Extracto
Antecedentes
cinasa del linfoma anaplásico (ALK) positividad representa un nuevo molecular objetivo en un subconjunto de células no pequeñas de pulmón el cáncer (NSCLC). Exploramos la fluorescencia
La hibridación in situ
(FISH) e inmunohistoquímica (IHC) como métodos de diagnóstico para los pacientes positivos ALK y describir su prevalencia y los resultados en una población de pacientes con CPNM.
Métodos
Los pacientes con CPNM previamente seleccionados por el receptor del Factor de Crecimiento epidérmico (EGFR) en nuestra institución. ALK positivo pacientes fueron identificados por FISH y el valor de IHC (D5F3) fue explorado.
Resultados
noventa y nueve pacientes fueron identificados. La mediana de edad fue de 61,5 años (rango 35-83), todos eran caucásicos, el ochenta por ciento eran adenocarcinomas, el cincuenta y uno por ciento eran hombres y el treinta y ocho por ciento eran fumadores actuales. Siete (7,1%) pacientes eran ALK positivo por FISH, trece (13,1%) fueron mutante de EGFR, y 65 (65,6%) fueron negativos /de tipo natural (WT) tanto para ALK y EGFR. ALK positividad y EGFR mutaciones eran mutuamente excluyentes. pacientes ALK positivos tienden a ser más jóvenes que los pacientes EGFR mutado o wt. pacientes ALK positivos fueron predominantemente no fumadores (71,4%) y adenocarcinoma (71,4%). ALK pacientes mutantes EGFR positivos y tienen un mejor resultado que la negativa /WT. Todos los pacientes con tumores negativos ALK FISH fueron negativos para ALK IHC. Fuera de 6 pacientes positivos para FISH ALK con más tejido disponible, 5 fueron positivos para ALK IHC y 1 negativo.
pacientes positivos Conclusiones
ALK representan el 7,1% de una población de NSCLC seleccionado. ALK positivo pacientes tienen diferentes características clínicas y un mejor resultado que el EGFR WT y ALK pacientes negativos. IHC es un método prometedor para la detección de pacientes con CPNM ALK positivos
Visto:. Martínez P, Hernández-Losa J, H
a Ángeles Montero, Cedres S, Castellví J, Martínez-Marti A, et al. (2013) Fluorescencia
La hibridación in situ e inmunohistoquímica
como métodos de diagnóstico para ALK positivo de células no pequeñas cáncer de pulmón pacientes. PLoS ONE 8 (1): e52261. doi: 10.1371 /journal.pone.0052261
Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Junio, 2012; Aceptado: 31 Octubre 2012; Publicado: 24 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Martínez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
pulmón es la causa más frecuente de cáncer-. muerte relacionada con el mundo, con más de 1 millón de muertes por año. [1] A pesar de que la quimioterapia citotóxica sigue siendo el pilar del tratamiento para la mayoría de los pacientes con cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células (CPNM), [2] la identificación de lesiones genéticas específicas que impulsan la proliferación de células de cáncer ha llevado al desarrollo de nuevas terapias diana en un subconjunto de pacientes con NSCLC [3], [4]. En los últimos años, cinasa del linfoma anaplásico (ALK) reordenamiento, predominantemente con la proteína asociada a microtúbulos equinodermos como 4 genes (EML4), ha sido identificado como un evento oncogénico en un subconjunto de pacientes con NSCLC [4]. ALK translocación da como resultado la expresión constitutiva del dominio quinasa de tirosina de la proteína ALK, lo que resulta en el desarrollo de tumores y el crecimiento. La dependencia oncogénica de este evento se demuestra en base a que la actividad de ALK eliminación quinasa invierte el patrón maligno y el crecimiento [5]. Recientemente, los resultados de un ensayo de fase 1 evaluación de un inhibidor de ALK, crizotinib, en pacientes con CPNM ALK positivo demostrado resultados alentadores [6]. Los ensayos clínicos con crizotinib y otros inhibidores de ALK en esta población subconjunto de pacientes con CPNM ALK positivos están en curso.
