Extracto
Helicobacter pylori
, una bacteria Gram-negativa, bacteria microaerofılico encuentra en el estómago, se supone que se asocia con la carcinogénesis, la invasión y la metástasis en las enfermedades digestivas. Asociado a la citotoxina gen A (CagA) es una proteína oncogénica de
H. pylori
que está codificada por una isla de patogenicidad Cag relacionada con el desarrollo de cáncer gástrico. La transición epitelio-mesenquimal (EMT) es el principal evento biológico en la invasión o la metástasis de las células epiteliales.
H. pylori
puede promover la EMT en líneas celulares de cáncer gástrico humano, pero los mecanismos específicos son todavía oscuros. Hemos explorado el mecanismo molecular subyacente de la EMT inducida por
H. pylori CagA
en el cáncer gástrico. En nuestro artículo, que hemos detectado muestras de cáncer gástrico y las muestras no cancerosas adyacentes mediante técnicas de inmunohistoquímica y encontramos una mayor expresión de la TWIST1 proteína reguladora relacionada con la EMT y la vimentina mesenquimales marcador en tejidos de cáncer, mientras que el factor de la muerte celular programada 4 (PDCD4) y el epitelio marcador de la expresión de E-cadherina se redujo en muestras de cáncer. Estos cambios se asociaron con el grado de malignidad del tejido. Además, los niveles de PDCD4 y TWIST1 estaban relacionados. En células de cáncer gástrico cocultured con el plásmido de expresión CagA, CagA activa TWIST1 y la expresión de vimentina, y la expresión de E-cadherina inhibida mediante la regulación negativa PDCD4. CagA también promovió la movilidad de las células de cáncer gástrico mediante la regulación de PDCD4. Por lo tanto,
H. pylori CagA
EMT inducida en células de cáncer gástrico, lo que revela una nueva vía de señalización de la EMT en líneas celulares de cáncer gástrico
Visto:. Yu H, J Zeng, Liang X, W Wang, Zhou Y, Sun Y, et al. (2014)
Helicobacter pylori
Promueve la transición epitelio-mesénquima en el cáncer gástrico mediante la regulación negativa de la proteína programada muerte celular 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10.1371 /journal.pone.0105306
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de febrero de 2014; Aceptado: 21 de julio de 2014; Publicado: 21 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (sin 973 Programa 2012CB911202.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nn: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 y 81170514), el Programa de Desarrollo de Tecnología de Shandong (Ciencias Médicas y sin . 2013WS0209) y la Fundación Independiente Innovación de la Universidad de Shandong (n. ° 2012TS106). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Helicobacter pylori gratis (
H. pylori
) es una bacteria Gram negativa con forma helicoidal asociada con enfermedades digestivas, como la gastritis crónica, úlcera péptica, cáncer gástrico, y asociado a las mucosas linfoma de tejido linfoide.
H. pylori
ha sido clasificado como cancerígeno por la Organización Mundial de la Salud y la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer (OMS /CIIC) en 1994 [1], [2].
H. pylori
genes poseen una isla de patogenicidad asociado a la citotoxina gen A (CagA) que codifica la principal proteína CagA virulencia y un sistema de secreción tipo IV (T4SS). CagA se entrega a las células huésped por T4SS e induce la formación y progresión del cáncer [3].
H. pylori
puede desregular la proliferación celular, afectar a la vía apoptótica normales, forma de la célula influencia, abolir la actividad de unión y facilitar una transición (EMT) epitelio-mesenquimal fenotipo después de que se transloca en la célula huésped [4], [5]. El
H. pylori CagA
proteína efectora afecta a la mayor parte de estas vías.
in vivo
experimentos mostraron que la expresión transgénica de CagA podría causar múltiples tumores malignos en ratones, incluyendo la hiperplasia epitelial gástrica, leucemia mieloide y linfomas de células B, o pólipos gástricos y adenocarcinomas de estómago y el intestino delgado [6]. Sin embargo, el mecanismo molecular de
H. pylori CagA
interactuar en células huésped todavía no está claro
.
