Extracto
Antecedentes
El cáncer de páncreas es una de las causas directas de muerte relacionada con el cáncer. Alto nivel de quimiorresistencia es uno de los principales obstáculos de tratamiento clínico. En los últimos años, las células madre de cáncer han sido ampliamente identificado e indicado como el origen de la quimiorresistencia en múltiples tipos de tumores sólidos. evidencias crecientes sugieren que las células madre de cáncer residen en las células capaces de formar holoclones continuamente. Sin embargo, en el cáncer de páncreas, las células formadoras de holoclone-no se han caracterizado todavía. Por lo tanto, el objetivo de nuestro estudio era indentify las células madre del cáncer de páncreas que forma holoclone-y desarrollar un sistema de formación de colonias in vitro continua, lo que facilitará en gran medida el estudio de las células madre del cáncer de páncreas.
Metodología /Principales hallazgos
línea celular de cáncer de páncreas BxPC3 fue sometido a anticuerpos monoclonales cultivo para generar colonias. Sobre la base de las morfologías, las colonias se clasificaron y analizaron por sus capacidades de formación de colonias secundaria, la supervivencia a largo plazo i
n vitro
, la formación de tumores
in vivo
, y la resistencia a los medicamentos. Citometría de flujo y cuantitativa de RT-PCR se llevaron a cabo para detectar el nivel de expresión de las células madre de cáncer marcadores de superficie celular, genes reguladores y microRNAs asociados en distintos tipos de colonias. Se identificaron tres tipos de colonias con distintas morfologías y denominado como hologramas, mero- y paraclones, en el que sólo holoclones generaron colonias de descendientes de los tres tipos de pases adicionales. En comparación con mero- y paraclones, holoclones poseían mayores capacidades de supervivencia a largo plazo, la iniciación del tumor, y la quimio-resistencia. La expresión preferencial de las células madre del cáncer de marcadores relacionados (CXCR4), genes reguladores (Bmi1, GLI1, y gli2) y microRNAs (miR-214, miR-21, miR-221, miR-222 y miR-155) en holoclones eran también resaltado.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados indican que las células iniciadoras de tumores pancreáticos con alto nivel de la quimio-resistencia fueron enriquecidos en holoclones derivadas de la línea celular BxPC3. Generación de holoclones puede servir como un nuevo modelo para el estudio de las células madre del cáncer, y atribuir al desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer
Cita:. Tan L, Sui X, Deng H, M Ding (2011) Holoclone células formadoras Las células de cáncer de páncreas Enriquece células iniciadoras de tumores y representan un modelo Novel de Estudios de cáncer de células madre. PLoS ONE 6 (8): e23383. doi: 10.1371 /journal.pone.0023383
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 20 Marzo, 2011; Aceptado: July 15, 2011; Publicado: 3 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Tan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca del Ministerio de Educación (705.001) (http://www.moe.edu.cn/), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China para Grupos Creative Research (30421004) (http://www.nsfc.gov. cn), y 111 del Proyecto de HD. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es actualmente la cuarta causa de mortalidad relacionada con el cáncer. Menos de 5% de los pacientes sobreviven durante 5 años después del diagnóstico con el período de supervivencia media de 4 a 6 meses [1], [2]. Aunque la resección quirúrgica se considera como el método más eficaz de la terapia, su viabilidad sigue siendo baja, por el avance local y metástasis temprana [3]. Además, la quimioterapia se considera como una opción importante en la terapia clínica, pero por lo general produce efectos pobres [4], [5] .Por lo tanto, es necesario para descifrar los mecanismos subyacentes a la quimiorresistencia alto nivel de células de cáncer pancreático.
en los últimos años, las células madre de cáncer (o denominado como células iniciadoras de tumores) han sido identificados como una parte integral en los tipos múltiples de tumores sólidos [6] - [11]. células madre de cáncer no sólo dan lugar a la iniciación del tumor y el crecimiento, sino que también actúan como el origen de la metástasis del cáncer, la recaída y la resistencia contra la quimioterapia o la radioterapia [12] - [14]. Por lo tanto, seguir trabajando en la detección y eliminación de las células madre del cáncer de páncreas es todavía desea conquistar con éxito los obstáculos en la terapia clínica.