Los informes iniciales han demostrado que los pacientes con CPNM ALK positivos tienden a ser más jóvenes, los fumadores /no predominantemente de luz con una histología de adenocarcinoma de el CPNM pacientes de la población general [7]. Estas características clinicopatológicas también son frecuentes en los pacientes con mutaciones de EGFR, pero ambos eventos genéticos parecen ser mutuamente excluyentes [8]. En los pacientes no seleccionados con CPNM la prevalencia de positividad de ALK rango del 1% al 7% [9], pero más del 30% en los pacientes seleccionados para el EGFR de tipo salvaje (WT), adenocarcinoma y sin antecedentes de fumar [7]. Su prevalencia en una población europea seleccionado de pacientes con CPNM no está aún bien conocida
.
Sin embargo, los pacientes con CPNM ALK positivos y sus características importantes del particular, se han dilucidado, pero una definición clara de la positividad de ALK sigue siendo una cuestión difícil. Los primeros informes sobre la prevalencia de los reordenamientos EML4-ALK utilizado RT-PCR para la detección de pacientes, por lo general como un análisis retrospectivo de muestras resecadas de pacientes con NSCLC [4], [9]. Sin embargo, este método es incapaz de detectar variantes o reordenamientos desconocidos EML4-ALK con otros socios diferentes de EML4. Nuevas plataformas se han desarrollado para suministrar que la deficiencia de [10]. Para seleccionar a los pacientes en los ensayos FISH crizotinib, con una sonda de ruptura, aparte de ALK es el método de diagnóstico. pruebas de FISH permite la detección de translocaciones de ALK, no importa la pareja o la variante, pero la definición de ALK positividad por FISH y su uso restringido a las piezas de resección o la biopsia son limitaciones [11]. Inmunoshistochemistry (IHC) también ha sido explorado. Los análisis de IHC usando anticuerpos contra la proteína ALK utilizado en lesiones malignas hematológicas han mostrado poca sensibilidad en pacientes con NSCLC, probablemente debido a los niveles de proteína inferior ALK expresadas en comparación con lesiones malignas hematológicas con reordenamientos ALK. El nuevo D5F3 anticuerpo monoclonal alta sensibilidad parece tener suficiente precisión en la identificación de pacientes para ser reproducido en forma en todo el mundo [12], ya que todos los pacientes en los que no había suficiente tejido en la fase 1 crizotinib ensayo seleccionado previamente por FISH-positivo también fueron positivos por IHC , mientras que sólo dos de las tres partes de los pacientes fueron positivos por RT-PCR. muestras negativas pescado y los tejidos pulmonares normales no expresan la proteína ALK por IHC [6]. Recientemente, otros métodos de diagnóstico se han explorado también [13], [14].
El objetivo de este estudio es explorar la prevalencia de positividad de ALK en una cohorte de pacientes con CPNM Europea seleccionados por los peces, para definir mejor sus características y los resultados clínicos y, para explorar IHC como prueba método de diagnóstico para ALK en pacientes con CPNM.
pacientes y métodos
los pacientes
Todo incluido pacientes habían recibido tratamiento o la consulta del Servicio de Oncología médica del hospital Universitario Vall d'Hebron. Se seleccionaron todos los pacientes con CPNM previamente seleccionados por el estado de mutación de EGFR entre mayo de 2006 y enero de 2010. análisis de mutaciones de EGFR se habían realizado sobre la base de un caso médico por indicación caso, teniendo en cuenta el sexo, la histología y la historia de fumar, pero sin parámetros fijos. Los registros médicos fueron revisados y basal clinicopathological características, tratamientos y los resultados registrados. Si el tejido estaba disponible para los análisis de ALK, los pacientes se probaron por FISH y posteriormente por IHC. El Comité de Ética Institucional revisó y aprobó este estudio.
Las muestras tumorales
portaobjetos sin teñir, desde incluidas en parafina (FFPE) muestras tumorales fijados en formalina de biopsias o bloques de celdas reconstruidas a partir de la citología o, en a falta de esto, se analiza a continuación, las diapositivas de la citología.
