Extracto
La pérdida de metilación de todo el genoma es una característica común de cáncer, y el grado de hipometilación se ha correlacionado con la inestabilidad genómica. metilación global de elementos repetitivos posiblemente surgió como un mecanismo de defensa contra los elementos de ADN parasitarias, incluyendo retrotransposones y patógenos virales. Teniendo en cuenta las alteraciones de la metilación global en tanto la infección viral y cáncer, se examinaron los niveles de metilación de genoma completo en la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC), un cáncer asociado causalmente con el virus del papiloma humano (VPH). Que analizaron los niveles mundial hypomethylation en 26 muestras HNSCC, en comparación con el tejido adyacente normal correspondiente, utilizando los ensayos de metilación basados en pirosecuenciación para las repeticiones LINE. Además, se examinaron las líneas celulares derivadas de una variedad de tumores sólidos para la línea y el SINE (
Alu
) repeticiones. El grado de la línea y
Alu
hipometilación varió entre las diferentes líneas celulares de cáncer. Sólo había correlación moderada entre la línea y
Alu
los niveles de metilación, con el rango de variación en los niveles de metilación siendo mayor para los elementos LINE. hipometilación línea fue más pronunciada en el VPH-negativos que en los tumores VPH positivos. Por otra parte, la inestabilidad genómica, según lo medido por análisis de todo el genoma de pérdida de heterocigosidad (LOH) polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), fue mayor en las muestras con HNSCC hipometilación LINEA más pronunciada. hipometilación global fue variable en los CECC. Su correlación tanto con el VPH y el grado de LOH como un sustituto de la inestabilidad genómica puede reflejar vías oncogénicas de VPH en alternativas positivas frente a tumores VPH-negativas
Visto:. Richards KL, Zhang B, Baggerly KA, S Colella , Lang JC, Schuller DE, et al. (2009) Genome-Wide Hipometilación en cáncer de cabeza y cuello es más pronunciada en los tumores VPH-negativo y se asocia con la inestabilidad genómica. PLoS ONE 4 (3): e4941. doi: 10.1371 /journal.pone.0004941
Editor: Sebastian D. Fugmann, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Septiembre, 2008; Aceptado: 13 Febrero 2009; Publicado: 18 Marzo 2009
Derechos de Autor © 2009 Richards et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Kleberg, del estado de Texas Fondos de investigación de tabaco, una beca de investigación institucional por parte de los Fondos del Acuerdo de Tabaco de Texas (Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center), y el Departamento de Defensa W81XWH-05-2-0027 a RK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metilación del ADN es una modificación epigenética del ADN que se produce a través de la acción de las metiltransferasas de ADN en los dinucleótidos CpG. regiones metiladas de ADN se asocian con remodelación de la cromatina, que ocurre generalmente en las zonas de más de la cromatina condensada y disminución de la actividad transcripcional [1], [2]. El renovado interés en este proceso surgió después se reconoció que dos tipos de patrones de metilación aberrante están presentes en las células del cáncer [1], [3]. El primero es específico del gen hiper-metilación, donde las islas CpG en las regiones promotoras de genes adquieren aumentaron metilación, generalmente conduce a la expresión reducida del gen aguas abajo. El segundo es de todo el genoma hipo-metilación, un gran porcentaje de los cuales se produce en elementos de ADN repetitivo. En la malignidad, la metilación mundial a menudo se reduce de manera aberrante, mientras que la metilación de genes específicos a menudo se aumenta de manera aberrante. Aunque los efectos de la hipermetilación de genes específicos (
por ejemplo
, la reducción de expresión de un gen que es importante para el control del crecimiento) se aprecian fácilmente, los efectos de la reducción de la metilación global son más vago [1], [3].
se ha planteado la hipótesis de que la metilación del ADN se desarrolló inicialmente como un mecanismo de defensa contra los patógenos virales de ADN y otros como una forma de silenciar secuencias de ADN extranjeras [4] - [6]. Esto es consistente con la observación de que LINE y SINE (
Alu
) elementos, originando de elementos de transposición, son muy metilado en las células normales. La metilación del genoma viral de VPH en la integración en el genoma huésped se ha informado, y cambios en la metilación de ADN de VPH se han asociado con la tumorigénesis [7], [8].