Los estudios recientes sobre las células adultas y madre del cáncer han correlacionado con propiedades de células madre de la morfología de las colonias generada a partir de células individuales [15] - [20]. De acuerdo con los criterios de tamaño de las colonias y el límite definido por trabajos pioneros en líneas celulares de queratinocitos, las colonias se clasifican y se denominan como holoclones, meroclones y paraclones [21]. Similares a las células madre en los folículos pilosos [15], oculares [16], y epidérmico [17], las células madre del cáncer de próstata [19] y el glioma [20] se demostró que residir en holoclones. Holoclones derivados de línea celular de cáncer de próstata PC3 inician la formación de tumores en ratones NOD /SCID exclusivamente y proliferaron in vitro robusta [19]. Las células en holoclones derivadas de la línea celular de glioma U251 fueron capaces de generar esferas tumorales en condiciones libres de suero y diferenciarse en linajes de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos [20]. Curiosamente, células madre genes relacionados fueron altamente expresado en holoclones derivados tanto de cáncer de próstata y de glioma líneas celulares [19], [20]. Estos indicios sugieren que la propagación de holoclones de líneas celulares de cáncer podría servir como una estrategia alternativa para el enriquecimiento de las células madre del cáncer [20]. Sin embargo, en el cáncer de páncreas, no se han identificado holoclones y su correlación con las propiedades de las células madre del cáncer no se ha determinado todavía.
En el presente estudio, se dirigió a la heterogeneidad en líneas celulares de cáncer de páncreas BxPC3 [22] y PC3 [23] basado en la morfología de las colonias derivadas de las células cancerosas individuales y demostró que las propiedades de células madre de cáncer fueron enriquecidos en holoclones exclusivamente. Por otra parte, nuestro trabajo indica la formación de células holoclone atribuyen a la quimio-resistencia, lo que indica su valor potencial para el desarrollo de fármacos quimioterapéuticos.
Resultados
cáncer de páncreas células exhiben la capacidad heterogénea para generar diversas morfologías de colonias en cultivo clonal
el primer objetivo de nuestro estudio fue determinar si existe la diversidad de morfologías clonales en la población de células de cáncer de páncreas, por lo que el cultivo se llevó a cabo monoclonal (fig. 1A) con la línea celular de cáncer de páncreas BxPC3. Esta línea celular se deriva de loci principal de adenocarcinoma de páncreas y con morfología típica epitelio. Después de plateado, una porción de las células murieron, mientras que los otros se mantenían colonias viables y formados dentro de los 3 días después de la siembra y mostró un espectro de morfologías distinguibles después de 5-7 días. Sobre la base de las diferencias en la morfología, las colonias se definen como holoclones, meroclones y paraclones (fig. 1B, C, D) [21]. Holoclones eran grupos de células homogéneas, pequeñas y apretadas con límites regulares y lisas de colonias (fig. 1B). Paraclones consistieron en células dispersas y fragmentadas más grandes con fronteras (Fig. 1D). Meroclones exhibieron morfologías intermedias (Fig. 1C). Estos mophologies se mantuvieron cuando el tamaño de las colonias se incrementó. Con ensayos paralelos realizados con la línea celular PC3, se identificaron tres tipos de colonias (Fig. S1 A, B, C) con las morfologías similares a los derivados de la línea celular BxPC3. La composición de las colonias fue similar en estas dos líneas celulares: casi la mitad de las colonias eran meroclones, mientras que holoclones y paraclones representaron aproximadamente el 20-30% de las colonias formadas (Fig 1E, Fig S1D..). Por lo tanto, estos datos indican la diversidad de morfologías clonales en la población de células de cáncer de páncreas.
(A) esquemático que representa el procedimiento de derivar de células BxPC3 cultivos clonales y ensayos funcionales. Los paneles inferiores muestran holoclones representativos (B), meroclones (C) y paraclones (D) a partir de cultivos BxPC3. Todas las fotografías se tomaron a las 2 semanas después de la siembra (Bar, 100 micras). En este punto de tiempo, cada tipo de colonias se contó (E). Los resultados de los experimentos repetidos (n = 4) se presentan como medias ± SEM en el histograma.
