Extracto
La vía de Notch contribuye a la auto-renovación de las células y la inhibición de la diferenciación de células epiteliales del colon normales iniciadoras del tumor. La expresión desregulada de Notch1 y Jagged1 se observa en el cáncer colorrectal. Hairy /potenciador de la separación familiar (HES), los blancos más caracterizados de Notch, que participan en el desarrollo de muchos tipos de cáncer. En este estudio, hemos explorado el papel de Hes1 en el proceso tumoral en el cáncer colorrectal. El derribo de Hes1 inducida por la senescencia celular CRC y la disminución de la capacidad de invasión, mientras que la sobre expresión de Hes1 aumento de la actividad de fosforilación de STAT3 y hasta regulado el nivel de proteína MMP14. Además, exploramos la expresión de Hes1 en el cáncer colorrectal humano y encontramos una alta expresión de ARNm Hes1 se asocia con un mal pronóstico en pacientes con CCR. Estos hallazgos sugieren que Hes1 regula la capacidad de invasión a través de la vía STAT3-MMP14 en células CRC y la expresión de alto Hes1 es un predictor de mal pronóstico de CRC
Visto:. Weng M, Tsao P, Lin H, C Tung , Cambio M, Chang Y, et al. (2015) Hes1 aumenta la capacidad de invasión de las células del cáncer colorrectal a través de la STAT3-MMP14 Camino. PLoS ONE 10 (12): e0144322. doi: 10.1371 /journal.pone.0144322
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 24 Junio, 2015; Aceptado: 15 Noviembre 2015; Publicado: 9 de diciembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Weng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el hígado Prevención de Enfermedades & amp; Fundación de Investigación de tratamiento, Taiwán, a MTW. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común [1] y la resección quirúrgica es el tratamiento estándar para el CDN etapa temprana. Quimioterapias que incluyen oxaliplatino, irinotecán y flouracil se utilizan ampliamente para el tratamiento de la enfermedad avanzada [2]. Terapias contra factores de crecimiento endotelial vascular o sus receptores, tales como bevacizumab [3], aflibercept [4], y regorafenib [5], prolonga la supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal avanzado. Sin embargo, a pesar de los avances en las resecciones quirúrgicas y terapias sistémicas, incluyendo quimioterapias adyuvantes, muchos pacientes mueren de CRC, y el cáncer colorrectal es el cuarto de las muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1].
Las alteraciones genéticas y epigenéticas en coche la iniciación y la progresión de la secuencia adenoma-carcinoma en el cáncer colorrectal [6] y la activación aberrante de la señalización Notch1 es uno de la vía identificado [7, 8]. la señalización de Notch contribuye a la auto-renovación de las células iniciadoras del tumor, la expansión del reservorio progenitor intestinal, y la inhibición de la diferenciación normal de las células epiteliales del colon [9-11]. la señalización de Notch se activa a través de la unión de dos grupos de ligandos, Jagged (Jagged1, 2) y Delta-como (Dll1, 3, 4). De la expresión de Notch1 y mRNA Jagged1 y sus proteínas se observaron en los tejidos de CRC en comparación con el tejido no tumoral adyacente [12]. Por otra parte, la expresión de proteína Notch 1 se correlacionó positivamente con el estadio del tumor [12] y el grado de patología (alta expresión de Notch1 en el carcinoma pobremente diferenciado) [8, 13].
Uno de los objetivos más caracterizados de Notch es el peluda /potenciador de la división (HES) de la familia [14]. Este objetivo se muestra prometedor en la inducción de diferenciación de células tumorales intestinal [15]. La sobreexpresión de Hes1 se ha asociado con el desarrollo de páncreas [14, 16, 17], de mama [18] y de ovario [19] cánceres y sus resultados regulación a la baja en la diferenciación acelerada y disminución de la proliferación celular en varios modelos de cáncer [20, 21 ]. Hasta la fecha, ha habido pocos datos acerca de la expresión Hes1 en el cáncer colorrectal [7, 22, 23]. Dado que la expresión de Notch alta se observa en el cáncer colorrectal y se asocia con el estadio tumoral, estábamos interesados en saber si Hes1 está implicada en la tumorigénesis de adenocarcinoma de colon.
En el presente estudio, hemos explorado la expresión de Hes1 en el cáncer colorrectal humano y su expresión correlacionada con los resultados clínicos. Alta expresión de ARNm Hes1 se asocia con un mal pronóstico en pacientes con CCR. En el análisis funcional, se encontró que la supresión de la expresión Hes1 induce más senescencia celular CRC y disminuye la capacidad de invasión de las células de CRC a través de la regulación de la expresión de MMP14.