La EMT fue reconocido inicialmente como una característica de la embriogénesis, un proceso vital para la morfogénesis durante el desarrollo embrionario y el corazón. Sin embargo, también contribuye a la fibrosis del tejido, invasión tumoral y metástasis. EMT se caracteriza por varios rasgos distintivos, tales como pérdida de la adhesión celular, el aumento de la movilidad celular, la resistencia a la apoptosis, y algunas propiedades de células madre. Con EMT, marcadores epiteliales como espectáculo E-cadherina expresión disminuida y mesenquimales marcadores como la vimentina muestran una mayor expresión. Otras moléculas reguladoras como caracol, TWIST y SLUG espectáculo cambiaron la expresión [7], [8], [9]. vías oncogénicas que pueden inducir la EMT incluyen factor de crecimiento transformante β (TGF-beta), Src, Ets, Ras, Wnt /β-catenina, Notch, factor nuclear kappa B y la integrina [10], [11], [12].
la infección con el factor patógeno humano
H. pylori
se considera que provoca la EMT, la invasión o la metástasis de cáncer gástrico. Por ejemplo, la regulación positiva de metaloproteinasas de la matriz 7 por patógenos
H. pylori
depende en parte de la gastrina y puede tener una función en el desarrollo de cáncer gástrico, potencialmente a través de la EMT, por los niveles indirectamente induciendo de factor soluble de unión a heparina de crecimiento endotelial [13].
H. pylori
CagA está implicada en la invasión de células tumorales por la desregulación de c-met de señalización del receptor [14]. Además, CagA podría aumentar la activación de la vía de señalización /β-catenina Wnt mediante la interrupción de la estabilización del complejo de E-cadherina-β-catenina. Por lo tanto, CagA juega un papel vital en el desarrollo de metaplasia intestinal [15]. Además, el análisis de microarrays sugirió que el estado de fosforilación de CagA puede afectar a la expresión de genes relacionados con el EMT en células de cáncer gástrico [16]. Sin embargo, poco se sabe acerca de los mecanismos que subyacen a la EMT inducida por CagA
.
Programado proteína de muerte celular 4 (PDCD4) se localiza en el núcleo de las células proliferantes [17]. Como un importante objetivo de post-transcripcional de microARN (MIR) de miR-21, PDCD4 está relacionado con la progresión tumoral y el pronóstico de pulmón humano, colorrectal, de mama y el cáncer gástrico [18], [19]. El supresor de tumores PDCD4 se puede unir a eIF4A o eIF4G e inhibir la traducción. PDCD4 puede regular activada por mitógenos proteína quinasa 4 1 o expresión uroquinasa del receptor del activador del plasminógeno (uPAR) para inhibir la invasión y carcinoma intravasación [20], [21]. PDCD4 también podría influir en la transcripción de genes. Interactúa con el dominio de unión de ADN de TWIST1 e inhibe Y-cuadro de la proteína de unión 1 de expresión [22]. A su vez, la pérdida de expresión PDCD4 está asociada con la transformación maligna en el cáncer gástrico [23], [24]. Regulación a la baja de PDCD4 está relacionado con la diferenciación del tumor en cánceres del tracto digestivo [25]. Sin embargo, si PDCD4 está involucrado en la EMT inducida por CagA en el cáncer gástrico y el mecanismo específico todavía necesita una aclaración adicional.
A continuación, se analizó la regulación de proteínas asociadas a la EMT y la expresión PDCD4 en el tejido de cáncer gástrico y CagA activación de la expresión TWIST1 y la inhibición de la e-cadherina y la expresión PDCD4 en células de cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejido
el estudio fue aprobado por la Ética Comité de Facultad de Medicina de la Universidad de Shandong, y todas las muestras y la información se reunieron con el consentimiento informado por escrito. tejidos tumorales gástricas y sus tejidos no cancerosos emparejados se recogieron de 30 pacientes durante la cirugía en el Hospital Qilu, la Universidad de Shandong (Jinan, China) desde 2010 hasta 2012. Ninguno de los pacientes habían recibido quimioterapia adyuvante o radioterapia antes de la cirugía. El diagnóstico de cáncer gástrico se confirmó histopatológicamente por hematoxilina y eosina.