metilación global también es clínicamente relevante, como demostrada por asociaciones entre el resultado clínico y los niveles de metilación globales en un número de tipos de cáncer [9] - [11]. Desde un punto de vista mecanicista, la metilación global parece estar relacionado con la progresión del cáncer, ya que la pérdida de metilación global de tiende a ser más pronunciada a medida que progresan las lesiones precancerosas [12], [13]. Además, en células de cáncer de colon, pérdida de metilación LINEA está inversamente correlacionado con la inestabilidad de microsatélites y se correlaciona directamente con la inestabilidad cromosómica [14], [15].
La hipótesis de que los niveles de metilación globales en el cáncer, representados por los niveles de la línea y SINE (
Alu
) metilación, puede estar correlacionado con la infección viral. Nosotros, por lo tanto, examinamos la metilación de líneas en relación a la condición de VPH en el cáncer de cabeza y cuello. En contraste con los cánceres cervicales, que son casi todos asociados con la infección por VPH, HNSCC está mediada por virus sólo en un subconjunto de los casos (25-30%) [16]. Para determinar el impacto de la infección viral en los niveles de metilación global en HNSCC, hemos desarrollado ensayos de metilación basado en Pyrosequencing de elementos de ADN repetitivo y se comparó con el VPH-positivo cánceres VPH-negativas. publicaciones anteriores han sugerido que la metilación LINE es variable en HNSCC, pero no encontró una asociación entre el estado y los niveles de metilación de ADN del VPH LÍNEA [17], [18]. Aquí nos muestran que la hipometilación global es variable en CECC y se correlaciona tanto con el VPH y la inestabilidad genómica.
Resultados
LINEA /SINE (
Alu
) ensayos son precisas y reproducibles , pero muestran una correlación moderada entre solamente LINE-1 y
Alu
los niveles de metilación
para ensayar los niveles de metilación globales, hemos adaptado nuestro análisis de metilación (PMA) ensayo basado en pirosecuenciación [19] para evaluar la metilación LINE repetitivo y SINE (
Alu
) elementos, los ensayos de metilación similar a todo el genoma informó anteriormente [20]. Para validar los ensayos, se realizó una serie de pruebas: (1) experimentos con cantidades conocidas de ADN metilado /no metilada de mezcla; (2) estudios de metilación en una variedad de líneas celulares de cáncer de comparar LINE para metilación SINE y para estudiar la metilación global a través de una amplia gama de tumores malignos; y (3) la metilación de muestras de diferentes edades y géneros para eliminar estos factores como posibles factores de confusión de las mediciones de metilación global.
incrementos paso a paso de ADN metilado se prepararon mezclando el ADN no metilado universalmente (U2M.L) con universalmente metilado DNA (UM.L) en diversas proporciones. Las muestras fueron mezcladas a continuación, bisulfito tratados y sometidos a ensayos de nuestra
Alu gratis (SINE) PMA LINE-1 (LINE) y. El análisis de regresión lineal mostró que LINE-1 y
Alu
los niveles de metilación fueron muy estrechamente asociados con los niveles predichos por fracción de entrada de ADN metilado (
r = 0,995
,
p CD - valor & lt; 0,0005 para LINE-1, y
r = 0,980
,
p-valor
& lt; 0,0005 para
Alu
; Figura S1). Cabe señalar que incluso cuando el ADN de entrada estaba completamente metilado, el porcentaje máximo global de metilación tal como se mide por el ensayo de PMA es un poco más de 50%, no 100%. Esto se debe a elementos repetitivos individuales han divergido en secuencia con el tiempo; y dinucleótidos CpG, si mutado a dinucleótidos TPG, son indistinguibles de los CpG no metilados después del tratamiento con bisulfito. Este nivel de ruido de fondo se tiene en cuenta mediante la normalización de cada resultado para el control universalmente metilado (
es decir
, informar de la ciento referencia metilado, o PMR).
cuatro grupos de muestras de ADN normal ( a partir de leucocitos de sangre periférica) se generaron para evaluar la influencia de la edad y el sexo sobre LINE-1 y
Alu
los niveles de metilación. Cada grupo (mujeres ≤ 40 años de edad, los machos ≤ 40 años de edad, hembras & gt; 40 años de edad, machos & gt; 40 años de edad) que contiene el ADN de al menos cinco individuos. No hubo diferencias por sexo o edad que dependen entre las piscinas en LINE-1 o
Alu
los niveles de metilación (datos no mostrados).