Extracción de ADN análisis de mutaciones de EGFR.
las muestras obtenidas por FNA y FFPE se digirieron durante 48 horas con proteinasa K y 180 l de tampón de digestión de G2 a 37
aC, a continuación, se extrajo el ADN con el kit de ADN de tejidos EZ1 con una estación de trabajo Biorobot EZ1 eluir las muestras en 50 l siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ADN extraído se determinaron por espectrofotometría y luego el ADN se almacenaron a -20 ° C.
Amplificación por PCR y secuenciación directa.
PCR se realizó en 30 volúmenes mu l utilizando 50 ng de ADN molde, 0,75 Gold ADN U de AmpliTaq polimerasa (Perkin-Elmer; Roche Molecular Systems; Branchburg, NJ), 3 l de tampón de PCR (Perkin-Elmer), 0,8 mmol /L desoxinucleótido trifosfato (Promega), 0,5 mol /L de cada cebador, y las concentraciones de MgCl2, los exones 19 y 21 se amplificaron por PCR. Se obtuvieron secuencias de los cebadores como se describe en los datos adicionales. programa de PCR se realizó por 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 45 s, cebador recocido a 58 ° C durante 30 s, y elongación a 72 ° C durante 30 s. Una extensión final procedió a 72 ° C durante 10 min. Las bandas de los productos de PCR se visualizaron por electroforesis en gel con BrEt. Cada muestra se secuenció por duplicado tanto en avance como direcciones usando el kit BigDye Terminator 3.1 reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias se compararon con la secuencia humana archivado-GenBank para
EGFR gratis (número de acceso AY588246) por Chromas Pro Software.
determinación de EGFR mediante PCR en tiempo real.
Todo casos fueron analizados utilizando el Kit TheraScreen EGFR PCR (Qiagen. Manchester Ltd) siguiendo las instrucciones del fabricante para detectar mutaciones en tiempo real, las reacciones de PCR. PCR en tiempo real se realizó utilizando un ABI7500Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA) bajo las siguientes condiciones:. Los datos fueron analizados utilizando el software 7500 (versión 2)
fluorescencia
La hibridación in situ
(FISH)
Nos preparó 4 micras secciones histológicas embebidas en parafina para el análisis FISH. El Vysis LSI
ALK commercial Francia color dual, Separar Reordenamiento de la sonda (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) fue utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los resultados se analizaron en un microscopio de fluorescencia (Nikon 501) usando el software de sistema de imagen de fluorescencia Isis. Un mínimo de 100 núcleos se anotó. Un caso positivo FISH se define por tener células tumorales más del 15% que muestran señales verdes y rojos separados o señales rojo solo células identificadas con reordenado
ALK
. FISH se realizó y se analizó por dos patólogos diferentes.
Immnunohistochemistry
Brevemente 3 secciones micras de espesor se cortaron de las muestras de tejido y se colocaron en portaobjetos de vidrio de poli-L-lisina. Todas las diapositivas se tiñeron con anticuerpos ALK (clon D5F3 señalización Cell Technology) diluidos 1:50 utilizando un kit de detección Ventana Ultraview DAB en un procesador de Benchmark XT Ventana (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). La recuperación del antígeno era un estándar proceso automatizado en el Benchmark XT Ventana a 37 ° C durante 16 minutos. Todas las diapositivas fueron analizadas por dos patólogos diferentes y se clasifican. Las muestras se considerarán como IHC-positivo si una tinción específica de un tumor de cualquier intensidad en ≥10% de las células tumorales estaban presentes.
análisis estadísticos
A menos que se especifique lo contrario, para los análisis de marcadores clínicos y moleculares de las muestras de los pacientes, se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar la correlación entre las variables categóricas, y se utilizó la prueba t de Student para evaluar la asociación entre las distribuciones del resultado del tratamiento. Todos los valores p reportados son de dos caras menos que se especifique lo contrario, y nos consideran como una prueba estadísticamente significativo si p = 0.05. Para comparar la correlación entre FISH y la IHC para detectar pacientes ALK positivo se utilizó un método kappa.
