Extracto
El desarrollo de agentes de productos naturales con estrategias dirigidas mantiene la promesa de la terapia contra el cáncer mejorado con drogas reducida -asociado efectos secundarios. El resveratrol en el vino tinto, tiene actividad contra el cáncer en varios tipos de tumores. Hemos informado anteriormente sobre una nueva diana molecular de resveratrol, la proteína de la metástasis asociada 1 (MTA1), que es una parte de la remodelación de nucleosoma y la desacetilación (NuRD) complejo co-represor que media el silenciamiento de genes. Se identificaron resveratrol como un regulador de complejo MTA1 /NuRD y re-activador de la acetilación de p53 en el cáncer de próstata (CaP). En el presente estudio, se consideró si los análogos de resveratrol también poseen la capacidad de inhibir MTA1 y para revertir la desacetilación de p53. Hemos demostrado que Pterostilbene (PTER), que se encuentra en los arándanos, tuvo mayor aumento de la acetilación de p53 mediada por MTA1, lo que confirma la potencia superior sobre el resveratrol como agente epigenético de la dieta. En ortotópico CaP xenoinjertos, resveratrol y el crecimiento del tumor inhibió significativamente el PTER, progresión, invasión local y metástasis espontánea. Además, MTA1-desmontables células a estos agentes que resulta en una reducción adicional de la progresión tumoral y la metástasis sensibilizados. La reducción era dependiente de la señalización de MTA1 que muestra el aumento de la acetilación de p53, mayor índice apoptótico y menos angiogénesis
in vivo
en todos los xenoinjertos tratados con los compuestos, y particularmente con PTER. En conjunto, nuestros resultados indican MTA1 como un factor importante en la progresión del tumor maligno de la próstata, y apoyan el uso de estrategias de orientación MTA1. Nuestros datos preclínicos indican fuertes PTER como
Visto potente, selectivo y producto natural farmacológicamente segura que puede ser probado en el CaP avanzado:. Li K, SJ Dias, Rimando AM, Dhar S, Mizuno CS, Penman AD, et al. (2013) Hechos Pterostilbene través de la proteína asociados a metástasis del 1 al inhibir el crecimiento tumoral, la progresión y la metástasis en el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (3): e57542. doi: 10.1371 /journal.pone.0057542
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Septiembre, 2012; Aceptado 25 de enero de 2013; Publicado: 1 Marzo 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. El estudio fue apoyado en parte por los subsidios del Programa de Apoyo a la Investigación Intramural (# 59927 y#68100231012) de la Universidad de Mississippi Medical Center de ASL. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) de tratamiento todavía representa una necesidad médica insatisfecha. polifenoles derivados de la dieta, incluyendo estilbenos, son candidatos clínicos atractivos para la quimioprevención del cáncer primario y secundario debido a su capacidad de no sólo bloquean o inhiben iniciación de la carcinogénesis, sino también para revertir las etapas de promoción. Esta última característica hace que estos compuestos prometedores agentes terapéuticos. Resveratrol (Res) y otros estilbenos naturales son fitoalexinas que son producidos por las plantas en respuesta al estrés ambiental [1]. El resveratrol tiene actividades cardioprotectoras, anti-inflamatorias y el cáncer [2], [3]. Las acciones contra el cáncer de resveratrol implican regulación de múltiples y diversas dianas moleculares y están mediados por la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis [4] - [8] y la inhibición de la angiogénesis [9] - [13].
recientemente descubierto que el resveratrol regula a la baja la metástasis asociada a la proteína 1 (MTA1) en el CaP [13]. sobreexpresión MTA1 se correlaciona con clinicopathological parámetros que caracterizan a la agresividad del tumor: metástasis a los ganglios linfáticos, los grados altos de tumores, y la angiogénesis en diversos tipos de cáncer [14] - [19]. En los tejidos de próstata humanos, un alto nivel de MTA1 se asoció con CaP hormono-refractario [15]. Inicialmente se identificó MTA1 como nuevo participante en el "círculo vicioso" de la metástasis ósea del CP, y se demostró, además, que la intensidad de la tinción y la localización nuclear de MTA1 en los tejidos humanos se correlaciona con la agresividad del CaP y lesiones metastásicas óseas [19]. También hemos establecido que tenía MTA1 favor de la supervivencia, anti-apoptótica, propiedades invasivas y pro-angiogénicos en el CaP
in vitro
y
in vivo
[19].