Los diferentes tipos de colonias poseen capacidades diferenciales para la auto-renovación y proliferación a largo plazo
Desde la diversidad morfológica clonal en las células de cáncer de páncreas se ha indicado, la capacidad de formación de colonias secundaria debe evaluarse. Para este fin, se aislaron células de los tres tipos de colonias y se volvieron a sembrar con una baja densidad (inferior a 200 células por pocillo de placa de 6 pocillos) durante varios pasajes. En el paso inicial, los holoclones generado por proporciones similares de holoclones secundarias y meroclones (casi el 50% cada uno), con un número limitado (menos de 10%) de paraclones (Fig. 2A, Fig. S2A). En ensayos paralelos, las células aisladas a partir de meroclones produjeron un número raro de holoclones secundarias pero un porcentaje mucho mayor de paraclones (Fig. 2C, Fig. S2C). Sin embargo, las células raras de paraclones se mantuvieron viables después de volver a la galvanoplastia y generan sólo paraclones secundarias a baja frecuencia (datos no mostrados). Para seguir el destino de desarrollo de las colonias, se seleccionaron las colonias típicas de tipo distinto de cultivo a largo plazo. Las células en colonias seleccionadas se pasaron de forma rutinaria a una densidad clonal bajo condición común. Para las colonias derivadas de la línea celular BxPC3, los 12 holoclones eran viables y proliferado robusta, mientras que 12 de 18 meroclones y 13 de 15 paraclones fueron abortados gradualmente (Fig. 3) durante el cultivo paralelo de 140 días. Del mismo modo, durante 60 días de la aprobación de las colonias derivadas de la línea celular PC3, 8 de 9 holoclones estaban en fuerte expansión, mientras que 4 de 8 meroclones y 6 de 8 paraclones disminuyeron en corto período (Fig. S3). Curiosamente, sólo las células derivadas de holoclones regeneran toda la gama de fenotipos morfológicos coronel y se restauran las proporciones de cada tipo de colonias (Fig. 2B, Fig. S2B) similares a las proporciones observadas en las líneas celulares de sus padres no clasificados en cultivo de baja densidad. Sobre la base de la apariencia distinta expuesto anteriormente, la capacidad de largo plazo auto-renovación
in vitro
residían principalmente en holoclones, pero no meroclones o paraclones.
Las células aisladas a partir de colonias aisladas se sembraron a baja densidad bajo condición común. (A) En el paso inicial, holoclones (n = 8) produce principalmente frecuencias similares de holoclones descendientes y meroclones, mientras que se generaron mucho más bajos porcentajes de paraclones. (B) Después de pasajes de un mes más, holoclones (n = 8) generado toda la gama de colonias de la progenie a frecuencias similares a las retenido en líneas celulares de sus padres sin clasificar. (C) Meroclones (n = 8) se generaron paraclones y meroclones producidos principalmente, y algunos holoclones.
Holoclones (n = 12, línea roja), meroclones (n = 18, línea verde) y paraclones (n = 15, línea azul) se cultivaron en condición común durante 20 semanas y se registraron vida útil de cada colonia. La mayoría de los meroclones y paraclones fueron abortados gradualmente, mientras que todos los holoclones permanecieron viables (p & lt; 0,01).