Cada LINE-1 y
Alu
ensayo de metilación se ensayó en un panel de líneas de células 23 cancerosas. Diferentes sitios CpG se compararon mediante tres distintos ensayos de línea de 1 y tres
Alu
ensayos distintos, cada uno procedente de diferentes regiones de los
Alu
secuencias consenso LINE-1 y, respectivamente (Tabla 1). Como control, también a prueba siete líneas de células linfoblásticas normales, que mostraron niveles normales de metilación (todo el & gt; 80% en nuestros ensayos LINE-1). Por el contrario, como se espera de los informes anteriores [12] - [14], [21], muchas de las líneas de células tumorales mostraron hipometilación global, que fue más pronunciado en los ensayos de LINE-1 (Figura 1). Para verificar la consistencia entre la línea y los niveles de metilación SINE (representado por nuestra línea-1 y
Alu
ensayos, respectivamente), se comparó el grado de correlación entre los resultados de los tres ensayos de LINE-1, entre los resultados de la tres
Alu
ensayos, y entre los distintos ensayos
Alu y LINE-1. El análisis de regresión lineal mostró que la línea 1-resultados de los ensayos individuales fueron altamente correlacionados entre sí, por ejemplo,
r = 0,93 para
la correlación entre los resultados del ensayo L1-2 y L1-3 (Figura S2A). El mismo alto grado de correlación estaba presente entre los resultados de la
Alu
ensayos, por ejemplo,
r
= 0,82 para la correlación entre el Alu-3 los resultados del ensayo (Figura S2B) Alu-1 y . Sin embargo, LINE-1 los resultados del ensayo fueron sólo moderadamente correlacionados con
Alu
los resultados del ensayo, por ejemplo
r = 0,33
comparando L1-1 y Alu-1; Figura S2C). Un nivel similar de correlación moderada entre los ensayos
Alu y LINE-1 se había informado anteriormente en los tumores neuroendocrinos [22].
A.
Alu
metilación usando el ensayo de Alu-3. B. LINE-1 metilación usando el ensayo de L1-3. Los resultados se presentan como la PMR (ciento referencia metilado) normalizado al ADN de referencia universalmente metilado. Universalmente no metilado (U2M), metilados (UM) controles universalmente, y normal ADN de control de los PBL se muestran también.
LINE-1 hipometilación de muestras de pacientes HNSCC
Matching lo normal, tumor primario, y cuando sea posible, las metástasis de ganglios linfáticos de muestras cabeza y el cuello del paciente (Tabla S1) se sometieron a pruebas de nuestros ensayos PMA LINE-1 (Figura 2). Debido a la mayor rango dinámico del ensayo LINE-1 y cantidades de muestra limitados, se realizaron solamente LINE-1 ensayos para el resto de este estudio. En general, HNSCC tumores primarios y los ganglios linfáticos metastásicos fueron hypomethylated en comparación con sus emparejan tejidos adyacentes normales. Con el ensayo LINE1-1, el equipo de radio tumor primario media fue de 65,5%, mientras que el equipo de radio normal, media fue de 90,0% (
p-valor
= 6,7 × 10
-8 utilizando un emparejado
t
-test). Sin embargo, hubo un poco de variabilidad en los tumores primarios, que van desde el 31,2% (hipometilación grave) a 90,8% (normal). El PMR medio en la metástasis de los ganglios linfáticos (73,8%; rango 31,8% -93,8%) también fue muy variable, incluso con respecto al tumor primario correspondiente, a veces inferior y, a veces más alta que la PMR del tumor primario con el que está asociado.