MTA1 es una parte del complejo de remodelación nucleosoma y la desacetilación (NuRD) co-represor implicado en y desacetilación de histonas proteínas no histonas y la regulación transcripcional de genes específicos [20], [21]. El complejo también contiene histonas deacetilasas 1 y 2 (HDAC1 y 2). Anteriormente puso de manifiesto que el resveratrol inducida por la degradación MTA1 desestabiliza el complejo desacetilación MTA1 /HDAC /NuRD lo que aumenta la acetilación /activación de p53 supresor de tumores en células de CaP [13]. MTA1 silenciar a través de RNAi sensibilizado significativamente las células de CaP a la acetilación de p53 resveratrol dependiente y la apoptosis. Esta actividad inhibidora de HDAC-como de resveratrol fue apoyado además por experimentos de combinación con clínicamente aprobado inhibidor de HDAC suberoilanilida ácido hidroxámico (SAHA), en la que el resveratrol sinérgicamente reforzada p53-acetilación y la apoptosis [13]. También hemos demostrado que las células MTA1 desmontables había suprimido la invasión y la actividad angiogénica
in vitro
, y el retraso en la formación de tumores y el desarrollo en xenoinjertos subcutáneos [19]. Tomados en conjunto, se definió un mecanismo epigenético novela de actividad contra el cáncer de resveratrol mediada a través del regulador epigenético negativo, MTA1.
A pesar de sus propiedades prometedoras, rápido metabolismo de resveratrol y baja biodisponibilidad han impedido su avance en el uso clínico [2] , [22] - [24]. Las limitaciones de resveratrol han llevado a nuestro interés en análogos naturales y sintéticos con la mejora de la farmacocinética y la potencia farmacológica superior que tienen un mayor potencial como fármacos contra el cáncer de productos naturales [25]. Sin embargo, la forma en análogos de resveratrol se comparan entre sí en términos de potencia y mecanismos de acción es en gran parte desconocida. El
in vivo
efectos son principalmente inexplorado para los análogos de resveratrol, que hace que sea difícil seleccionar qué analógica (s) es el mejor para el desarrollo clínico.
En el presente estudio, se llevó a cabo una análisis comparativo de resveratrol y seis análogos en su capacidad para inhibir la expresión MTA1 y señalización, y se centró en el cáncer MTA1 mediada y efectos antimetastásicas de los más potentes analógica, PTER, utilizando xenoinjertos de CaP ortotópico. Nuestros resultados indican MTA1 como un objetivo de gran alcance para la intervención de la dieta PTER como fármaco terapéutico para el producto natural terapia contra el cáncer en el CaP primario y metastásico.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo a protocolo aprobado animales#1272 por el Comité de Cuidado y uso de animales Institucional de la Universidad del Centro Médico de Mississippi y acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International en cumplimiento de la política de Estados Unidos Servicio de Salud Pública como asegurado por la Oficina de Protección de los Animales de laboratorio.
Materiales
el resveratrol y piceatanol (PIC) se obtuvieron de fuentes comerciales (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO y Calbiochem-Novabiochem Corp. , San Diego, CA, respectivamente). Pterostilbene se sintetizó siguiendo los procedimientos publicados [26] trimetoxi-resveratrol (3M-Res) y (
E
) -4- (3,5-dimetoxiestiril) anilina (DMSA) se sintetizó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente [27 ]. Triacetil-resveratrol (3ac resolución) y resveratrol 3,5-diacetil (2AC-Res) se sintetizaron como sigue: a 18 mg de resveratrol disueltos en 500 l de MeOH, se añadieron 10 gotas de piridina y 500 l de anhídrido acético. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo (EtOAc) a la mezcla de reacción, y después se repartió con agua para eliminar la piridina. La capa de EtOAc se concentró bajo una corriente de nitrógeno, y manchado sobre una placa de cromatografía en capa fina. La placa se reveló usando el sistema de disolvente 30% de EtOAc: 70% hexano. Las bandas de 3AC-Res (Rf 0,8) y 2AC-Res (Rf 0,6) se rasparon de la placa y se extrajo con EtOAc. Las estructuras de 3ac-Res y 2AC-Res fueron determinados por resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas. Las estructuras de todos los otros estilbenos también han sido confirmadas por espectroscopia. La pureza de los compuestos se determinó que era & gt; 99%. Los compuestos se disolvieron en etanol de alta pureza o DMSO y se almacenaron en la oscuridad a -20 ° C antes de su uso en los ensayos.