Holoclones, pero no meroclones o paraclones, iniciar la formación de tumor y el trasplante de serie tumor apoyo en NOD /los ratones SCID
en la robustez de holoclones habían sido mostrados
in vitro
, era importante evaluar la
in vivo
tumorgenecity de tres tipos de colonias. Con el fin de estimar la capacidad de formación de tumores de cada tipo de colonia, se realizaron ensayos de trasplante de serie. En primer lugar, las células BxPC3 sin clasificar que inician la formación de tumores en una forma dependiente de la dosis. 100% de los ratones inyectados con 10
6 o 10
5 BxPC3 células desarrolladas xenoinjertos de tumores después de 14 días, y los ratones inyectados con 10
4 o 10
3 células también desarrollaron tumores de xenoinjertos después de 21 días con eficiencia 100% (Tabla 1). Después de eso, tres holoclones, meroclones tres, y dos paraclones se recogieron a cabo para el trasplante. 10
4 holoclone células formadas tumores palpables en el 100% de los ratones (15 de 15 ratones) dentro de los 18 días. Por el contrario, no hay tumores visibles fueron formadas por células de mero- o paraclones (0 de 36 ratones, 10
4~10
5 células por ratón) dentro de 2 meses (Tabla 1). En una etapa adicional, las células de tumores de xenoinjertos derivados de holoclones fueron entonces purificados y re-trasplantado a ratones NOD /SCID (10
4 células por ratón). Dentro de 18 días, todos los ratones receptores (18 de 18 ratones) desarrollaron tumores palpables (Tabla 1). Los ensayos de trasplante de serie también se llevaron a cabo en la línea celular PC3. Se emplearon línea celular parental sin clasificar, 3 holoclones, meroclones 2, y 2 paraclones. Todos los holoclones derivadas de la línea celular PC3 fueron capaces de desarrollar tumores exclusivamente en latencia corta (Tabla S3) guía empresas
Exnograft tumores derivados de la línea celular BxPC3 sin clasificar y holoclones correspondientes se analizaron con H & amp;. E tinción. Las características histológicas de las probetas de xenoinjertos tumorales se visualizan y se mostraron alto grado de similitud entre las muestras tumorales de la línea celular no seleccionados (Fig. S4A, B) y las correspondientes holoclones (Fig. S4C, D).
Con la diferencia significativa de la capacidad de formación de tumores entre los tipos distict de colonias, se sugirió que la capacidad del tumor a la iniciación
in vivo
se enriqueció en holoclones en lugar de meroclones o paraclones.
marcadores de superficie de células madre de cáncer relacionados, genes y microARN se expresan diferencialmente en distintos tipos de colonias
sobre la base de las características de holoclones
in vitro Opiniones y en
in vivo
, fue necesario el análisis de la expresión de la célula marcadores -Superficie y reguladores asociados con las células madre del cáncer en tres tipos de colonias. Por lo tanto, la citometría de flujo y RT-PCR cuantitativa se emplearon simultáneamente. Los ensayos de citometría de flujo mostraron que CD133 fue negativo (Fig. 4A) y CD44 fue positivo (Fig. 4C) en holoclones, meroclones y paraclones. Todos los tipos de colonias contenían tanto CXCR4
+ y CXCR4
- células, sin embargo, los porcentajes de CXCR4
+ células fueron mucho mayores en holoclones que en meroclones y paraclones (figura 4B.). La intensidad de CD24 (Fig. 4D, la Fig. S5) fue significativamente más fuerte en paraclones que en holoclones. Se obtuvieron resultados similares con RT-PCR cuantitativa.
CD133
no era detectable y
CD44
mostró inferior a 1,3 veces de regulación en holoclones que en paraclones (Fig. 4E). Sin embargo, la expresión de
CD24 Hoteles en holoclones se redujo reguladas por encima de 5 veces mayor que en paraclones (Fig. 4F). El nivel de expresión de
CXCR4
era aproximadamente 3 veces mayor en holoclones que en paraclones (Fig. 4G). Además, la expresión de
IMC-1 |,
GLI1
,
GLI2
,
GLI3
y una lista de los microARN relacionados con el cáncer también fueron cuantificados.
IMC-1 |,
GLI1
y
GLI2
fueron hasta reguladas en holoclones y no en paraclones, mientras que el nivel de expresión de
GLI3
no fue significativamente cambiado entre tres tipos de colonias (Fig. 5A). Los microARNs se mostraron expresan y se separaron en dos grupos diferencialmente: un grupo fue hasta reguladas en holoclones, incluyendo
miR-214
,
miR-21
,
miR-221
,
miR-222
, y
miR-155 gratis (figura 5B.); el otro grupo se había reducido regulado en holoclones, incluyendo
Let-7a
y
miR-30c
,
miR-30b
,
miR-30a
(Fig. 5C). La expresión diferencial de los marcadores y los reguladores también sugieren que la tendencia propiedades de células madre estaban poseídos por holoclones en lugar de otros dos tipos de colonias.