en combinación del tumor y las muestras normales y, cuando estén disponibles, metástasis ganglionares se analizaron para LINE-1 metilación. PMR valores se representan mediante el PMR muestra normal como el valor de x y el tumor primario (círculos) o metástasis PMR (triángulo) como el valor de y. Las líneas horizontales representan los valores universalmente PMR de metilación (UM) y controles no metilados (U2M), los linfocitos normales (verde) y durante cuatro líneas celulares CECC (amarillo). Los diagramas de caja de la derecha muestran la media y la distribución de los tumores primarios y metástasis en el subconjunto de muestras cuando emparejado metástasis y tumores primarios estaban disponibles.
tumores VPH positivos retener más LINE-1 metilación de VPH tumores negativos al
Debido a que no había tanta variabilidad en el tumor CECC PMR, la hipótesis de que el nivel de hipometilación global puede variar en diferentes subgrupos de CECC. Para explorar la relación entre la pérdida de LINE-1 hipermetilación y la condición de VPH, se comparó la media LINE-1 metilación nivel de los tres grupos que diferían por su condición de VPH. El primer grupo (n = 8) fue negativo HPV (- /-); el segundo grupo (n = 8) contenido de ADN de VPH, sin embargo, eran transcripcionalmente silenciosa con respecto a la oncogén viral E6, lo que indica la falta de expresión de esta oncoproteína (+/-). El tercer grupo de tumores (n = 8) fue positivo para ADN del VPH y la expresión de E6 (+ /+). La media del nivel de metilación de los tres grupos de tumores es estadísticamente diferente, con un
p-valor = 0,011
para la tendencia (Figura 3).
Los diagramas de caja de los niveles de metilación (PMR) de HNSCC tumores primarios (justo en cada par) y el tejido normal adyacente (a la izquierda de cada par) se muestran de acuerdo con la condición de VPH. + /+, El VPH-positivo y expresar ARNm viral E6; +/-, El VPH-positivo, pero transcripcionalmente silenciosa; y - /-, el VPH negativo
También compararon los niveles de metilación global en los tejidos adyacentes normales coincidentes de los mismos tres grupos.. En contraste con los resultados para los tumores primarios, no hubo diferencias en los niveles de metilación global en los tejidos normales a juego y por lo tanto no hay correlación con la condición de VPH (Figura 3). Sobre la base de una asociación previamente reportada entre LINE-1 metilación y el estadio TNM [18], buscamos una asociación de este tipo en nuestro conjunto de la muestra, pero no encontró ninguno (
p-valor = 0,31
).
Niveles de LINE-1 hipometilación y LOH en tumores HNSCC se correlacionan
líneas celulares de cáncer de colon con hipometilación LINEA más pronunciada se informó anteriormente para tener un mayor grado de LOH [14], [15]. Para examinar si esta correlación fue verdad en nuestras muestras de pacientes CECC, se realizó un análisis de LOH mundial a partir de datos de 10K SNPChip. Los genotipos se compararon entre el tejido adyacente normal y muestras de tumor emparejados; loci informativos eran los que eran heterocigóticos en el tejido normal. La Figura 4 muestra un gráfico del porcentaje de loci informativo para cada tumor primario con LOH en comparación con el grado de LINE-1 metilación en la misma muestra. Nos ajustamos a una tendencia lineal a los datos, que mostró una correlación de Pearson de -0,494, con un
p-valor = 0,017
. Como comprobación de la robustez, también se calculó la correlación de Spearman (basado en la clasificación), que también fue significativa. El coeficiente de correlación de Spearman para esta relación fue -0,428 (
p-valor = 0,042
), estableciendo que de hecho LOH se correlacionó significativamente con el grado de hipometilación LINE.
metilación LINE-1 se representa como PMR, y LOH es la fracción de 10K SNP loci que muestran LOH en relación con todos los loci informativo. coeficiente de correlación de Pearson es -0,494 (
p-valor = 0,01
) para la correlación entre los dos valores.