Cultivo de células y transfección
líneas celulares de cáncer gástrico humano (AGS, BGC-823 y SGC-7901) se obtuvieron de la China, Cell Repository Academia Sinica (Shanghai). Las células fueron incubadas en los medios recomendados y una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C sin antibióticos. células SGC-7901 y células BGC-823 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), y las células AGS se cultivaron en medio F12 suplementado con 10% FBS. Medios y FBS se compraron de Invitrogen (EE.UU.). Luego, las células fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos pcDNA3.1 o pcDNA3.1-CagA (un regalo del doctor Yongliang Zhu, la Universidad de Zhejiang, China) y pEGFP-C1 o pEGFP-C1-PDCD4 (construidas y proporcionadas por el Dr. Chen Youhai , Perelman Escuela de Medicina de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, EE.UU.) mediante el uso de X-treme GENE HP reactivo de transfección (Roche Diagnostics, Alemania) de acuerdo con los protocolos del fabricante.
el aislamiento de ARN, transcripción y QRT-PCR inversa
ARN total fue extraído a partir de células mediante el uso de Trizol reactivo (Invitrogen, EE.UU.). La transcripción inversa implicado el kit SuperScript III Primera Strand Synthesis (Invitrogen). La expresión de genes se detectó mediante el uso de Cuantitativa en tiempo real PCR SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, China) y la normalización implicó la 2
- △△ método ct en relación con ß-actina. Las secuencias de cebador eran para PDCD4, sentido, 5'-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 'y antisentido, 5'-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3'; E-cadherina, sentido, 5'-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 'y antisentido, 5'-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3'; CagA, sentido, 5'-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 'y antisentido, 5'-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3'; y TWIST1, sentido, 5'-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 'y antisentido, 5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3'; vimentina, sentido, 5'-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 'y antisentido, 5'-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3'; Caracol, sentido, 5'-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 'y antisentido, 5'-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3'; β-actina, sentido, 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 'y antisentido, 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'.
análisis de transferencia de Western
La proteína se extrajo a partir de muestras y se separó por SDS-PAGE , a continuación, se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore Corp., Billerica, MA, EE.UU.), que fueron bloqueados inmediatamente con 5% de leche sin grasa en TBST que contenía 1% de Tween-20 durante 1,5 h a temperatura ambiente. Después de ser lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces, las membranas se incubaron con anticuerpos contra PDCD4 (1:500; Cell Signaling Technology, EE.UU.), TWIST1 (1:2000, Novus Productos Biológicos, EE.UU.), Caracol (1:1000 , Cell Signaling Technology, EE.UU.), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-cadherina (1:1000, Cell Signaling Technology, EE.UU.), vimentina (1:1000, Cell Signaling Technology, EE.UU. ), y β-actina (1:2000, Sigma-Aldrich, EE.UU.), como un control de normalización, a 4 ° C durante la noche, y luego con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa a temperatura ambiente durante 1 h. Después de un lavado, las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Millipore Corp., Billerica, MA, EE.UU.). Western Blot se realizó 3 veces para cada muestra. La proteína se cargó a 20 a 50 g por carril.
La inmunohistoquímica
muestras de tejido incluidas en parafina se des-con parafina con xileno y se deshidrataron con una serie graduada de alcohol. la recuperación de antígeno por tratamiento térmico realizado en tampón de citrato 0,1 M. Y el bloqueo de la actividad de la peroxidasa endógena se utilizó un 3% H
2O
2. A continuación, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos contra PDCD4 (1:200), TWIST1 (1:500), vimentina (1:100) o E-cadherina (1:500), y los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante y DAB para los núcleos. Los anticuerpos para tinción inmunohistoquímica fueron los utilizados para la transferencia de western. Por último, se usó hematoxilina para la contratinción diapositivas. la diferenciación del tumor de cáncer de los tejidos se determinó en una forma ciega. El primer anticuerpo se reemplazó con solución salina tamponada con fosfato como control negativo. Las muestras fueron vistos bajo una Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokio, Japón) microscopio.