Cell Cultura y
células LNCaP y Du145 CaP fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC). PC3M células fueron un regalo del Dr. R. Bergan (Northwestern University, Chicago, IL) [28], [29], y RWPE-1, células epiteliales de próstata inmortalizadas "normales", fueron un regalo del doctor C. Lee ( Northwestern University, Chicago, IL) [30]. células de CaP se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS, 5% de penicilina /estreptomicina como se ha descrito anteriormente [13], [19]. células RWPE-1 se cultivaron en medio de crecimiento completo ATCC, que contienen base de suero de queratinocitos medio libre suplementado con extracto de pituitaria bovina y factor de crecimiento epidérmico recombinante humano. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO
2. Se reemplazó el medio con fenol RPMI-1640 sin rojo con 5% de suero tratado con carbón vegetal 16 a 18 h antes de resveratrol /análogos de tratamientos para proporcionar fondo libre de esteroides.
análisis de transferencia Western
Western blot se realizó como se describió anteriormente [13], [19]. Brevemente, las células se trataron con varias concentraciones de resveratrol o análogos para 24 hr. Las células se lavaron con PBS frío, y se lisaron mediante tampón de lisis y extracción RIPA que contiene fosfatasa Halt y cóctel inhibidor de proteasa (Thermo Scientific). La concentración de proteínas se midió usando el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Igual cantidad de proteína (40-70 g) se resolvieron en un 7-10% Tris-TGX Ready geles y transferidos a una membrana de PVDF por el Sistema de Transferencia Mini Trans-Blot electroforesis (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las membranas fueron bloqueadas con TBS-Tween y leche en polvo al 5% durante 2 horas a temperatura ambiente y se sondaron con anticuerpos MTA1, AR, p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o Ac-p53 (K381) (Abcam). Las transferencias se sondearon con anticuerpos luego beta-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como control de carga. Las señales se visualizaron mediante quimioluminiscencia aumentada. La densitometría se realizó utilizando Image dosis J. efectiva (ED 50
) Los valores se calcularon por el método de Chou-Martin utilizando CompuSyn de Drogas y combinaciones de software general Análisis dosis-efecto (ComboSyn, Inc., Paramus, Nueva Jersey).
Generación de células estables Etiquetados con luciferasa
DU145 células mta1-desmontables fueron previamente establecidos mediante la expresión de detención vectores lentiviral GIPZ shRNAmir que expresan MTA1shRNA o silenciamiento no vector vacío (EV, Open Biosystems) y se caracterizado
in vitro
y
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[13], [19]. Vectors contenían proteína verde fluorescente (GFP) y un gen de resistencia a puromicina. Aunque las células demostraron alta GFP señales
in vitro
, los
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experimentos no tuvieron éxito debido a las altas señales de fondo de los tejidos animales. Como bioluminiscencia tiene una alta relación señal-ruido en comparación con la fluorescencia, que transducidas células con la luciferasa lentiviral (Luc) construir (un regalo del doctor R. Graeser, Departamento de Oncología Médica, Freiburg, Alemania) y clones estables seleccionados utilizando puromicina. poblaciones clonales de células se expandieron
in vitro
y probado por sus actividades de luciferasa (véase más adelante). Varios clones brillantes se seleccionaron varias veces de nuevo y se agruparon juntos por células con alta expresión de luciferasa que se utilizará
in vivo.