Discusión
Hemos desarrollado varias líneas (o de línea 1) y el SINE (
Alu
) ensayos de metilación con cebadores de PCR en regiones conservadas de estos elementos repetitivos. Estos ensayos utilizan múltiples sitios CpG (3-6) para determinar los niveles de metilación y permitir la amplificación simultánea de muchos elementos de línea individuales y SINE todo el genoma humano como puntos de referencia genómicas representativas para el análisis global de la metilación. Como era de esperar, los resultados de LINE-1 individuo ensayos se correlacionan muy bien con los resultados de otros ensayos 1 LINE-, a pesar de la medición de la metilación en diferentes regiones de la secuencia LINE-1. Lo mismo es cierto para
Alu
ensayos, con alta correlación entre los resultados de tres ensayos diferentes. Sin embargo, cuando LINE-1 y
Alu
los niveles de metilación se compararon entre sí, la correlación fue más modesto, sólo alrededor del 40%. Las razones de esta correlación inferior pueden estar relacionados simplemente a diferencias en la sensibilidad del ensayo: LINE-1 ensayos varió de 0-50% metilado en los estudios de mezcla, mientras que
Alu
ensayos tenían menos amplitud, que van desde 0 hasta 30% metilado, posiblemente secundaria a un mayor ruido de fondo entre individuos debido a la variación de la secuencia entre individuo
Alu
elementos (Figura S1). Otra posibilidad es que hay una diferencia funcional o biológica entre los dos tipos de ADN repetitivo en su mantenimiento metilación. repite LINE son más frecuentes en las regiones pobres en genes del genoma, mientras que
Alu
elementos son más comunes en las regiones ricas en genes [23]. Desde la metilación global se puede medir por una variedad de métodos, estas diferencias inter-ensayo se deben considerar cuando se comparan los resultados utilizando diferentes tipos de ensayos y estudios.
Nuestros resultados muestran una disminución en la metilación global de en líneas celulares de una variedad de tipos de células de cáncer (Figura 1), similar a los resultados publicados anteriormente para una variedad de tipos de tumores [12] - [14], [21]. Vale la pena señalar que las líneas celulares de cáncer en general tenían menores niveles de metilación de las muestras HNSCC, quizás reflejando un mayor tiempo para acumular la pérdida de metilación o la naturaleza clonal de estas líneas celulares. Sin embargo, algunas líneas celulares (por ejemplo, RKO) tenían poca o ninguna pérdida de metilación. Esto implica, como para que los tumores HNSCC primaria, que no hay variabilidad en la biología subyacente. La investigación adicional en las causas de esta variabilidad podría proporcionar información importante acerca de las vías de y el papel de las alteraciones epigenéticas en la progresión del cáncer
.
Nuestros resultados demuestran una correlación positiva entre el mantenimiento de la metilación línea normal y VPH-positividad. Además, el mantenimiento de la metilación línea normal también se correlacionó con menos LOH o inestabilidad del genoma. Si LOH se considera como un sustituto de la inestabilidad cromosómica (CIN), este resultado es consistente con el resultado anteriormente informado de que los cánceres de colon también tienen una asociación entre CIN y la pérdida de LÍNEA hipermetilación [14], [15]. Por lo tanto, es tentador especular que la metilación LINE y CIN son causalmente relacionada, tal vez a través de la metilación asociación conocida con el empaquetado más densamente cromatina, lo que puede traducirse en mayor fidelidad durante la segregación de cromosomas y por lo tanto menos LOH. Sin embargo, nuestros resultados y los resultados se informó anteriormente son puramente correlativos; estudios funcionales serán necesarios para que se pueda establecer esta relación causal.
El nuevo hallazgo en nuestros resultados es que el VPH-positividad se correlaciona con el mantenimiento de la metilación LINE. Un estudio epidemiológico reciente identificación de factores de riesgo de LINE-1 hipometilación informó que no hubo asociación significativa entre el nivel de ADN del VPH y LINE-1 los niveles de metilación [17]. Sin embargo, hubo diferencias metodológicas entre que y nuestro estudio, incluyendo el uso de ambos ADN E6 de VPH y el estado de RNA en la asignación de estado del VPH, el uso de un ensayo de metilación diferentes, y el uso de nivel de metilación como una variable continua en el análisis. Aunque Furniss y sus colegas no mostraron una asociación directa, demostraron que los resultados variaron por LINE-1 los niveles de metilación de los tumores VPH-negativas [23]. Se necesitan más estudios para aclarar la relación entre el VPH y la metilación LINE. Una hipótesis posible es que, en un intento de silenciar el virus del papiloma humano, las células infectadas inducen una respuesta metilación más exuberante, remontándose a los orígenes de la metilación como un mecanismo de defensa viral. Aunque esto de nuevo requerirá estudios mecanísticos o tal vez estudios en otros tipos de cánceres mediadas por virus (por ejemplo, hepatitis B y C HCC mediada en comparación con la no viralmente HCC inducido o EBV + linfoma vs. linfoma EBV) para establecer la causalidad, nuestros resultados a lo largo de con los de Furniss y colegas [17], sin duda dar más apoyo a la hipótesis de que CECC VPH-positivo y negativo-VPH CECC representan entidades biológicas distintas que surgen a través de vías oncogénicas separadas.