No se observaron y anotaron por 2 investigadores independientes ciego Todas las secciones teñidas, y las diapositivas se les dio un índice total de tinción (SI) puntuación según la intensidad de la tinción y el porcentaje de células tumorales positivas. intensidad de la tinción fue clasificado como 0, no tinción; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; y 3, fuerte tinción. proporción de células tumorales se puntuó como 0, las células tumorales positivas ≤20%; 1, 20% de células tumorales positivas -40%; 2, 40% de células tumorales positivas -60%; 3, 60% de células tumorales positivas -80%; y 4, ≥80% de células tumorales positivas. Mediante la evaluación de la IS, los resultados de la tinción se registrarán como 0-4, baja expresión; 4-6, una expresión moderada; y 6-12, de alta expresión. Si la interpretación de la tinción fue diferente entre los investigadores, se descartaron los datos de la sección.
Matrigel invasión de ensayo
ensayo de invasión de Matrigel implicado una cámara transwell (Costar, Nueva York, EE.UU.). células SGC-7901 se transfectaron con 2 g pCDNA3.1, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; o pcDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. Después de 48 h, 1 × 10
se trataron con tripsina y se sembraron en transwell cámaras recubiertas previamente con 20 mg Matrigel 5 células transfectadas de correos. Medio que contiene 20% de SFB en la cámara inferior servía de cebo químico, y la cámara superior se llenó con medio que contiene 10% de SFB. Las células no migradas fueron removidos con hisopos de algodón después de 24 o 48 h. Las células que migran a la parte inferior del filtro se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y se contaron en un microscopio. Finalmente, se recogieron las células restantes para la proteína y el aislamiento de ARN. Cada tratamiento se repitió 3 veces.
El análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Estudiante
t
o la prueba de chi-cuadrado se utilizó para comparar 2 grupos. Análisis de los datos involucrados SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
1.. La expresión de TWIST1, E-cadherina, vimentina y PDCD4 en el cáncer gástrico
Para investigar la asociación de la EMT y el cáncer gástrico, cosechamos 30 muestras de tejido clínicos de los pacientes con cáncer gástrico. Las biopsias se dividieron en tejido medio /bajo diferenciación, tejido de alta diferenciación y tejido no canceroso adyacente a carcinoma de hematoxilina y eosina (Fig. 1A). En inmunohistoquímica, TWIST1 y la expresión de vimentina fueron más altos en el tejido maligno de tejido no canceroso, mientras que la expresión de E-cadherina y PDCD4 era opuesta a la de TWIST1 (Fig. 1A-E). expresión TWIST1 y PDCD4 se asoció con el grado de diferenciación del tumor pero no el sexo o la edad (p = 0,021 y p = 0,013, Tabla 1). A su vez, disminuyó la expresión PDCD4 se asoció inversamente con la expresión TWIST1 cambiada durante el cáncer gástrico (p = 0,035, Tabla 2). Por lo tanto, EMT puede desempeñar un papel importante en la carcinogénesis gástrica y el desarrollo.
(A) con hematoxilina y eosina confirmó el diagnóstico preoperatorio y el grado histológico. tinción inmunohistoquímica representante de TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina y E-cadherina distinta en el tejido normal adyacente y el tejido de cáncer de alta diferenciación y diferenciación de tejido de cáncer de medio /bajo. (B-E) Cuantificación de TWIST1-, SNAIL-, PDCD4-, expresión vimentin- y E-cadherina en tejidos normales y cancerosas. El número total de muestras es 30 y cada punto representa 1 muestra. barra de soporte horizontal es la media y los bigotes son SD.