in vitro
y
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bioluminiscente de imágenes
in vitro
y
in vivo
bioluminiscencia (BL) se realizó utilizando un espectro IVIS (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Las imágenes y la detección de las señales BL fueron adquiridos y analizados mediante el software de imagen vida V. 4.1. Para
in vitro
de imágenes, las células etiquetadas con luciferasa se diluyeron en serie en un fondo claro de la placa de negro, de 96 pocillos (Costar, Corning, NY). Se añadió D-luciferina (150 g /ml) a los pocillos, la placa se incubó a 37 ° C, 5% de CO
2 de 10 min después de lo cual se tomaron las imágenes. Para
in vivo de formación de imágenes
BL, los ratones anestesiados se les inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) con 150 mg /kg de D-luciferina (Caliper) y se colocan dentro de la caja de la cámara para 10 min. La exposición continua a 2% de isoflurano sustenta la sedación durante la exploración. El tiempo de adquisición era por lo general un máximo de 3 minutos con la exposición automática en función de la BL de los tumores. Las mediciones de la luz emitida se realizaron para las regiones de interés (ROI) y se cuantificaron como flujo de fotones (fotones /s /cm2 /sr). La normalización se realiza para todas las imágenes al final del experimento. imágenes en escala de grises de los ratones, también se recogieron en cada sesión. La detección de la metástasis durante el experimento estaba contaminada por la señal primaria fuerte lo que resulta en las señales de falsos positivos. Por lo tanto, al final del experimento, se aislada la señal primaria mediante la escisión de la próstata y el tejido circundante músculo para exponer los órganos en la cavidad abdominal. Riñones, hígados y pulmones /corazón de cada ratón se aislaron y
ex vivo
reflejado por el aumento de hurgar en la basura y F /parada.
ortotópico CaP xenoinjertos
Siete semanas de edad ratones desnudos masculinos (Fox n1nu, Harlan) fueron alimentados con la dieta AIN-76A sin fitoestrógeno del día recibido. Los animales fueron asignados aleatoriamente a dos grupos principales antes de la cirugía y posteriormente inyectados con células Du145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) Du145-EV-Luc (EV) o. Durante los ratones de cirugía fueron anestesiados con 2% de isoflurano, se hizo una incisión de línea media de 7-9 mm abdominal, y la próstata se expuso. 2,5 × 10
6 células de cada línea celular, en 20 l de PBS y Matrigel, se inyectaron en la próstata anterior. Se suturó la herida y la piel se cerró con autograpas. Los animales fueron monitoreados de cerca después de la cirugía y se eliminaron los clips en el día 10. Los tumores colonizados y crecieron durante 14 días. Los ratones que desarrollaron tumores en cada grupo se asignaron al azar en tres subgrupos (n = 6) con i.p. la administración de 10% DMSO control simulado (Ctrl); 50 mg /kg de resveratrol o PTER. Ambos compuestos son solubles en DMSO al 10% cuando se ha calentado en marcha usando un baño de agua. Cada semana se prepararon soluciones frescas para preparaciones inyectables. Los pesos corporales y señales BL se controlaron semanalmente. Los ratones se sacrificaron en la semana 8 después de la inoculación celular. En la necropsia, la próstata y otros órganos fueron extirpados,
ex vivo
fotografiado y se fijaron con formalina al 10% tamponada neutra (Richard Allan Scientific, Kalamazoo, MI). El suero también fue recogido y almacenado a -80 ° C
La histopatología e inmunohistoquímica
Cuatro M se prepararon secciones gruesas de tumores incluidas en parafina fijadas en formalina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp;. E ) utilizando el protocolo estándar. se aplicó inmunohistoquímica (IHC) para evaluar Ki-67, p53, Ac-p53 (K381), M30 y CD31 como se describe anteriormente [19]. Brevemente, las secciones se deparaffinized, rehidratada con xileno y descendente grados de alcohol y agua. La recuperación del antígeno se realizó mediante ebullición las diapositivas de antígeno desenmascarar Solución (Vector Labs, CA) durante 30 minutos en un vapor. Los portaobjetos se enfrió y la actividad peroxidasa endógena se inactivó en 3% H
2O
2 en etanol durante 5 min. El bloqueo se realizó de acuerdo con los anticuerpos empleados para la tinción utilizando el kit Vectastain ABC Elite (Vector Labs, CA). Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos: anti-Ki67 (1:100) y anti-p53 (1:100, Santa Cruz Biotecnología, CA), anti-CD31 (1:100) y anti-Ac- p53 (1:100, Abcam, MA) y anti-M30 (1:100, Roche Diagnostics, GmbH, Alemania). Las secciones se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados del kit ABC y la tinción se reveló usando el kit de IMMPACT DAB (Vector Labs, CA). Las diapositivas se counterstained en hematoxilina, se deshidrataron y se montó. Las imágenes fueron observar y registrar imágenes de microscopio Nikon Eclipse E400. El software ImageTool se utiliza para contar células teñidas positivamente en cinco campos seleccionados al azar.