En resumen, hemos desarrollado varias nuevas LINEA (LINE-1) y el SINE (
Alu
) ensayos de metilación del genoma completo, que hemos aplicado para determinar el estado de metilación de una variedad de líneas celulares de cáncer y muestras de tumor primario HNSCC. Nos encontramos con que las líneas celulares de cáncer en general han disminuido los niveles de metilación de elementos repetitivos. Aún más variabilidad en LINE-1 metilación se observó dentro de las muestras HNSCC. Es importante destacar que hemos descubierto una correlación entre el VPH-negatividad, el aumento de la inestabilidad del genoma, y la pérdida de metilación del genoma. Esta correlación refuerza el concepto de que los cánceres VPH positivos y negativos de VPH son biológicamente diferentes y proporciona una base para futuros estudios para definir aún más el mecanismo biológico que subyace a estos hallazgos.
Materiales y Métodos
Paciente muestras y líneas celulares
tumor Emparejado /muestras de tejidos adyacentes normales, y cuando esté disponible cervicales metástasis de ganglios linfáticos de pacientes con CECC se recogieron en la Universidad Estatal de Ohio como se ha descrito previamente (Tabla S1) [24]. ADN genómico fue extraído de la fase de ADN-proteína de los tejidos extraídas de TRIzol de acuerdo con las sugerencias del fabricante (Invitrogen). Se extrajo el ADN utilizando el kit de PureGene (Gentra) en sedimentos de células a partir de cuatro líneas celulares HNSCC (SCC-4, SCC-9, SCC-15 y SCC-25), líneas celulares de cáncer de pulmón de cinco (H1395, H520, H2170, SK- MES-1 y SW-900), la línea de uno de los senos de células de cáncer (MCF7), una línea celular de cáncer de cuello uterino (HeLa), líneas celulares de cáncer tres cerebrales (U251, SK-N-AS y M059K), línea celular de cáncer uno uterino ( AN3CA), una línea celular de sarcoma (HT1080), la línea celular de cáncer de riñón (HEK293), y líneas celulares de cáncer de seis de colon (LoVo, SW48, HCT-15, DLD-1, COLO 320DM y RKO) de acuerdo con las sugerencias del fabricante. Además, se utilizó el ADN de la línea celular linfoblastoide BL1395 como control a juego para H1395. Todas las líneas celulares están disponibles de ATCC (Manassas, VA).
piscinas normales y controles metilados
Cuatro piscinas de muestras normales se generaron en representación de diferentes sexos y edades. Las muestras de ADN fueron obtenidas de donantes de sangre anónimas y fueron un regalo del Dr. Michael J. Siciliano (Universidad de Texas M. D. Anderson Cancer Center). Tres de las piscinas (mujeres mayores de 40 años de edad, las mujeres de 40 años o menos, y los hombres de 40 años o menos) eran cada uno compuesto de cinco personas por grupo. El cuarto de la piscina (varones mayores de 40 años de edad) se componen de seis individuos. Preparado comercialmente universalmente ADN metilado y no metilado universalmente (UM.C y U2M.C, respectivamente) se obtuvieron de Chemicon. UM.L (ADN metilado universalmente) se generó como un control positivo mediante el tratamiento de ADN normal periférica de leucocitos en la sangre (PBL) con el CpG metilasa
M.Sss
I (New England Biolabs) [25]. U2M.L (ADN no metilado universalmente) se generó como un control negativo mediante la amplificación de la misma ADN utilizado para generar el ADN de control positivo utilizando el kit GenomiPhi (GE Healthcare) como se describe por el fabricante.