Material y Métodos
Los cultivos de células
293 humanas T células y líneas celulares de cáncer de colon: HCT116, Caco2 y SW48 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ellos se mantuvieron en DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina /estreptomicina 100 mg /ml de estreptomicina. Las células fueron cultivadas a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% en un incubador humidificado.
Reactivos
plásmido y el plásmido EF.hHES1.Ubc.GFP EF.deltaBHES1.Ubc.GFP fueron adquiridos del laboratorio de Linzhao Cheng [24] a través de Addgene Inc. (Cambridge, MA). El Flag-Hes1 se generó por digestión de EF.hHES1.Ubc.GFP con BamHI y XhoI, y de insertar el plásmido digerido en los sitios de clonación múltiple del vector pcDNA4-TAG (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stattic se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Control de siRNA y Hes1 siRNA se obtuvieron de Qiagen (Venlo, Holanda). Lipofetamine RNAiMAX (Invitrogen) se utilizó como un reactivo de transfección siRNA. El protocolo fue realizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante en una concentración final de 10 nM.
se realizaron Western Blot
Las transferencias Western como se describe anteriormente [24]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron Hes1 (Millipore, Billerica, MA), MMP14 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), STAT3, fósforo-STAT3 (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA), la Bandera y actina (Sigma-Aldrich). Las membranas se incubaron con un anticuerpo primario específico durante la noche, se lavaron, después se incubaron con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano picante, y se desarrollaron usando ECL (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).
extracción de RNA y real el tiempo de reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR)
ARN total de muestras de los pacientes se extrajo con kit de extracción de ARN (Qiagen) a partir de tejido homogeneizado con Trizol (Invitrogen). El ARN total de las líneas celulares se extrajo con un kit RNeasy Mini (Qiagen). El ARN se transcribe de forma inversa a ADN utilizando la alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Expresión de Hes1 y MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 y MMP14 ARNm se evaluó mediante el uso de energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). GAPDH mRNA se utilizó como control endógeno. La expresión de ARN se analizó mediante el método de 2 ΔΔCt. Los cebadores para la expresión de ARNm se demostraron en la Tabla S1.
Ensayo de proliferación
La viabilidad celular se determinó por el MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- diphenyltetrazoliumbromide, Sigma-Aldrich Co.] ensayo.
In vitro invasión ensayo
La actividad invasiva se midió mediante el uso de un sistema de membrana de cultivo de invasión en el que una membrana de policarbonato con poros de 8 micras (Millipore , Billerica, MA) recubiertas con Matrigel (R & amp; D Systems Inc., Minneapolis, MN) a 5 mg ml se colocó /entre los pocillos superior e inferior de una cámara de sistema de cultivo de invasión de membrana. Después de eso, 5 × 10
4 o HCT116 células SW48 se colocaron en cada pocillo superior de la cámara. Después de una incubación de 48 horas a 37 ° C, las células que habían migrado a través de la membrana revestida se retiraron de la cámara inferior con 1 mM de EDTA en PBS y se transfirieron a punto una membrana de policarbonato de 3 micras poros. células borrados se tiñeron con Giemsa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), y el número de células de cada transferencia se contaron bajo un microscopio con una ampliación de 50 aumentos. Cada experimento se realizó tres veces, y cada muestra se ensayó por triplicado.
SA-β-gal ensayo de actividad
células Caco2 se trataron con una senescencia β-galactosidasa de tinción Kit (Cell Signaling) . El protocolo fue realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 2 * 10
células Caco2 5 fueron transfectadas con siRNA y se sembraron en un pocillo de 35 mm por 24 hrs. Después, las células se lavaron con PBS, se fijaron en solución de fijación 1X durante 10 min a temperatura ambiente, y se enjuagaron dos veces con PBS. Las células fueron incubadas con solución de tinción β-galactosidasa de 10 horas a 37 ° C. -células azules teñidas fueron contados en 400 × magnificación.
CRC humano tejido
cryosections colorrectales se prepararon a partir de muestras quirúrgicas de cáncer colorrectal que se recogieron a partir de septiembre 2000 hasta junio 2003 después de obtener el consentimiento informado por escrito . Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán. Todos los tejidos estaban recién congelados o sumergidos en óptima compuesto temperatura de corte (OCT) (Ames Company, Elkhart, IN), y se mantuvieron a -80 ° C hasta su uso. La clasificación clínica de los cánceres se determina en base a la clasificación de la UICC-TNM.