Resultados
Entre mayo de 2006 y enero de 2010 un total de 99 pacientes previamente pruebas de mutaciones de EGFR con tejido ALK disponible para los análisis fueron identificados por FISH. La disponibilidad de tejido para su análisis FISH y la IHC se evaluó como positiva por la existencia de un bloque FFPE o diapositivas de la citología en los archivos de nuestra institución. Después de los procedimientos de estudio, no había suficiente tejido para llevar a cabo un ensayo de FISH válido en 14 pacientes. Para el análisis IHC este número fue mayor, en 19 pacientes.
Las características basales de los pacientes se resumen en la tabla 1 (tabla 1). Los pacientes eran predominantemente adenocarcinomas (80%) y nunca /ex fumadores (62%) con una distribución equitativa de género.
De las muestras de 99 tumores examinados, 13 pacientes (13,1%) albergaban una mutación de EGFR activación , 7 pacientes (7,1%) fueron positivos para ALK y 65 pacientes (65,7%) eran EGFR WT y ALK negativo, y en 14 pacientes (14,1%) no había suficiente tejido para realizar una prueba FISH válida para ALK (tabla 2). mutación de EGFR y la positividad de ALK eran mutuamente excluyentes. pacientes positivos
ALK tienden a ser más jóvenes (56 años) que mutante EGFR (63 años) o negativo EGFR WT /ALK (62 años) de los pacientes, pero estas diferencias no fueron estadísticamente diferentes. No había ninguna prevalencia de género clara para los pacientes positivos para ALK (4 hembras y 3 machos). Cinco de ellos nunca fueron fumadores (71%) y 2 eran fumadores en el momento del diagnóstico. Todos los pacientes ALK positivos tenían una histología no escamosa, 5 de los 7 pacientes fueron adenocarcinoma y los otros 2 pacientes tenían un no especificado (NOS) NSCLC. Cuatro de los 5 pacientes con adenocarcinoma de ALK positivo mostró un patrón sólido y el crecimiento acinar y, además, cuatro de los cinco mostraron un patrón con células en anillo de firmados estaba presente. (Figura 1)
análisis FISH utilizando una sonda Separar. Las células positivas muestran una fusión de las señales rojas y verdes correspondientes al cromosoma intacto, y las señales divididas indicativos de la transposición de ALK (flechas). Inmunohistoquímica para ALK en un NSCLC usando anticuerpo D5F3. espectáculo de las células tumorales la expresión citoplasmática de la proteína mientras que el resto de las células son completamente negativas (20 ×).
EGFR mutantes pacientes tenían también una histología predominantemente adenocarcinoma (100%) y eran predominantemente no fumadores (71 %), pero con una clara predisposición de género para las mujeres (77%).
el /grupo ALK negativo EGFR en peso y el grupo desconocido EGFR en peso /ALK no difieren en sus características basales y eran comparables a las características de toda la cohorte de 99 pacientes.
también exploró la mejor respuesta clínica con un TKI del EGFR o régimen de quimioterapia basada en platino en pacientes metastásicos o de recaída de acuerdo con EGFR y ALK estado. Como era de esperar, los pacientes ALK positivos tratados con erlotinib tuvieron ninguna respuesta objetiva; sin embargo, sólo dos pacientes ALK positivos han sido tratados con EGFR TKI de. No hay respuestas para EGFR en peso /ALK pacientes negativos se observaron fueron tratados con un TKI del EGFR. Por el contrario, un 75% de las respuestas se observaron en el grupo de pacientes EGFR mutantes. Las respuestas a la primera línea de quimioterapia basada en platino fueron del 29% para los pacientes ALK positivos, el 60% de los pacientes EGFR mutantes y el 40% para EGFR WT /ALK negativo. (Tabla 3) guía empresas
En el momento del análisis, la mediana de seguimiento de los 65 pacientes con avanzado /recaída CPNM fue de 9,5 meses en los pacientes que siguen vivos; en ese momento, 57 pacientes habían muerto. Se analizó la supervivencia global (SG) de los pacientes de acuerdo con ALK y el genotipo del EGFR. La mediana de SG para los pacientes negativos EGFR en peso /ALK fueron 4,5 meses, para los pacientes EGFR mutantes fueron de 15,7 meses (p = 0,018) y no se había alcanzado en los pacientes positivos ALK (p = 0,103). En el grupo ALK positivo había cuatro pacientes (de un total de siete) que había recibido crizotinib como parte de su tratamiento en algún momento en el curso de su enfermedad. (Figura 2) guía empresas
Por último, se realizó una IHC ALK con el anticuerpo D5F8 en los 80 pacientes en los que no había material todavía disponible después de EGFR y análisis FISH (Figura 3). Todos los 73 pacientes negativos para ALK por FISH también fueron negativos para la IHC. De los seis pacientes FISH ALK positivos probados para IHC, 5 eran positivos y uno negativo. Este resultado en un valor predictivo positivo para IHC con anticuerpos D5F8 del 100% y un buen acuerdo global (kappa 0,783, rango de 0,642-0,924) (Tabla 4).