Análisis de Resveratrol y Pterostilbene contenido en murino suero mediante espectrometría de cromatografía de gases-masas (GC-MS)
Serum , almacenada en -80 ° C congelador antes de su uso, se centrifugó a 4 ° C durante 15 min y se trata con 80 l de β-glucuronidasa (1.250 U /ml de tampón de fosfato de potasio 75 mM, pH 6,8 a 37 ° C). La mezcla se incubó a 37 ° C con agitación a 750 rpm, durante 17,5 horas, se enfrió a temperatura ambiente y después se repartió con 75 l de EtOAc. La capa de EtOAc se secó bajo una corriente de nitrógeno, derivatizado con 30 l de 01:01 mezcla de N, O-bis [trimetilsilil] trifluoroacetamida y dimetilformamida (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) y se utilizaron para el análisis. El análisis por GC-MS se realizó usando un instrumento JEOL GCMate II (JEOL, EE.UU. Inc., Peabody, MA) con un J & amp; columna capilar W DB-5 (0,25 mm de diámetro interno, 0,25 m de espesor de película, 30 mm de longitud; Agilent Technologies , Foster City, CA). El programa de temperatura GC fue: inicial 190 ° C se mantuvo durante 1 min, se incrementó a 244 ° C a razón de 30 ° C /min y se mantuvo a esta temperatura durante 0,5 min, aumenta hasta 246 ° C a razón de 0,5 ° C /min y se mantiene durante 0,5 min, aumentó a 280 ° C a razón de 20 ° C /min y se mantiene durante 2 min, y finalmente se incrementaron a 300 ° C a razón de 30 ° C /min y se mantuvo durante 0,8 min. El gas portador fue helio ultra alta pureza, en 1 ml de velocidad de flujo /min. El puerto de inyección se mantuvo a 250 ° C, la interfaz de GC-MS a 230 ° C, y la cámara de ionización a 230 ° C. El volumen de inyección fue de 2 l (inyección sin división). El espectro de masas fue adquirida en el modo de monitorización de iones seleccionados, por impacto de electrones de 70 eV. Pterostilbene se controló con m /z 328, 313 y 297 (tiempo de retención 11,6 min). Resveratrol se controló con m /z 444, 428 y 414 (tiempo de retención 13,7 min). La cuantificación se realizó utilizando estándares externos de una muestra comercial de resveratrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y una muestra sintética de PTER [31].
Análisis estadísticos
Los valores se expresan como la media ± SE o diagramas de caja de mediciones. Se utilizó la prueba t pareada de una cola de Student para analizar los datos
in vitro
. Las diferencias en la intensidad del tumor BL
in vivo
se analizaron mediante el test ANOVA basado en rango o de doble vía, seguido de Bonferroni análisis post hoc o mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Para algunos valores de los datos de análisis fueron transformados log. se consideraron significativas a p & lt las diferencias;. 0.05
Resultados
Pterostilbene es un potente inhibidor de la expresión en células de CaP MTA1
Recientemente hemos descubierto que el resveratrol inhibe la MTA1 modificador epigenética , lo que conduce finalmente a un aumento de la acetilación de p53 y la apoptosis de células de CaP [13]. Aquí, hemos probado seis análogos de resveratrol (Fig. 1) para determinar si tendrían mejor actividad contra el cáncer a través de la inhibición de esta diana molecular específica. De los análogos, PTER, piceatannol (PIC) y trimetoxi-resveratrol (3M-Res) son de origen natural, mientras que dimethoxystyrylaniline (DMSA), diacetylstilbene (2AC-Res) y triacetylstilbene (3AC-Res) son derivados sintéticos. Se examinaron los efectos de estos análogos sobre la expresión MTA1 en tres líneas celulares de CaP, que representan diferentes etapas de la progresión del CaP. Las