El análisis estadístico
Las comparaciones de variables entre los dos grupos se realizaron mediante la prueba t de Student de dos colas con expresados como medias ± error estándar de la media (SEM). Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado. Pruebas t pareadas se utilizaron para comparar la expresión de mRNA tumoral y no tumoral. Se utilizó el método de Spearman para analizar las correlaciones entre Hes1 y MMP14. La expresión de alto y de bajo Hes1 y MMP14 se define de acuerdo con el nivel medio de expresión de cada grupo. La supervivencia se calculó utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. Los valores de p inferior a 0,05 se considera como significativa.
Resultado
El derribo de la capacidad de invasión de genes Hes1 deteriorado
Para explorar el papel de los Hes1 en células de cáncer de colon, nos Hes1 examinado los niveles de expresión en líneas celulares de cáncer de colon 6 utilizando RT-PCR cuantitativa y se encontró alta Hes1 niveles de expresión en células CaCo2 y SW48 y bajos niveles de expresión Hes1 en las células HCT116 (figura 1A). A continuación, expresó establemente HES1 o una Hes1 mutante que carece del dominio de unión al ADN, en las células de cáncer de colon HCT116 y HT29 (figura 1B). Se observó mayor capacidad de invasión en las células que sobreexpresan Hes1 comparación con las células infectadas con el plásmido de control pcDNA4. No se observó una mayor capacidad de invasión en las células HCT116 y HT29 expresar mutante Hes1, lo que sugiere que el dominio de unión a ADN es importante para la capacidad de invasión de las células del cáncer de colon (Figura 1C). A continuación agotados Hes1 en las células SW48 y Caco2 utilizando siRNA (Fig 1D), y observamos menos invasión en células transfectadas con siRNA Hes1 que aquellos con ARNsi de control (Fig 1E). A fin de determinar el papel de Hes1 en la característica de las células del cáncer de CRC, un ensayo de proliferación se realizó y no mostró ningún cambio significativo después de Hes1 agotamiento (S1 figura).
(A) la expresión de ARNm Hes1 en las líneas celulares de colon . (B) Hes1 y bandera expresión de la proteína a la sobreexpresión de Hes1 y mutante Hes1 en las células HCT116 y HT29. capacidad (C) la invasión de la célula cambia a la sobreexpresión Hes1 y mutante Hes1 en las células HCT116 y HT29. (D) Expresión de la proteína en las células Caco2 Hes1 y SW48 sobre siRNA Hes1 transfección. (E) la capacidad de invasión de la célula cambia a raíz de siRNA Hes1 transfección. (F) Imágenes representativas de la senescencia β-galactosidasa en el Caco2 y células SW48. (G) Cuantificación de células positivas senescencia β-galactosidasa en la figura 1F. (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,005).
que agotan el gen Hes1 inducida más células de CRC en la senescencia
Tiene ha informado de que Hes1 se requiere para la reversibilidad de la quiescencia celular y evita la senescencia prematura en los fibroblastos quiescentes [25]. Hemos derribado Hes1 en las células SW48 y Caco2 y observó un número significativamente mayor expresión de beta-galactosidasa en Hes1 derribado las células, lo que sugiere más senescencia de las células Hes1depleted (Figura 1F y 1G).
Derribo del gen Hes1 disminuye la invasión a través de la regulación de MMP14
Como varias metaloproteinasas de la matriz (MMPs) median la invasión de células del cáncer [26], se estudió la expresión de un panel de MMPs en células de cáncer de colon en Hes1 caída. Hemos observado que sólo el nivel de expresión MMP14 disminuyó en Hes1 caída en el nivel de ARNm en células Caco2 (Figura 2A). Luego encontramos knock-down Hes1 ventaja a MMP14 disminuir el nivel de proteína en las células SW48 (Figura 2B). Por el contrario, más de expresión de Hes1 condujo a un aumento de la expresión de MMP14 mRNA (Fig 2C). Hemos expresado ectópica de un gen mutante HES1, que lleva un truncamiento en su dominio de la función, y no se observó el aumento de MMP14 en los HCT116 y HT29 células (Figura 2C).