*
P Hotel & lt; 0,05 y
**
P
. & Lt; 0,01 frente al control
2. TWIST1, vimentina o la expresión de E-cadherina en líneas de células gástricas está regulada por CagA
A continuación, se exploró si CagA, como un factor de virulencia de
H. pylori
, influyó en la EMT y por lo tanto promueve la invasión y la metástasis en el cáncer gástrico. Elegimos 3 líneas celulares de cáncer gástrico humanos de los estados de diferenciación (AGS, línea de células epiteliales gástricas bien diferenciado; SGC-7901, la línea celular moderadamente diferenciado y BGC-823 línea celular pobremente diferenciado). plásmido de expresión de CagA se transfectó en diversas líneas de células gástricas. Aunque no se observaron los cambios morfológicos de las células transfectadas con CagA (datos no mostrados), la expresión de factores de transcripción y marcadores de células se vieron afectados por CagA. La expresión de mRNA y proteína de TWIST1 y vimentina se upregulated con CagA transfección (Fig. 2A-G) y la de PDCD4 y E-cadherina se downregulated (Fig. 2A-G), pero no se observaron cambios significativos en la expresión de caracol en CagA grupo de transfección. Por lo tanto,
H. pylori CagA
puede afectar a los reguladores EMT incluyendo TWIST1. Por otra parte se downregulated E-cadherina, como un importante marcador epitelial y vimentina, como un marcador mesenquimal regulada por TWIST1, también fueron influenciados por CagA y el PDCD4 gen relacionado con la EMT.
plásmido CagA de longitud completa se transfectaron en AGS, SGC-7901 y BGC-823 células durante 48 h, y las células se cosecharon para el ARNm y análisis de transferencia Western. (A-C) Análisis cuantitativo de RT-PCR del nivel de ARNm de factores relacionados con la EMT PDCD4, transcripción (TWIST1 y caracol) y marcadores de células (vimentina y E-cadherina) en 3 líneas celulares de cáncer gástrico. Todos los valores se normalizaron a mRNA beta- actina en la misma muestra. (D) Western blot de nivel de la proteína CagA, TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina y E-cadherina en el control o las células transfectadas CagA. (E-G) Western blot densitometría se cuantificó (ImageJ) y el nivel de la proteína indicada se normalizó a ß-actina. Los datos mostrados representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 frente al control
3. La expresión de TWIST1, vimentina y E-cadherina fue influenciado por PDCD4
A continuación analizaron el mecanismo molecular de la EMT regulada por
H. pylori CagA
en células de cáncer gástrico. PDCD4 suprime el crecimiento celular a través de una interacción directa con TWIST1 en el cáncer de próstata humano [22]. La inmunohistoquímica y análisis estadísticos demostraron la relevancia de PDCD4 y TWIST1 existía en el carcinoma gástrico (Fig. 1, Tabla 2). Sin embargo, los mecanismos subyacentes función PDCD4 en células de cáncer gástrico no estaban claras. Así AGS? SGC-7901 y las células BGC-823 transfectadas con un plásmido de sobreexpresión de PDCD4. PDCD4 ARNm y la expresión de proteínas se upregulated en todas las líneas celulares de plásmido transfectadas (Fig. 3A-G). Además, los niveles de ARNm y de proteína de TWIST1 y vimentina, pero no caracol, se redujeron en diversos grados, y se aumentaron los niveles de E-cadherina (Fig. 3A-G). Por lo tanto, TWIST1, vimentina y la expresión de E-cadherina pueden ser reguladas por PDCD4 en las células epiteliales gástricas.