células expresan MTA1 a diferentes niveles, de moderadamente alto en andrógenos LNCaP sensible y andrógenos resistente Du145 a niveles muy altos en las células metastásicas PC3M (Fig. 2A). Nos trataron las células con diferentes dosis (5-100 m) de resveratrol /análogos durante 24 horas y proteína aislada de transferencias de Western. Hubo baja regulación de la expresión en MTA1 tratados con el compuesto en comparación con las células tratadas con vehículo (Fig. 2). Resveratrol y análogos inhibieron los niveles de proteína MTA1 de una manera dependiente de la dosis, pero con diferentes potencias. MTA1-inhibición por los análogos era específico de células: mientras que el efecto inhibidor de PTER fue comparable con la de resveratrol en las células LNCaP (Fig. 2B), en células Du145, 3ac-Res, PIC y PTER eran más potentes que el resveratrol, pero sólo PTER tenía una ED
50 valor en el rango micromolar baja (13,9 M) (Fig. 2C). En las células PC3M, 3M-Res y PTER demostrado mayor potencia que el resveratrol, y una vez más, PTER tenido la ED
50 valor más bajo (41,6 M; Fig. 2D). Por lo tanto, entre los seis análogos ensayados, PTER demostró la más potente MTA1 de inhibición a través de las tres líneas celulares. Pterostilbene fue inicialmente aislada de sándalo y más tarde se encuentra en las uvas y los arándanos [31], [32]. Como resveratrol, PTER es un potente antioxidante y el agente anti-inflamatorio con quimiopreventivo y la actividad contra el cáncer [33] - [42]. En las células Du145, PTER exhibió la mayor potencia inhibidora MTA1 (más de siete veces mayor que el resveratrol). Es importante destacar que, PTER demostró mayor aumento de la acetilación de p53 mediada por MTA1, especialmente en las células sensibilizadas MTA1-desmontables (Fig. 3), lo que implica una potencia superior sobre el resveratrol como agente epigenético de la dieta que controla modificaciones postraduccionales de las proteínas.
El resveratrol ( Res),
trans-
-3,5,4' trihidroxiestilbeno; Pterostilbene (PTER),
trans
-3,5-dimethoxystilbene; Trimetoxi-resveratrol (3M-Res),
trans-
-3,5,4' trimethoxystilbene; Piceatannol (PIC),
trans-
-3,5,3'4' tetrahidroxiestilbeno; Dimethoxystyrylaniline (DMSA),
trans
-4- (3,5-dimetoxiestiril) anilina; El diacetil-resveratrol (2AC-Res),
trans
-3,5-diacetylstilbene; Triacetil-resveratrol (3AC-Res),
trans-
-3,5,4' triacetylstilbene.
A. Las líneas celulares que representan diferentes etapas de la progresión del CaP:, células epiteliales de próstata inmortalizadas "normales" RWPE-1; LNCaP, las células sensibles a andrógenos; Du145, las células de andrógenos resistente; PC3M, células metastásicas agresivos. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 que contienen 10% de FBS y antibióticos. 75 g de proteína se separó en gel de 10%, se transfirieron a una membrana y se sondaron con anticuerpos MTA1. β-actina era un control de carga. Pterostilbene tiene la más alta potencia en la inhibición MTA1. B. efectos dependientes de la dosis de Res /análogos en los niveles de proteína en MTA1 LNCaP; en Du145 (C) y las células en PC3M (D). (I) las células fueron tratadas con 5-100 M de Res /análogos durante 24 horas y se analizaron por inmunotransferencia. (Ii) la representación gráfica de los resultados. El Ctrl se establece en 1 y los cambios del nivel MTA1 se expresan como un porcentaje de Ctrl. Se muestran las medias ± SE de cuatro experimentos independientes. • p & lt; 0,05,#p & lt; 0,01, * p & lt; 0,001. (Iii) las dosis efectivas (ED
50) se calcularon por el método de Chou-Martin.
