
La vimentina
fueron reprimidos de manera significativa en las células con HMGA1 knock-down (Fig. 5A), lo que indica que HMGA1 induce su expresión. En las células SW480,
E-cadherina
está regulado en las células knock-down, lo que sugiere que HMGA1 normalmente reprime su expresión (Fig. 5B).
TWIST1
también fue reprimida de forma significativa en las células knock-down SW480, aunque menos de lo que hemos observado en las células HCT116. En conjunto, nuestros estudios sugieren que HMGA1 promueve la progresión tumoral a través de redes de transcripción que facilitan la progresión metastásica y un estado de tallo como, al menos en parte, mediante la inducción de la
TWIST1
y
vimentina
, mientras reprimir
E-cadherina
. Es de destacar que no hubo cambios en la morfología celular o el tamaño de las células knock-down (Fig. S3), lo que sugiere que la baja regulación de HMGA1 en estas células no es suficiente para inducir cambios morfológicos consistentes con una reversión a un estado más epitelial cuando se cultiva como una monocapa. Como se señaló anteriormente, hubo alteraciones significativas en las características de crecimiento cuando se cultiva de una manera independiente de anclaje o después de la implantación en ratones. La variación en los genes de EMT modulada por HMGA1 en estas dos líneas celulares diferentes probablemente refleja el medio diferente y el potencial de reprogramación en las células de cáncer en base a los cambios genéticos y epigenéticos subyacentes
.
(A) en las células HCT116,
TWIST1
, y
la vimentina
la expresión de ARNm fueron reprimidos por QRT-PCR en las células HMGA1 knock-down en comparación con las células control.
E-cadherina
y otros genes EMT no se vieron afectados en estas células. (P-valores determinados por pruebas t de los estudiantes se muestran). (B) En las células SW480,
La vimentina
se reprime y
E-cadherina
se induce en las células con HMGA1 knock-down. (P-valores determinados por pruebas t de los estudiantes se muestran).
Discusión
cáncer de colon metastásico es altamente letal y la incidencia va en aumento, sobre todo en personas más jóvenes [1] - [2]. Las terapias actuales están limitados por la aparición de células cancerosas metastásicas que son resistentes al tratamiento. La evidencia reciente sugiere que estas células se desarrollan refractarios porque cooptar a las redes celulares implicados en el desarrollo embrionario y llegar a ser capaces de hacer metástasis y evadiendo la terapia [3] - [4]. El
HMGA1
oncogén fue identificado recientemente como un factor de transcripción clave enriquecida en células madre embrionarias y los tumores de alto grado con pobres resultados [3], aunque su función en estos lugares ha sido difícil de alcanzar. Este gen es un miembro de la
HMGA
familia de genes, que también incluye
HMGA1
[11] - [18] y
HMGA2
[31], [39] - [40]. Todas las proteínas son HMGA, de bajo peso molecular (proteínas así una alta movilidad de grupo) pequeños con un dominio de unión a ADN AT-gancho que media la unión a las regiones ricas en AT en el surco menor de la cromatina. HMGA1 y otras proteínas AT-gancho se cree que la función mediante la modulación de estructura de la cromatina y la expresión de genes [15] - [18], [41] - [42]. Aquí, se muestra por primera vez que
HMGA1
induce cambios proliferativos y la formación de pólipos en el intestino de los ratones transgénicos. Por otra parte,
HMGA1
se requiere para la dilución limitante tumorigénesis
in vivo
junto con la formación de colonosphere 3-dimensional
in vitro
, ambos de los cuales son fenotipos característicos de las células madre epiteliales. Además, la inhibición de
HMGA1
bloquea la expresión no sólo propiedades de transformación que participan en la iniciación del tumor (crecimiento celular independiente de anclaje, la tumorigenicidad), sino también características celulares que promueven la progresión metastásica (invasión y migración). También descubrimos que
se requiere HMGA1 Opiniones de progresión metastásica al hígado
in vivo
. En particular, varios estudios recientes han demostrado también que
HMGA1
se enriquece en células madre normales, incluyendo las células madre embrionarias y hematopoyéticas [3] - [8], además de cánceres pobremente diferenciados, o refractarios madre-como [ ,,,0],8] - [32], lo que sugiere que HMGA1 ayuda a impulsar un estado de tallo como, tanto en el desarrollo normal y el cáncer.