Los plásmidos de pEGFP-C1 y pEGFP-C1-PDCD4 se transfectaron respectivamente en AGS, SGC-7901 y BGC-823 se recogieron las células durante 48 h, y luego las células para el aislamiento de ARN celular total o de la proteína. (A-C) QRT-PCR análisis del nivel de ARNm de TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina y E-cadherina en AGS, SGC-7901 y las células BGC-823. Todos los valores se normalizaron a beta-actina mRNA en la misma muestra. (D) Western blot de las proteínas diana 5 de expresión en las células control y células de sobreexpresión PDCD4. (E-G) Western blot resultados se cuantificaron (ImageJ) y el nivel de la proteína diana se normalizó a ß-actina. Los datos son la media ± SD de 3 experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 frente pEGFP-C1 con
4.. La EMT está regulada por CagA través de la inhibición PDCD4 en las células epiteliales gástricas
Sobre la base de las conclusiones anteriores, que las hipótesis de que el proceso de EMT inducida por
H. pylori CagA
se produjo mediante la regulación negativa PDCD4, cotransfected células epiteliales gástricas con plásmido CagA y el plásmido sobreexpresión PDCD4. La disminución de expresión de PDCD4 se recuperó con CagA y sobreexpresa PDCD4 transfección. A su vez, el aumento de la expresión de vimentina TWIST1 y se inhibió y la disminución de expresión de E-cadherina se reguló en el grupo de co-transfectadas. Estos cambios se produjeron tanto en el los niveles de proteína y ARNm (Fig. 4A-G). La migración de la línea celular de cáncer gástrico humano SGC-7901 transfectadas con plásmidos se determinó mediante el ensayo de invasión de Matrigel. Los resultados muestran que fue inducida por CagA plásmido. ensayo de migración celular también reveló que la sobreexpresión PDCD4 downregulated CagA inducida por la invasión y la capacidad de metástasis (Fig. 5A). Higo. 5B muestra el número de células migradas de SGC-7901 en el grupo de transfección CagA son obviamente más que el grupo control, mientras que la cantidad de células migraron en el grupo co-transfección es significativamente menor que en el grupo de transfección CagA. Los fenómenos biológicos demuestran la promoción de EMT por CagA se recuperó en parte por la expresión PDCD4 elevada. Sobre la base de las pruebas, se infiere que PDCD4 puede ser necesaria para
H. pylori CagA
mediada por la progresión del cáncer gástrico
Todos los experimentos fueron divididos en tres grupos:. 1) pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (control), 2) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4. De acuerdo con diversos grupos, los correspondientes plásmidos se transfectaron en AGS, SGC-7901 y células BGC-823. A continuación, las células se recogieron para el ARNm y análisis de transferencia Western. (A-C) QRT-PCR análisis del nivel de ARNm de TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina y E-cadherina en líneas celulares de cáncer gástrico. Todos los valores se normalizaron a mRNA beta- actina en la misma muestra. (D) Western blot de CagA, TWIST1, caracol, PDCD4, vimentina y expresión de la proteína E-cadherina en todas las células. (E-G) Western blot resultados se cuantificaron (ImageJ) y normalizado a ß-actina. Los datos mostrados representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 frente contra,
Δ
P Hotel & lt; 0,05,
ΔΔ
P
& lt; 0,01 frente a pEGFP + CagA
(A) El experimento se dividió en tres grupos:. 1) pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (control), 2) pCDNA3.1- CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4.The plásmidos correspondientes se transfectaron en células SGC-7901 de acuerdo con diversos grupos. La capacidad de invasión y metástasis de las células se analizó por ensayo de invasión de Matrigel. (B) cuantitativa del número de células migradas de SGC-7901 en tres grupos. Los datos mostrados representan la media ± SD de 3 experimentos. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a estafa,
Δ
P
. & Lt; 0,05 frente a pEGFP + CagA
Discusión
La principales conclusiones de este estudio se resumen de la siguiente manera: 1)
H. pylori CagA
es responsable de la inducción de la TWIST1 o vimentina y la inhibición de la E-cadherina en células de cáncer gástrico. 2) la transición epitelio-mesenquimal CagA es inducida depende en parte de la regulación de PDCD4. 3) TWIST1 y PDCD4 involucra en la EMT de cáncer gástrico.
El cáncer gástrico es una de varias etapas y la enfermedad progresiva. El exceso de proliferación de las células epiteliales es una parte importante de la angiogénesis tumoral inicial o temprana de crecimiento [5]. Posteriormente, la invasión de células, que se refleja inicialmente a través de la membrana basal, se considera un factor de predicción de la etapa final del cáncer; que finalmente conduce a la diseminación metastásica y la mortalidad [26]. infección patógena podría causar la tumorigénesis del cáncer y la transformación maligna de las células huésped. Como un importante factor de riesgo patogénico,
Helicobacter pylori
estaban estrechamente relacionados con la enfermedad de úlcera péptica, linfoma del tejido linfoide asociado a la mucosa del estómago, y el adenocarcinoma gástrico [20], [27], [28], [29] . CagA, una de las más principales factores de virulencia de
H. pylori
, induce aparición y el desarrollo de cáncer gástrico. La transformación maligna de las células huésped implica en red regulationary, incluyendo numerosas proteínas de la célula, el ARN no codificantes, y otras moléculas de actividad biológica. Sin embargo, los efectos del mecanismo de CagA subyacentes en la mucosa gástrica es tan compleja y poco clara.