Células
Du145-EV y Du145-MTA1shRNA (Fig. S1) fueron tratados con 50 M de Res o PTER durante 24 horas y se analizaron para MTA1, p53, Ac-p53 por Western blot como se describe en "Materiales y métodos". Se muestra una blot representativo. La cuantificación de la relación de Ac-p53 /p53 se llevó a cabo mediante el software Image J y los datos se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes
efectos del resveratrol y Pterostilbene en el crecimiento del tumor ortotópico, la progresión y metástasis:. Participación de MTA1
Hemos demostrado anteriormente que los niveles endógenos de MTA1 promueven el desarrollo tumoral en un modelo subcutánea de CaP [19]. Sin embargo, se desconoce la función de MTA1 en CaP crecimiento, la progresión y la metástasis y los efectos del resveratrol y PTER no han sido evaluadas en modelos CaP ortotópico. Para comparar el
in vivo
eficacia de resveratrol y PTER, y para estudiar el papel de MTA1 en el crecimiento del tumor de próstata y la progresión, se utilizó el modelo de ratón ortotópico clínicamente relevante, en el que células de CaP humanos que expresan o silenciados por MTA1 puede crecer en un entorno relacionado con su tejido de origen. El objetivo de este experimento fue triple: 1) para evaluar la eficacia del resveratrol y PTER para inhibir el crecimiento y la progresión del CaP ortotópico; 2) para evaluar el papel de MTA1 en el desarrollo de tumores de próstata, la progresión y la metástasis, y 3) para determinar si MTA1 afecta a la susceptibilidad de tumor de próstata primario y metástasis de resveratrol y PTER.
Para examinar la MTA1 dependiente efectos, que utilizan nuestros DU145 células anteriormente descritas y caracterizadas transducidas con lentivirus EV de carga y MTA1shRNA [13], [19]. Hemos marcado estas células con luciferasa y los usamos para la inoculación ortotópico (Fig. 4). Antes del trasplante, la validación de la expresión de luciferasa y desmontables MTA1 en las células Du145-Luc se llevó a cabo utilizando el ensayo bioluminiscente
vitro
en y Western blot, respectivamente (Fig. S1). En la cirugía, los ratones se inyectaron en la glándula de la próstata con células EV-Luc y MTA1shRNA-Luc. Para asegurar una respuesta específica a MTA1-caída y el tratamiento con compuestos, permitimos que los tumores que colonizan y se desarrollan durante 14 días antes de la aleatorización. desarrollo tumoral se controló por semanal de formación de imágenes BL. Los ratones que desarrollaron tumores (12/16 grupo EV y 15/16 grupo MTA1shRNA) se asignaron al azar por el tamaño de las imágenes en tres subgrupos y se trataron con control de vehículo (10% DMSO), resveratrol o PTER, ip, a la misma 50 mg /dosis /día kg. Pterostilbene dosis se mantuvo idéntica a la del resveratrol para determinar las diferencias de potencia. Mientras que los ratones tratados con vehículo mostraron progresión tumoral rápido en xenoinjertos EV, resveratrol y PTER causaron retraso notable en el crecimiento del tumor (Figs. 4A y B). Resveratrol, pero más PTER, mostraron efectos inhibidores de tumores, aunque no se alcanzó significación estadística debido al pequeño número de ratones. Xenoinjertos expresan MTA1shRNA exhibieron redujo notablemente el crecimiento del tumor en la semana 5 después del trasplante con una importancia secundaria en comparación con EV-Ctrl (p = 0,05). Por otra parte, los tumores mta1-desmontables tratados con compuestos tenían aún más la respuesta, y las diferencias en comparación con EV-Ctrl hicieron altamente significativa (p = 0,001 para el resveratrol, p = 0,0004 para el PTER). Por lo tanto, MTA1-desmontables células a resveratrol y en particular a PTER sensibilizados. Consistentes con los efectos antitumorales potentes, resveratrol- y tratada PTER-tumores demostraron una reducción de la actividad mitótica en comparación con EV-tumores tratados con vehículo, como se muestra por Ki-67 IHC (Fig. 5A). Es importante destacar que, en consonancia con la actividad MTA1 reducida en los tumores, aguas abajo acetil-blanco de MTA1, Ac-p53, se había incrementado significativamente los niveles de sobre tratamientos, mejor visto con PTER (Fig. 5B). De acuerdo con ello, M30 tinción reveló un gran aumento en la apoptosis en los tumores de los ratones tratados con el compuesto eV y grupo MTA1-desmontables (Fig. 5C). Además, el área de los microvasos, según la evaluación de la inmunotinción CD31, disminuyó en un ~59% en los tumores tratados con compuestos EV y por ~67% en el grupo MTA1-caída en comparación con EV-Ctrl (Fig. 5D).