HMGA1
también es altamente expresado durante la embriogénesis, con baja o indetectable expresión en tejidos adultos, más diferenciadas [43].
Para determinar cómo HMGA1 organiza la progresión del tumor y el tallo fenotipos de células, se investigó la expresión de genes que han sido previamente demostrado ser importante en EMT, el desarrollo, y las células iniciadoras del tumor [4]. En las células HCT116, encontramos que HMGA1 hasta regula la expresión de ambos
TWIST1
y
La vimentina
. En las células SW480, HMGA1 también hasta regula
TWIST1
, mientras que reprime
E-cadherina
.
E-cadherina
no cambió en las células de cáncer de colon HCT116 Con knock-down de
HMGA1
, lo que podría reflejar el silenciamiento estable de
E-cadherina
en estos mesenquimales, altamente líneas celulares de cáncer de colon metastásico. Las redes de transcripción regulados por HMGA1 probablemente depende del medio celular y las características genéticas y epigenéticas subyacentes.
En resumen, nuestros estudios proporcionan la primera evidencia que vincula a HMGA1 propiedades celulares y redes transcripcionales importantes en las células madre, EMT, y la progresión metastásica en el cáncer de colon. Aunque es necesario trabajar más, estos resultados ponen de relieve el papel de HMGA1 como un regulador clave en la progresión tumoral y un estado de tallo como en el cáncer de colon y sugieren que la orientación vías HMGA1 podría ser beneficioso en la terapia para el cáncer de colon. Debido a
HMGA1
está enriquecida en células madre embrionarias, células madre específicas de tejido, y los tumores agresivos prácticamente todos los estudiados hasta la fecha, nuestros hallazgos probablemente relevantes no sólo para diversos cánceres humanos, sino también para el desarrollo normal.
Apoyo a la Información
Figura S1.
HMGA1
expresión de los transgenes a través de los intestinos delgado y grueso en el ratón transgénico (TG) en comparación con el tipo salvaje (WT) controles. QRT-PCR para
HMGA1
y el gen de control,
GAPDH
, se llevó a cabo a partir de tejido obtenido a lo largo del intestino delgado (duodeno, yeyuno, e íleon) y el intestino grueso (colon ascendente, A designado colon y colon descendente, el colon designado D) de los ratones TG y WT.
HMGA1
expresión en el intestino TG se incrementa en 4 a 8 veces por encima de la observada en los ratones WT, que fue asignado arbitrariamente un valor de 1. Reacciones Todo QRT-PCR se realizaron por triplicado y se repitieron al menos una vez
doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s001 gratis (TIF)
figura S2. tarifas
proliferación en células HCT116 o cáncer de colon SW480 con HMGA1 knock-down o vector de control. las tasas de (a) el crecimiento de las células HCT116 transfectadas con el HMGA1
HMGA1
shRNA vector para knock-down (cuadrados rojos) o vector de control (círculos azules) muestran una tasa de proliferación similares. Las desviaciones estándar son ≤10% y por lo tanto no es visible. tasas (B) de crecimiento de las células SW480 transfectadas con el vector de control (círculos azules) o
HMGA1
shRNA vector (cuadrados rojos) muestran una tasa de proliferación similares. Las desviaciones estándar son ≤10% y por lo tanto no es visible
doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
resultados HMGA1 knock-down en alteraciones en los genes de la EMT y sin cambios en la morfología celular. (A) de la precipitación de HMGA1 en las células HCT116 no resulta en cambios en la morfología celular o diámetro en comparación con los controles. (B) de la precipitación de HMGA1 en las células SW480 no da lugar a cambios en la morfología celular o diámetro en comparación con los controles. Se tomaron fotografías de células vivas utilizando un objetivo de 10x; barra de escala, 100 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0030034.s003 gratis (PPTX)