(A) Una serie de MMP la expresión de ARNm en siRNA Hes1 transfección en células Caco2. proteína disminución (B) MMP14 sobre siRNA Hes1 transfección en células SW48 (C) la expresión del ARNm MMP14 sobre Hes1 y mutante sobreexpresión Hes1 en las células HCT116 y HT29. (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01) guía empresas
Hes1 expresión de MMP14 regulada depende de la vía STAT3
Se informó que Hes1 activa transductores de señal y activadores de la la transcripción 3 (STAT3) vía [27, 28], y que controla la expresión STAT3 MMP1 en células de cáncer de colon [29, 30]. por lo tanto, se evaluó si la actividad STAT3 desempeña un papel en la regulación de MMP14 de HES1 en células de cáncer de colon. Hes1 agotamiento por caída reducción de la expresión de proteínas MMP14 siARN en las células Caco2 y SW48. Hes1 agotamiento resultó en una disminución de la fosforilación de STAT3 y ningún cambio de STAT3 total en el Caco2 y células SW48 (Fig 3A y 3B). Ectópica sobreexpresan un plásmido marcado FLAG STAT3 constitutivamente activa, dio lugar a un aumento de los niveles de proteína MMP14 en células HCT116 (Figura 3C y 3D). la sobreexpresión ectópica de Hes1 aumento de la expresión MMP14, así como phosphyorylation STAT3 en las células HCT116. Además, la fosforilación de STAT3 y expresión de proteínas MMP14 se redujo cuando las células se trataron con stattic, un inhibidor de la activación de STAT3 (Fig 3E y 3F). Nuestros hallazgos sugieren que HES1 regular la expresión a través MMP14 hasta la regulación de la actividad STAT3 en células de cáncer de colon.
Hes1 y expresión MMP14 no están relacionados con el estadio del tumor
Como expresión de Notch1 se asocia con tumor etapa, se evaluó la expresión de Hes1 CRC en los tejidos humanos. Se analizaron 74 emparejados adenocarcinoma de colon humano y sus tejidos adyacentes no tumorales de colon de la cohorte de pacientes del Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán (Tabla 1). Se encontró que el nivel de expresión de Hes1 (figura 4A) o ARNm MMP14 (figura 4B) no estaba relacionada con el estadio del tumor.
(A) Hes1 ARNm (
p = 0,06
por Una forma ANOVA) y (B) la expresión de ARNm MMP14 (
p = 0,60
por ANOVA de una vía) no fue correlacionado con el estadio del tumor.
alta expresión de Hes1 en el CCR es asociada con una menor supervivencia
además, investigó si Hes1 y expresiones MMP14 se correlaciona con la supervivencia del paciente. Hes1 expresión de ARNm y la expresión de ARNm MMP14 se correlacionaron positivamente en el tejido tumoral (correlación = 0,238 coefficiency, p = 0,035). Hes1 alta expresión en los tumores se correlacionó con los tiempos de supervivencia más cortos (figura 5A). Alta MMP14 también se correlaciona con una menor supervivencia (Figura 5B).
Los pacientes fueron divididos en grupos de baja y alta Hes1 /MMP14 basado en la mediana de expresión ERH /MMP14 y su supervivencia estaba planeando usar el análisis de Kaplan-Meier ( repunte indica eventos de censura). (A y B) de pacientes con CRC alta expresión Hes1 y MMP14 se asocia con una baja supervivencia. (C y D) En el subgrupo de pacientes con estadio I-III CRC, alta Hes1 MMP14 y expresión se asocia significativamente con la supervivencia de los pobres. (E y F) En el subgrupo de pacientes con CCR en estadio IV, Hes1 y expresión MMP14 no está asociado con la supervivencia.
Se estratificó adicionalmente estos pacientes en función de sus enfermedades metastásicas. Para los pacientes con enfermedades temprano o localmente avanzado, alta expresión Hes1 o alto MMP14 se asoció con una supervivencia significativamente más corta. Sin embargo, Hes1 y MMP14 niveles de expresión no se relacionaron con la supervivencia para los pacientes con enfermedades metastásicas (figura 5C-5F). Como MMP juega un papel en la invasión del cáncer y la metástasis, puede ser menos pronóstico de los pacientes con tumores que ya se habían hecho metástasis en el diagnóstico
De acuerdo con el multivariante de regresión de Cox análisis, Hes1 (HR, 2,41;. IC del 95% , 1,07 a la 5.43) y MMP14 (HR, 2,36; IC del 95%, 1,02 a la 5,46) se mantuvo asociado positivamente con las muertes por cáncer colorrectal. La metástasis también se asoció significativamente (HR, 10,05; IC del 95%, 4,11 a la 24.60) con las muertes por cáncer colorrectal (Tabla 2). En cuanto a la interacción entre Hes1 y la metástasis, los pacientes presentan alta Hes1 todavía tenía un mayor riesgo de muerte por cáncer colorrectal.