Varón ratones desnudos fueron inyectadas de forma ortotópica con DU145-EV-Luc (EV) o Du145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) y tratados con vehículo (Ctrl), Res o PTER, 50 mg /kg /día, todos los días, ip se muestran imágenes representativas A. Normalized BL de ratones de cada grupo. B,
la izquierda, el análisis cuantitativo de la emisión de luz tumor en total Flux (fotones /s /cm2 /sr) se representa en función del tiempo. se muestra la media ± EE (n = 6 en el inicio), * p = 0,05. se muestran
Derecho
, registro tendencias para cada grupo. Se detectó la inhibición del crecimiento significativo en EV-vs-MTA1shRNA tumores como grupos, ** p & lt; 0,01 y entre EV-Ctrl vs. MTA1shRNA-Res y MTA1shRNA-PTER, *** p & lt;. 0.001
izquierda,
imágenes representativas de IHC de A. Ki-67 (proliferación); B. /p53 (señalización MTA1)-p53 Ac; C. M30 (apoptosis); y se muestran D. CD31 (angiogénesis) en EV-y-MTA1shRNA tumores.
Derecho, España cuantificación de células teñidas positivamente como porcentaje del total de células. Los datos son diagramas de caja de elegidos al azar cinco campos analizados de forma independiente por dos investigadores. Las comparaciones por pares, * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001 frente a EV-Ctrl;
#p & lt; 0,05 y
## p & lt; 0,001 frente a MTA1shRNA-Ctrl; + P & lt; 0,05 y p ++. & Lt; 0,001, de compuestos entre EV y grupos MTA1shRNA
Pocos preclínica CaP modelos de xenoinjertos el progreso de la metástasis, por lo que es difícil estudiar el significado funcional de MTA1 en la metástasis. Nuestro estudio anterior con células LNCaP-Luc no mostró metástasis cuando se inyecta de forma ortotópica en ratones (datos no publicados). Debido al fenotipo más agresivo de las células Du145, hemos considerado la posibilidad de metástasis espontánea en xenoinjertos ortotópico Du145. Al comienzo de la semana 7, se han detectado señales BL distintas de la fuente primaria (próstata) en el grupo EV-Ctrl simulado (Fig. 4A y 6A).
se detectaron ex vivo
imágenes BL de la metástasis en la necropsia en el hígado, los riñones y pulmón /corazón, y la histología fue confirmado por un patólogo certificado (JRL) (Fig. 6B). La mayor incidencia de metástasis se observó en el grupo de EV (100%), mientras que el grupo MTA1shRNA mostró sólo 50 a 75% y con alto grado de heterogeneidad (Fig. 6C). Macrometástasis extensas en todos los órganos observados en EV-Ctrl fueron inhibidos por el resveratrol y PTER. tumores MTA1-desmontables desarrollaron metástasis más pequeñas, y en un menor número de órganos. En particular, los tumores tratados con compuestos MTA1shRNA o bien no desarrollaron ninguna metástasis del riñón o ha tenido pequeñas lesiones en un riñón (Fig. 6D). La inhibición de la metástasis en respuesta a agentes mta1 de metas y silenciamiento MTA1 indica la contribución MTA1 a la invasión local, la difusión y la metástasis. En conjunto, estos datos sugieren que la señalización MTA1 juega un papel esencial en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata metastásico y que la orientación vía MTA1 por los polifenoles de la dieta puede ser eficaz en el retraso de la progresión del tumor y prevenir la metástasis.
A. se muestran imágenes BL de la metástasis. Señales detectadas después de la eliminación de la próstata consistieron de señales metastásicos y no específicos. La eliminación de la piel y los músculos eliminado no especificidad. B.
Arriba, ex vivo
imágenes de los órganos metastásicos.
Inferior, España Validación de las lesiones metastásicas (T) en los riñones (K), hígado (Li) y pulmón /corazón (L /H) por H & amp; E tinción. C, el análisis cuantitativo del total de las señales Luc metastásicos en total Flux (fotones /s /cm2 /sr). círculos abiertos representan valores atípicos. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001 son comparaciones por parejas vs. EV-Ctrl. D, el análisis cuantitativo de la metástasis de órganos específicos calculado por señales de luciferasa como Total Flux (fotones /s /cm
2 /sr). Se muestran los histogramas con código de color de las señales para cada grupo. PTER fue más eficaz en la inhibición de la metástasis en todos los órganos en comparación con Res en EV-grupo.