Discusión
activación ALK se ha identificado como una alteración oncogénica conductor en un subgrupo de pacientes de NSCLC. Reordenamientos de gen ALK es un ejemplo de la dependencia oncogénico. ALK positivo pacientes muestran predominantemente una histología de adenocarcinoma, sin antecedentes de tabaquismo luz /y una menor edad al momento del diagnóstico. Developement de nuevos fármacos dirigidos a esta alteración condujo a respuestas tumorales impresionantes en este subgrupo de pacientes. Recientemente, el crizotinib, una pequeña molécula que inhibe la actividad de la quinasa tirosina de ALK, ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con CPNM avanzado ALK positivo después de impresionar resultados en los primeros ensayos [6]. Al mismo tiempo, una prueba de diagnóstico molecular FISH ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos para la detección de pacientes ALK positivos. Tomados en conjunto, estos dos hechos, demuestran lo importante es en la era de las terapias diana para identificar y validar un biomarcador para la selección de los pacientes más adecuados para lograr un beneficio, incluso desde la más temprana de desarrollo.
En nuestro informe, seleccionamos un subconjunto de pacientes sobre la base de que previamente la determinación de la condición de EGFR nos permitió identificar una población de pacientes más adecuados para albergar una alteración ALK. Este criterio, utilizando un marcador biológico, nos permitieron identificar una población enriquecida de pacientes con NSCLC en los que se considera clínicamente relevante características moleculares. En esta cohorte, la prevalencia de mutaciones de EGFR fueron 13,1%, lo que está cerca de la frecuencia reportada por el Grupo de Cáncer Española de pulmón en una población similar [15], lo que indica indirectamente que nuestra población seleccionada representa el importe global de los pacientes lo están seleccionando para la detección de EGFR en la práctica habitual. ALK pacientes positivas por FISH representa en nuestro estudio un 7,1% del total, lo cual es concordante con las publicaciones de otros investigadores en esta población de pacientes [7] - [9], [16] y siendo el primer informe prevalencia ALK en una cohorte pacientes con CPNM europeos de predominantemente metastásico.
Como se informó anteriormente, los pacientes ALK positivos fueron predominantemente adenocarcinomas, con un bajo historial previo de fumar y tienden a ser más jóvenes que la cantidad de pacientes con CPNM. Por lo tanto, los pacientes ALK positivos no mostraron respuestas a EGFR TKI del sino un beneficio similar de la quimioterapia que los pacientes negativos ALK. Aunque los informes anteriores han sugieren que pemetrexed puede ser el agente quimioterapéutico preferido para pacientes ALK positivos [17], [18], debido al pequeño tamaño de nuestra población ALK positiva que no eran capaces de llevar a cabo este análisis. Curiosamente, dos de los pacientes positivos para ALK en nuestra serie eran fumadores actuales en el momento del diagnóstico.