Los cebadores y condiciones de PCR
cebadores de PCR y cebadores de secuenciación fueron diseñados utilizando el software de diseño de ensayo PSQ (Biotage) [26]. Tres ensayos para SINE (
Alu
) elementos y tres ensayos para la línea 1-elementos fueron diseñados (Tabla 1). PCR se realizó en una reacción de 25 l que contiene Qiagen Taq HotStart mezcla maestra (Qiagen) usando 1 l de bisulfito de ADN tratado (10 ng de equivalentes de ADN). Para reducir el coste por ensayo, el protocolo de amplificación fue desarrollado utilizando un enfoque de cebador universal biotinilado. concentraciones de cebador finales fueron 10 nM del cebador de cola con el cebador universal, 100 nM del cebador sin cola, y 90 nM del cebador biotinilado universal en cada reacción [19]. La amplificación se llevó a cabo en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 5 min, seguido de 45 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 45 ° C (SINE) o 53 ° C (líneas) durante 1 min, 72 ° C durante 45 segundos, y una extensión final a 72 ° C durante 7 minutos [19].
PyroMethA (PMA) y la metilación evaluación
conversión de bisulfito de ADN genómico se realizó como se informó anteriormente [ ,,,0],19]. Brevemente, 0,5 a 1,0 g de ADN genómico se trató usando el kit de ADN CpGenome modificación (Chemicon), incluyendo la sulfonación de ADN, la desaminación, la desalinización, desulfonación y la recuperación. ADN tratado con bisulfito se almacenó a -20 ° C hasta su uso. PMA es una tecnología basada en la pirosecuenciación que puede analizar CpG de metilación en sitios múltiples en un solo ensayo. Después de una amplificación por PCR utilizando ADN tratado con bisulfito, pirosecuenciación se llevó a cabo utilizando el sistema de PSQ96HS (Biotage) de acuerdo con el protocolo del fabricante que incluye una sola proteína de unión de hebra (reactivos PyroGold). Los resultados se analizaron usando el software de Q-CpG (Biotage), que calcula el porcentaje de metilación (
mC /(
mC + C)) para cada sitio CpG, lo que permite comparaciones cuantitativas. El índice de metilación (llamado MI) se calcula como el valor medio de
MC /(
mC + C) para todos los sitios CpG examinados en el ensayo. En general, hubo muy buen acuerdo en los niveles de metilación entre los sitios CpG en el mismo ensayo. UM.L tratado con bisulfito se utilizó como referencia universalmente metilado. datos de PMA para estos ensayos de metilación globales se presentan como un porcentaje de referencia metilado valor (PMR), la normalización de la MI de cada muestra a la MI de la referencia universalmente metilado (UM.L) DNA [25].
comercial ADN metilado universalmente (UM.C) y el ADN no metilado universalmente (U2M.C) (Chemicon) también se utilizaron para llevar a cabo este análisis, y el resultado fue lineal (
r = 0,983
,
p
-valor & lt; 0,0005 para LINE-1; Figura S1). Sin embargo, comercialmente disponible U2M no era completamente no metilado, ya que una muestra pura tuvo U2M.C metilación residual de aproximadamente 26%, diferente de U2M.L preparado en nuestro laboratorio, que tenía el 0% de metilación esperada. Por lo tanto, hemos utilizado nuestro propio ADN no metilado universalmente (U2M.L) para todos los estudios posteriores.