Las células aisladas de holoclones, meroclones y paraclones fueron examinados con citometría de flujo para los marcadores de superficie celular de las células madre del cáncer. CD133 (A) era totalmente negativo en todos los tres tipos de colonias. El CXCR4
+ células (B) fueron detectables en todos los tipos de colonias pero significativamente enriquecido en holoclones. CD44 (C) fue fuertemente positiva y con poca diferencia entre los distintos tipos de colonias, mientras que CD24 (D) se expresó a un nivel superior en paraclones que en holoclones. el nivel de ARNm de
CD44 gratis (E),
CD24 gratis (F) y
CXCR4 gratis (G) en hologramas, mero- y paraclones también fue cuantificado con real PCR en tiempo (
GAPDH
como referencia interna) y las tendencias similares se mostraron (*, p & lt; 0,05).
IMC1
,
GLI1
y
GLI2
fueron hasta reguladas en holoclones, mientras que la expresión de
GLI3
no mostró cambios significativos entre los distintos tipos de colonias (a). Los microARNs se agruparon en dos grupos, que fueron elevados (B) y reprimidos (C) en holoclones respectivamente. Todos los valores de expresión en distintos tipos de colonias se normalizaron en contra de los que están en paraclones (*, p & lt; 0,05).
Holoclones exhibición quimio-resistencia mucho mayor que meroclones y paraclones
Es bien sabido que quimio-resistencia es una de las principales propiedades de las células madre del cáncer, por lo que aquí nos preguntamos si los holocoloes poseen esta capacidad. Por lo tanto, las células aisladas a partir de estos tres tipos de colonias y se trataron con gemcitabina y 5-FU bajo aumento de la concentración. Entre todo el intervalo de concentración ensayado, los índices de supervivencia de las células derivadas de holoclones fueron significativamente más altos que los de meroclones y paraclones (Fig. 6A, B). El IC
50 valor de 5-FU fue de 2.59 × 10
3 nM en holoclones, que era mucho más alto que los de meroclones (1,24 × 10
2 nM) y paraclones (15.10 nm). Para analizar el cambio de la expresión génica inducida por el tratamiento de drogas, RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo con la célula tratada con fármacos. Después del tratamiento con 50 nM de 5-FU durante 12 horas, la expresión de los transportadores de drogas-admisión (
SLC28A1
,
SLC28A2
,
SLC28A3
,
SLC29A1
,
SLC29A2
,
SLC29A3
) eran todos hasta reguladas en paraclones sin efecto en su mayoría holoclones (sólo
SLC28A1
se redujo reguladas alrededor de 2 veces) (Fig. 6C) .Con el tratamiento paralelo de gemcitabina, se detectaron respuestas similares de estos genes (Fig. 6C). Tomados en conjunto,
SLC28A1 /A2
y
SLC29A1 /A3
fueron comúnmente hasta regulada más dramáticamente en paraclones que en holoclones después de los tratamientos de gemcitabina o 5-FU. Esta respuesta diferencial podría ser, al menos en parte, invovled en la variación de la quimiorresistencia entre tres tipos de colonias
Células aisladas de holoclones, meroclones y paraclones se trataron con fármacos quimioterapéuticos de concentración creciente:. 1, 5, 10 , 50, 100 nM de gemcitabina (A) o 5, 10, 50, 100, 500 nM de 5-FU (B). Para cada valor de concentración, tres pozos se establecieron de la repetición en un solo experimento y se realizaron tres veces de los experimentos representativos. Los cambios de expresión de transportadores de admisión quimio-drogas se cuantificaron en holoclones y paraclones, respectivamente, después tratados con 50 nM quimio-fármaco durante 12 horas. (C) (*, p & lt; 0,05).
Discusión
En este estudio, hemos demostrado las propiedades de células madre de holoclones e indicó que un grupo de genes asociados con células madre y microRNAs se expresaron preferentemente en holoclones. Por otra parte, hemos puesto de manifiesto una quimio-resistencia de alto nivel en holoclones y sugirió que el valor potencial de holoclones en el estudio de las células madre del cáncer.