Discusión
La homeostasis de auto-renovación, proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras están regulados por Notch, Wnt, FGF y las vías de señalización de Hedgehog [31-33]. En el intestino, estas vías también están involucrados en la formación de vellosidades y el desarrollo de tumores de colon [9, 34, 35]. La vía WNT presenta interacciones entre reguladores con la vía de Notch [36, 37]. ratones APC
Min (neoplasia intestinal múltiple), en la que el gen APC lleva una mutación en el codón 850 de truncamiento y la vía Wnt es dysregulated, pueden desarrollar cientos de intestino delgado y los pólipos de colon [38]. activación de Notch es esencial para la formación de adenoma de colon en APC
ratones Min [10]. La inhibición de la Hes1 en APC
ratones Min ha disminución de la proliferación de células tumorales y ha dado lugar a la diferenciación de células tumorales en las células epiteliales intestinales [15].
Hes1 juega un papel importante en la carcinogénesis CRC. Se une directamente al promotor del gen HATH1 y suprime Hath1 expresión [39]. Hath1 es un supresor de tumor que inhibe la proliferación y anclaje independiente de capacidad de las células de cáncer de colon [40, 41] y promueve intestinal diferenciación celular secretora [42]. Es bien sabido que Hes1 evita la senescencia prematura en los fibroblastos quiescentes [25]. Aquí, hemos demostrado que el ozono Hes1 en células de cáncer de colon no afectó a la proliferación celular, pero el aumento de expresión de beta-galactosidasa, lo que indica que Hes1 agotamiento induce senescencia celular de cáncer de colon. El descenso de regulación de la senescencia inducida Hes1 también se ha reportado en las células hepatocelulares través de la regulación CDKN1C /p57 [43].
A continuación, se caracteriza Hes1 que promueve la invasión de células mediante el aumento de la expresión de MMP14. MMP14 es una proteasa clave en la migración celular /la invasión y la angiogénesis [44, 45]. Alta expresión de MMP14 se informó en cáncer de pulmón y glioma [46, 47]. Hes1 interactúa con STAT3 y promueve su fosforilación [28]. Por otra parte, STAT3 fueron reportados a un máximo de regular la MMP-2 y MMP-9 expresión y actividades mediante la unión directa a su promotor [48-50]. En este estudio, también se observó que STAT3 sobreexpresión aumentó la expresión de MMP14 (figura 3). Nuestros hallazgos sugieren que la regulación de MMP14 por Hes1 en las células CRC depende de la vía STAT3.
Por último, se observó que tanto la alta Hes1 y expresión MMP14 se correlacionaron con la supervivencia de los pobres. resultado similar se encontró en el subgrupo de pacientes con temprano o localmente avanzado CRC, pero no en pacientes de que el tumor ha hecho metástasis. En el estudio de Veenendaal, se observó una mayor expresión Hes1 en los cánceres primarios de colon, pero perdió su expresión en metástasis distante y regional [23]. Este hallazgo sugiere la actividad de Notch reducida en los tumores colorrectales secundarios y puede explicar por qué el nivel de expresión Hes1 no está asociado con la supervivencia cuando el tumor ha metastasied en nuestro estudio. Por el contrario, Reedijk et al. ya se ha informado que la alta Hes1 no está relacionado con la supervivencia de los pacientes con CCR mediante el análisis de datos de microarrays 130 del Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos Colón Registro Familiar del Cáncer. La expresión alta se definió como el cuartil superior de las puntuaciones Allred [7]. A pesar del resultado de conflictos Reedijk con nuestro hallazgo, el estadio tumoral, la expresión de alta definición y el enfoque metodológico son diferentes en estos dos estudios. El verdadero papel pronóstico de Hes1 en CRC garantiza una confirmación adicional.
En conclusión, la activación aberrante de la vía de Notch inhibe la diferenciación celular y contribuye a la carcinogénesis. Hes1 es un represor transcripcional llave y reguladores esenciales para la vía de Notch. Aquí, hemos demostrado que la sobreexpresión de Hes1 aumenta la capacidad de invasión celular a través de la vía de STAT3-MMP14. Hes1 expresión se correlaciona con la expresión de MMP14 en el CCR y es un predictor de la supervivencia del paciente. Orientación de la vía de Notch-Hes1 podría explotarse con fines terapéuticos en el cáncer de Notch activado.
Apoyo a la Información
S1 Fig. (A) La viabilidad celular tras el cambio de siRNA Hes1 transfección en las células SW48
doi:. 10.1371 /journal.pone.0144322.s001 gratis (TIF)
S1 tabla. Los cebadores para la RT-PCR
doi: 10.1371. /Journal.pone.0144322.s002 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias al profesor Cheng Linzhao de gracia proporcionando Hes1 y delta-Hes1 plásmidos mediante Addgene.