Los datos recientes parece indicar que, en ausencia de agentes de ALK ALK específica positividad es un factor pronóstico negativo para los pacientes con NSCLC [19 ]. Sin embargo, en pacientes con avanzado, NSCLC ALK-positivo, la terapia crizotinib se asocia con una mejor supervivencia en comparación con la de los controles crizotinib-ingenuo [20]. En nuestro estudio, se analizó la supervivencia en función del estado molecular, independientemente de haber sido tratados con crizotinib u otro inhibidor de ALK y encontramos que los pacientes con CPNM ALK positivos tienden a vivir más que los pacientes negativos EGFR en peso /ALK. No se realizó un análisis de supervivencia para los pacientes ALK positivos de ajuste para el tratamiento crizotinib, debido al pequeño tamaño de la cohorte. Sin embargo, cuatro de los pacientes ALK positivos habían sido tratados con crizotinib en el momento del análisis de supervivencia. Tomados en conjunto, estos resultados indican que en la era de las terapias diana ALK, ALK positivo pacientes con CPNM tienen un mejor resultado que los pacientes negativos EGFR WT /ALK. Sin embargo, estos resultados deben ser analizados con cautela, una de las sesgo de selección en este estudio es que los pacientes con un estado funcional peor que los pacientes con cáncer de pulmón en general se habían incluido. La razón principal de que el sesgo es que los pacientes con un mejor rendimiento habían sido reclutados en los ensayos clínicos y EGFR no fue ensayado en nuestro laboratorio local. Otro sesgo es posible que en pacientes con bajo rendimiento o mayores comorbilidades del estado mutacional del EGFR se analizó ya que estos pacientes no eran adecuados para recibir otro tipo de tratamiento que los EGFR TKI de si una mutación de EGFR se demostró. Ambos sesgos pueden enriquecen nuestra cohorte con pacientes con resultados más pobres y, por lo tanto, sólo 15 de los pacientes EGFR en peso /ALK negativo pacientes fueron tratados con una quimioterapia basada platinun.
Una cuestión importante para los médicos es identificar aquellos pacientes adecuados para el tratamiento con crizotinib. análisis FISH es el método estándar. Sin embargo, IHC ha sido explorado por diferentes grupos en un intento de identificar un método más adecuado en todo el mundo para la detección y el diagnóstico de los pacientes positivos para ALK. Primeros anticuerpos, previamente utilizadas para el diagnóstico de lesiones malignas precursores hematopoyéticos, mostró no tienen suficiente sensibilidad para su aplicación en pacientes positivos para ALK [12]. Desde entonces, se han explorado dos estrategias de alta sensibilidad. Uno de ellos es para mejorar la sensibilidad de la prueba y para desarrollar una puntuación de IHC para la selección de pacientes para el análisis FISH [21], [22]. Otro enfoque, es a anticuerpos de sensibilidad y especificidad altas ALK desarrollados que condujo identificar a los pacientes ALK positivos por sí misma [23], [24]. En nuestro estudio, hemos utilizado un nuevo D5F3 anticuerpo monoclonal de alta sensibilidad y especificidad en una cohorte de pacientes seleccionados con NSCLC en paralelo con FISH para identificar pacientes ALK positivos. Se encontró que todos los pacientes ALK positivos por IHC también fueron positivas por FISH. Sin embargo, un paciente positivo FISH resultado negativo por IHC. Ese paciente de falsos negativos no tenía más tejido disponible para repetir el análisis, sino que había sido previamente reclutados en un ensayo crizotinib con otro análisis de FISH positivo en el laboratorio central del estudio. Tomados en conjunto, podríamos llegar a la conclusión de que un análisis IHC positiva con el anticuerpo monoclonal D5F3 debería ser suficiente para seleccionar un paciente para recibir tratamiento con un inhibidor de ALK que se ha encontrado ningún paciente positivo para IHC ser negativo por FISH. Cuando un médico debe tener en cuenta para llevar a cabo un análisis de FISH en un paciente con un resultado negativo por IHC, o viceversa, es una cuestión que debe abordarse en el futuro. Aún más, ¿cuál es el significado de una positividad de la prueba FISH en menos del 15% de las células o de lo que debe hacerse con aquellos pacientes que no tienen resultados concordantes con IHC y FISH son algunas de las cuestiones relativas a normalizarse en el futuro.
Para concluir, en nuestro estudio hemos demostrado que la prevalencia de pacientes positivos para ALK es de 7,1% en una población seleccionada caucásico de NSCLC mediante FISH. En la era de la ALK tratamientos dirigidos ALK positivo pacientes tienen diferentes características clínicas y un mejor pronóstico que el EGFR WT y ALK pacientes negativos. IHC con anticuerpo monoclonal contra D5F3 ALK es un método exacto para la detección de pacientes con CPNM ALK positivos.