La EMT es un proceso biológico altamente conservada en el desarrollo embrionario de órganos, lo que permite a las células epiteliales que pierden fenotipo epitelial y mesenquimal fenotipo obtienen. Esto incluye la pérdida de la polaridad celular en las células epiteliales, la pérdida de la capacidad de conectar con la membrana basal, el acceso a fenotipo mesenquimal tales como la migración más alta y la invasión, anti-apoptosis, y la capacidad de degradar la matriz extracelular [8], [30] . EMT juega un papel esencial en las enfermedades crónicas inflamatorias, enfermedades fibróticas, la progresión del tumor y el proceso de reconstrucción de tejidos, especialmente en la adquisición de la capacidad de migración y la invasión de células epiteliales malignas. La actividad anormal en el epith EMT de las células epiteliales adultas inhibidas moléculas de adhesión celular, provocó disminución de la capacidad de adhesión de células, y de ese modo activar las células tumorales a extenderse en el cuerpo, en última instancia, la promoción de la metástasis del tumor [31], [32], [33]. Por lo tanto EMT se considera el inicio de la invasión y la metástasis y es también un signo de fuerte capacidad de invasión y metástasis de las células tumorales.
H. pylori induce
transición epitelio-mesenquimal por el TNF-α inducción de la proteína [34]. El presente estudio indica CagA puede dar lugar a células epiteliales cambios morfológicos. Se ha propuesto que la expresión de CagA no sólo fue suficiente para romper las uniones apicales sino también parecerse transición epitelio mesénquima en las células de riñón canino Madin-Darby [35]. Las células epiteliales infectadas por la bacteria aparecieron varios cambios genómica, y el efecto sobre los marcadores de EMT inducida por
H. pylori
fue probablemente en una manera relacionada con la cagPAI. Los datos mostraron que la transición epitelio mesenquimal (EMT) relacionadas con los genes estaban arriba o hacia abajo reguladas por CagA positivo
H. pylori
cepas en AGS [36], [37]. Es de destacar que la red de regulación de CagA participación en la EMT de cáncer gástrico es todavía necesitan ser aclarados.
Para investigar el mecanismo específico de la EMT promovido por CagA en el cáncer gástrico, se compararon los genes de expresión de la no adyacentes tejidos tumorales y tejidos de carcinoma gástrico por inmunohistoquímica. Los resultados indicaron que la expresión /vimentina TWIST1 en tejidos de carcinoma fueron más altos que los tejidos no tumorales adyacentes, y su expresión en tejidos medio /bajo de carcinoma de diferenciación mayor que los tejidos alta diferenciación. Sin embargo, E-cadherina y PDCD4 disminuyeron en el proceso de transición epitelio-mesénquima en el cáncer gástrico. Curiosamente, existe en una correlación negativa con la expresión de TWIST1 y PDCD4. Nuestro estudio sugirió genes relacionados EMT-están asociados con el proceso de cáncer gástrico, de acuerdo con investigaciones anteriores de observar la pérdida de proteína y /o la adquisición de la expresión de proteínas mesenquimales producido en el carcinoma gástrico epitelial. Por otra parte, se correlacionaron, respectivamente, a la histología pobremente diferenciados, en estadio avanzado y los pobres resultados de los pacientes [38]. Además, PDCD4 es una molécula recién encontrado que desempeña un papel vital en muchos procesos biológicos que pueden causar la enfermedad o la aparición y el desarrollo de tumor. PDCD4 inhibe el proceso de traducción mediante la unión a factor de iniciación de la traducción eIF4A o eIF4G. Diferentes inductores de apoptosis estimulan a las células y regulan al alza la expresión de PDCD4, lo que podría incrementar la regulación sobre P21, Cdk4, anhidrasa carbónica II y JNK /c-Jun /AP-1. PDCD4 podría inhibir relacionados invasión-uroquinasa del receptor del activador de plasminógeno de expresión, la invasión o la infiltración de los vasos sanguíneos y la metástasis; Por lo tanto, disminución de la expresión de PDCD4 juega un papel importante en la aparición del tumor, el desarrollo y pronóstico [17], [33], [39], [40]. Por lo tanto, nos preguntamos si TWIST1 y PDCD4 participaron en la EMT inducida por CagA.