Somos los primeros en mostrar la heterogeneidad en morfologías clonoal de células de cáncer de páncreas. Al igual que en el comportamiento de los queratinocitos [21] y múltiples líneas celulares de cáncer [18] - [20], cuando las células de BxPC3 y la línea celular PC3 se sembraron monoclonalmente, se desarrollaron una serie de colonias con diversas morfologías (Fig 1A.). Sobre la base de la diversidad morfológica, holoclones (fig. 1B, Fig. S1 A), meroclones (Fig. 1C, Fig. S1B) y parclones (Fig. 1D, Fig. S1C) se puede identificar fácilmente.
Además , nuestros resultados indican que las células cancerosas madre-como fueron enriquecidos en holoclones en lugar de mero- o paraclones. Durante
in vitro
de propagación, las células en holoclones generan un alto porcentaje de la progenie holoclones en la primera ronda de paso (Fig. 2A, Fig. S2A). Después de más pasajes, las células en holoclones generaron colonias con la serie completa de las características morfológicas similares a la procedente de las líneas celulares de sus padres sin ordenar (Fig. 2B, Fig. S2 B). Sin embargo, meroclones generan un nivel limitado de holoclones y mucho más altos porcentajes de paraclones (Fig. 2C, Fig. S2C). Durante largo plazo de los pasajes
in vitro
, holoclones mostraron mayor robustez y la proliferación constante, mientras que paraclones mero- y disminuyeron rápidamente (Fig. 3, Fig. S3). Con las diferencias que se muestran arriba, distintos tipos de colonias poseían la capacidad diferencial de la auto-renovación y capacidad de proliferación. Más importante aún, holoclones en serie iniciados desarrollo de tumores
in vivo
mientras paraclones mero- y no lo hicieron (Tabla 1, Tabla S3), que se considera como el estándar de oro ampliamente utilizado para la identificación de células madre del cáncer. Como un complemento indispensable, los xenoinjertos de tumores derivados de holoclones BxPC3 mostraron características histológicas similares con los que el tejido tumoral derivada de la línea celular BxPC3 no seleccionados (Fig. S4). En líneas celulares de cáncer de próstata PC3 [19] y DU145 [24], las características similares de holoclones
in vitro
y
in vivo
habían indicado y servido como evidencias de apoyo a la propiedad de las células madre holoclones.
además, la expresión de marcadores de superficie de células, genes y microARN entre los distintos tipos de colonias también sugirieron la propiedad de células madre de holoclones. En primer lugar, los marcadores de superficie celular de las células madre de cáncer de páncreas, CD44, CD24, CD133 y se evaluaron. Sobre la base de dos informes independientes, se identificaron las células madre del cáncer pancreático como población de CD44
+ CD24
+ ESA
+ o CD133
+, sin embargo, estas dos poblaciones mostraron poca superposición entre sí [10 ], [11]. De acuerdo con los resultados de citometría de flujo (Fig. 4A, C) y RT-PCR cuantitativa (Fig. 4E) ensayos, la expresión de
CD133
(indetectable) y
CD44
(altamente expresado) eran tanto indistinguibles entre tres tipos de colonias. La expresión de
CD24
se downregulated en holoclones que en paraclones (Fig. 4F, Fig. S5), el cual es potencialmente varió de informe anterior [10]. Al igual que en el estado de la expresión inesperada de
CD133
[11], [25] y
CD24
[10] en líneas de células pancreáticas BxPC3 y PC3, la expresión divergente de
CD133
en una cierta línea celular también se informó en líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR3 y SKOV3 [26] - [28], lo que podría, al menos en parte, debido a algunos cambios inducidos indeterminados durante el cultivo a largo plazo
in vitro
. Además, las células madre de cáncer CD133- se han identificado en glioma y sugerido como fuerza impulsada primordial más del desarrollo de tumores que la población de células CD133 + [29]. Para una evaluación adicional de las propiedades de células madre de holoclones, se cuantificaron una serie de genes y mciroRNAs asociados con las células madre del cáncer. Entre los genes regulados hasta en holoclones,
IMC1 gratis (Fig. 5A) se ha demostrado que desempeñan papel regulador clave en la auto-renovación de los nervios [30], de mama [31], hematopoyético [32] las células madre y de múltiples tipos de células madre del cáncer [31], [33], [34]. Lo que es más,
IMC1
promotor ha sido utilizado para conducir EGFP como un marcador intracelular para enriquecer las células madre hematopoyéticas [35]. Similar a nuestros resultados,
IMC1
habían sido reportados recientemente preferentemente expresado en holoclones derivadas de la línea celular de glioma [20]. La elevación de
GLI1
y
GLI2 Hoteles en holoclones (Fig. 5A) sugiere una mayor actividad de señalización de Hedgehog, que era consistente con el nivel más alto de
SHH
expresión en CD44
+ CD24
+ ESA
+ células madre cancerosas aisladas a partir de muestras humanas primarias de cáncer de páncreas [20]. La vía de señalización de Hedgehog también juega un papel esencial en el mantenimiento de las células madre del cáncer de mama [31] y el cerebro [36].