Detección de ADN de VPH 16 E6 y E6 ARN para determinar el estado del VPH
Cuantitativo en tiempo real PCR se realizó para detectar ya sea ADN o E6 de HPV16 E6 cDNA utilizando el mismo cebador /sonda conjunto para ambos. Los cebadores fueron diseñados utilizando el serotipo HPV16, que representa el ≥90% de todos los casos HNSCC VPH positivas [27]. Para controlar la posible contaminación de ADN genómico en el ADNc, se compararon amplificaciones de cDNA a partir de RNA tratado con DNasa que habían sido preparados utilizando el primer sistema de superíndice Strand Synthesis (Invitrogen) con y sin la adición de transcriptasa inversa. PCR se realizó en un 25 reacción l que contiene iQ mezcla maestra Supermix (Biorad) utilizando 25 ng de ADN genómico o 5 l de cDNA. Cebador directo (5'-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3 ') y cebador inverso (5'-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT-3') se añadieron a una concentración final de 200 nM cada uno. El Texas Red sonda marcada en tiempo real (5'-TR-AGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT-3 ') se añadió a una concentración final de 320 nM. La fluoresceína se añadió a cada reacción a una concentración final de 10 pM. Cada reacción se realizó por triplicado. La amplificación se llevó a cabo en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 8,5 min, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 1 min y se analizó en tiempo real utilizando una máquina y software iCycler PCR ( Biorad). Las muestras que no amplifican se puntuaron como negativos, y todas las muestras se agruparon en 3 categorías basadas en estos resultados: (+ /+), positivos tanto para el ADN y el ARN E6 E6; (+/-), Positivo para ADN E6, pero transcripcionalmente silenciosa; y (- /-), negativo para el ADN y el ARN E6. estado del VPH se determinó con éxito en 24 de las muestras HNSCC 26, y éstos se utilizaron para los análisis posteriores que utilizan la condición de VPH.
se extrajeron
10K SNPChip LOH análisis
HNSCC ADN genómicos utilizando el estándar TriZol- protocolo de extracción; que se purificaron adicionalmente por precipitación con etanol antes y después de la amplificación de todo el genoma utilizando el kit GenomiPhi (GE Healthcare). El Affymetrix 10K
Xba
131 matriz contiene aproximadamente 11.500 SNPs con una separación media de 210 kb. protocolos de Affymetrix estándar fueron seguidos durante estos ensayos. Brevemente, sobre 250 ng de ADN genómico fue digerido con
Xba
I y luego se ligó a adaptadores. A continuación, la amplificación de un cebador se lleva a cabo utilizando el sistema de PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems). Después de la purificación con Qiagen MinElute 96 UF, un total de alrededor de 20 g de producto de PCR fue fragmentado y marcado con biotina. La hibridación se realizó en el Affymetrix GeneChip hibridación horno a 48 ° C durante 16-18 horas. Las matrices fueron lavados y teñidos con la Affymetrix GeneChip Fludics la estación 400 y fueron escaneados con la Affymetrix GeneArray 2500 escáner. El procesamiento de imágenes se realizó con el software GCOS 1.0 y genotipos fueron generados con GType 2.0 o posterior del software.
El análisis estadístico
Con el fin de evaluar la asociación entre los niveles de metilación y los niveles de carga viral del VPH (una también se utilizó un análisis similar para evaluar la asociación entre los niveles de metilación y el estadio TNM), se procedió de la siguiente manera. Todos los valores de metilación de la muestra se convierten en filas. Un valor que falta para el ensayo LINE1-1, para P2 muestra, fue imputado utilizando el valor P2 de la LINE1-3 (correlación entre la LINE1-1 y ensayos LINE1-3 es 0,98). Estos rangos fueron entonces escalados (ponderado) por la carga de HPV, con pesos de 0, 1 y 2 para - /-, +/-, y + /+, respectivamente. La asociación definitiva "puntuación" era la suma de estas filas ponderados. La distribución nula para este puntaje se evaluó mediante simulaciones en las que se asignaron a grupos repetidamente muestras de VPH al azar. Nos encontramos con un millón de simulaciones, y definimos nuestro
p-valor
como dos veces la proporción de casos en los que la puntuación de simulación fue tan grande o más grande que la que de hecho vimos. Nuestro
p-valor simulado
era 0.011.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Las características clínicas y moleculares de las muestras
HNSCC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004941.s001 gratis (DOC 0,12 MB)
Figura S1.
rango dinámico de PMA LINE-1 y Alu ensayos. Se realizaron experimentos de mezcla para determinar los niveles de metilación de PMA medidos con proporciones variables de ADN metilado y no metilado universalmente. UM.C y U2M.C representan los ADN disponibles comercialmente (Chemicon) universalmente metilado y unmethylated, respectivamente. UM.L y U2M.L se generaron a partir del mismo ADN mediante la modificación in vitro en nuestro laboratorio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004941.s002 gratis (0.10 MB TIF)
figura S2.
Análisis de correlación de ensayos mundial de metilación SINE y LINE.