A continuación, se detectó EMT asociada a factores de transcripción y marcadores de expresión en líneas celulares de cáncer gástrico transfectadas-CagA. Nuestros datos muestran que
H. pylori CagA
-hasta podría regular la expresión de vimentina y TWIST1 pero no caracol, y regular por disminución de E-cadherina y PDCD4 en líneas de células gástricas (AGS, SGC-7901 y BGC-823). Los resultados no fueron afectados por el estado de diferenciación de las células transfectadas. Aunque no observamos los cambios morfológicos de las células transfectadas-CagA, la invasión y la capacidad de metástasis de células de cáncer gástrico podrían acelerarse por medio de CagA transwell ensayo de invasión celular. Esto es en parte causada por la heterogeneidad funcional de CagA en diferentes tejidos. Por lo que el efecto de la EMT inducida por
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todavía había que estudiar más a fondo. MiR-21 promueve la diferenciación de miofibroblastos inducida proceso de TGF-β por la orientación PDCD4. TGF-β induce la expresión de miR-21 en fibroblastos y miR-183 downregulated PDCD4 y se inhibe la apoptosis inducida por TGF-β en células de carcinoma hepatocelular humano [41], [42]. Mientras tanto, el TGF-β regula caracol, TWIST, o ZEB1 y afectó a la EMT y la metástasis [43]. Por otra parte, PDCD4 se encontró que estaba implicado en la transcripción también. De hecho, se sugirió el extremo COOH de TWIST1 que contiene el dominio base hélice-bucle-hélice que mediada la interacción directa con proteínas PDCD4. Por lo tanto, PDCD4 interactúa con el dominio de unión a ADN de TWIST1 e inhibe su capacidad de unión al ADN para dirigir genes en células de cáncer de próstata humano [22] .Por lo tanto, hemos probado, además, si PDCD4 podría regular TWIST1 en células de cáncer gástrico. Nuestro estudio mostró que TWIST1 se redujo reguladas por PDCD4 plásmido alta expresión por PCR en tiempo real y Western Blot, mientras que la expresión de E-cadherina era opuesta a TWIST1 en AGS, SGC-7901 y BGC-823. La expresión del ARNm de Snail se downregulated en AGS y SGC-7901, mientras que preotein expresión no se observó cambios en los mismos. Puede ser debido a la complejidad de la síntesis de proteínas. Es decir, la proteína no sólo se regula a nivel de la transcripción, sino también la traducción y gire sobre el nivel. Ocasionalmente aparece que el ARNm no es una indicación directa del nivel de proteína en las células. Por último, hemos llevado a cabo nuevas investigaciones sobre el papel de PDCD4 en la transición epitelio-mesenquimal CagA-inducida. células epiteliales gástricas fueron transfectadas con plásmido de expresión de CagA y el plásmido sobreexpresión PDCD4 simultáneamente. Restauración de expresión PDCD4 podría inhibir TWIST1 y vimentina, e inducir la E-cadherina, que regula por CagA, PDCD4 también se certificó que podrían afectar la capacidad de invasión y metástasis de las células gástricas mediante un ensayo de invasión de Matrigel. Aunque son necesarios estudios adicionales para probar esta hipótesis, llegamos a la conclusión de que, básicamente, la transición epitelio-mesenquimal CagA es inducida depende en parte de la regulación de PDCD4.
En resumen, hemos demostrado que
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inducir la expresión TWIST1 y EMT en células de cáncer gástrico mediante la regulación de PDCD4 (Fig. 6). Proporcionamos una cierta penetración en la red molecular del cáncer gástrico inducida por
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la infección, y el suministro de una base teórica para PDCD4 como un objetivo biológico para el diagnóstico o el tratamiento de cáncer. la investigación con los futuros modelos de ratón pueden conducir a una mejor comprensión del papel de PDCD4 en el
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EMT inducida de cáncer gástrico.
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