CXCR4
, el mediador fundamental de la metástasis, era demasiado hasta reguladas en holoclones (Fig. 4B, G). En CD133
+ células madre de cáncer de páncreas, el CXCR4
+ subpoblación es más invasivo que CXCR4 autólogo
- subpoblación [11]. Entre los microARN hasta reguladas en holoclones,
miR-214
,
miR-221
,
miR-222
y
miR-155 gratis (Fig. 5B) se sobreexpresa frecuentemente en las células madre del cáncer de mama [37]. Sin embargo,
Let-7a gratis (Fig. 5C), que fue significativamente las reguladas en holoclones, juega un papel negativo en la auto-revewal, tumorigenicidad, y quimio-resistencia de las células madre del cáncer de mama [12]. Del mismo modo, el miR-30a /b /c (Fig. 5C) también se sobreexpresa en paraclones. En el cáncer de mama, esta familia microARN inhibe la autorrenovación de las células madre, induce la apoptosis, y reduce la metástasis de pulmón [38].
Mayor nivel de la quimio-resistencia se indica en holoclones y no en meroclones y paraclones (Fig . 6A, B), que es coherente con la función de apoyo de células madre de cáncer en la quimiorresistencia informó anteriormente [11], [13]. De acuerdo con la quimio-resistencia robusta en holoclones, genes y microARN que sustentan la quimio-resistencia, incluyendo
IMC1
[39],
GLI1 /2
[40],
CXCR4
[41 ],
miR-214
[42],
miR-21
[43], y
mir-155
[44] (Fig. 4G, Fig. 5A, B) fueron hasta reguladas en holoclones. En respuesta a los tratamientos con fármacos, la expresión de transportadores de fármacos-de admisión, de los cuales el nivel de expresión mayor se correlaciona con una mayor supervivencia de los pacientes [45] - [48], fue inducida en paraclones preferentemente (Fig 6C.). Esto significa que el medicamento en la toma se incrementará más rápidamente en paraclones que en holoclones. Este podría ser uno de los orígenes potenciales de la supervivencia preferente de las células madre del cáncer frente a las células de cáncer no-madre en la quimioterapia.
En su conjunto, las colonias con morfologías distintas y en diferentes etapas de diferenciación pueden servir como un modelo potencial para el análisis de células madre del cáncer (Fig. 7). Con este modelo, los genes y microARN potencialmente correlacionados con las células madre del cáncer pueden ser identificados. Más importante aún, la evaluación paralela de medicamentos chemotheraputic puede llevar a cabo sobre las células madre de cáncer y las células cancerosas no madre autólogas. Esto significa que el modelo de células madre de cáncer de base morfologías clonales será útil para llevar a la nueva comprensión de la quimiorresistencia, que debe ser bastante diferentes de los obtenidos a partir de poblaciones de células de cáncer heterogéneos, y será útil para superar la quimiorresistencia en la terapia del cáncer.
Las células madre de cáncer de páncreas y sus progenies en la diferenciación pueden desarrollar a colonias individuales con diferentes morfologías. Sobre la base de la in vivo e in vitro características, Holoclones corresponden a las células madre de cáncer /progenitoras, mientras que paraclones corresponden a las células completamente diferenciadas y meroclones corresponden a las células en la fase intermedia. Los genes y microARN que se asocian con las células madre del cáncer y apoye la quimio-resistencia, incluyendo
IMC1
,
GLI1 /2
,
CXCR4
,
mir-21/214 /221/222/155
, se enriquecen en holoclones. Sin embargo, el
Let-7
y
miR-30a /b /c
se enriquecen en paraclones.
Materiales y Métodos
Cell líneas
línea celular de adenocarcinoma de páncreas humano BxPC3 (adquirido a Banco de células de la Academia de Ciencias de china, Shanghai, china) y PC3 fueron (comprado de china Collage Unión médica, Pekín, china) cultivadas en RPMI-1640 (Hyclone ) con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (Hyclone) y se pasaron como 1:10 con 0,25% de tripsina /EDTA (Hyclone). Estos línea celular se estableció a partir de un adenocarcinoma ductal pancreático primario y con la típica morfología del epitelio [22], [23]. BxPC3 [22] se obtuvo de descendencia europea y PC3 [23] se obtuvo a partir chino.
drogas químicas
liofilizado en polvo de gemcitabina (Lilly) se disolvió en Calsium /magnesio libre PBS (Hyclone ) y almacenados a -20 ° C con una concentración de 4 mg /ml. solución de 5-FU (Roche) se almacenó a -20 ° C con una concentración de 25 mg /ml. Antes de su uso, las acciones se diluyeron a concentraciones de trabajo (5, 10, 50, 100, y 500 nM para 5-FU, y 1, 5, 10, 50, y 100 nM de gemcitabina) con medio de cultivo.
Animales
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales de la Universidad de Pekín (número de autorización fue IRB00001052-09051). Los ratones NOD /SCID fueron adquiridos de Centro de Ciencias de Animales Experimentales de la Universidad de Pekín y se mantuvieron en condiciones estándar de acuerdo con las directrices institucionales.
clonación de células individuales
Las células se recogieron a 70% ~ 80% de confluencia con Accumax (Chemicon) y se resuspendieron en medio sin suero. de células individuales se sembró en cada pocillo de placas de 96 pocillos con citometría de flujo MoFlo (DakoCytomation). Dos días después de la siembra, placas de 96 pocillos se verificaron con microscopía. Los pocillos que contenían sólo una célula viable se marcaron. Y entonces, el medio se renueva cada 3 días. Las colonias se clasifican como hologramas, mero- y paraclones de acuerdo a sus morfologías. 14 días después de su clasificación por citometría de flujo, se seleccionaron las colonias típicas para experimentos adicionales.
Tumor implantación de células
Las colonias seleccionadas se expandieron y se recogieron con Accumax (Chemicon), se contaron y se volvieron a suspender en 01:01 mezcla de RPMI-1640 y Matrigel (BD). Las alícuotas de la suspensión de células se inyectaron por vía subcutánea en parte dorsolateral de ratones NOD /SCID. Se determinó la latencia de tumor (es decir, el tiempo desde la inyección a la detección de tumores palpables). Dentro de los 9 semanas después de la implantación, se sacrificaron los ratones portadores de tumores. Mientras tanto, los tumores de xenoinjertos se diseccionaron quirúrgicamente y se pesaron. Los ratones sin ningún signo de la carga tumoral se mantuvo durante al menos 9 semanas desde la implantación y luego examinado en la necropsia para confirmar que estaban libres de tumor.
Para el transplante en serie, los xenoinjertos de tumores se picada en trozos pequeños con unas tijeras, se suspendieron en medio M199, y se digirió a 37 ° C durante aproximadamente 3 horas con 200units /ml ulturapure collagenas IV (Worthington Biochemicals). Además digestión mecánica se realizó con una pipeta de 25 ml cada 15 minutos. Después de la digestión, la suspensión celular se filtró a través de una malla de nylon de 40 micras y suavemente se carga en la capa superior de Histopaque-1077 gradiente (Sigma-Aldrich) (1~3 × 10
6 células /ml Histopaque utilizado en el volumen total de 3 ml) y después se centrifugó a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se recogieron las células nucleadas viables en la interfase, mientras que se eliminaron las células rojas de la sangre, células muertas y los desechos. La suspensión de una sola célula cosechado se utiliza para el trasplante como se describe anteriormente.
Fueron cosechadas
quimiorresistente ensayo
Las células del mismo tipo de colonias, agruparon y se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad de 5000 células /pocillo. 24 horas después, el medio se actualiza y se añadieron fármacos (gemcitabina o 5-FU).