Extracto
El sexo masculino es un factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC), pero los mecanismos no se entienden completamente. El gen de ARN motivo de unión en el cromosoma Y (RBMY), que codifica un regulador de sexo masculino de germen de células específicas de empalme de ARN durante la espermatogénesis, se activa de forma aberrante en los cánceres hepáticos humanos masculinos. Este estudio investigó la
in vitro
efecto oncogénico y el posible mecanismo de RBMY en la línea celular de hepatoma humano HepG2 y su
in vivo
efecto con respecto a los hígados de los ratones transgénicos y humanos. RBMY expresión en células HepG2 fue derribado por la interferencia de ARN y el fenotipo de las células del cáncer se caracteriza por la formación de colonias en agar blando y la sensibilidad a la apoptosis de peróxido de hidrógeno inducida. Los resultados revelaron que RBMY caída reduce la transformación y la eficiencia anti-apoptótica de las células HepG2. La expresión de RBMY, receptor de andrógenos (AR) y su variante AR45 inhibitorio, genes AR-dirigido factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) y de unión similar a la insulina factor de crecimiento de proteína 3 (IGFBP-3) se analizó por RT cuantitativa -PCR. Sobre regulación de la variante AR45 y la reducción de IGF-1 e IGFBP-3 expresión sólo se detectó en las células RBMY desmontables. Por otra parte, RBMY positiva masculina humana HCC expresó menor nivel de AR45 en comparación con RBMY HCC tejidos negativo. Las propiedades oncogénicas de RBMY se evaluaron adicionalmente en un modelo de ratón transgénico. RBMY ratones transgénicos específicos del hígado desarrollaron lesiones hepáticas precancerosas, adenoma y carcinoma hepatocelular. RBMY también aceleró hepatocarcinogenesis químico carcinógeno inducida en ratones transgénicos. En conjunto, estos hallazgos sugieren que Y RBMY-cromosoma específico es probable que participan en la regulación de la actividad del receptor de andrógenos y contribuye al predominio masculino de HCC
Visto:. Tsuei DJ, Lee PH, Peng HY, Lu SL, Su DS, Jeng YM, et al. (2011) Hombre de células germinales específicos de ARN Binding Protein RBMY: Una Nueva Oncogene Explicando predominio masculino en el cáncer de hígado. PLoS ONE 6 (11): e26948. doi: 10.1371 /journal.pone.0026948
Editor: John D. Minna, Universidad de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Junio, 2011; Aceptado: 6 Octubre 2011; Publicado: 4 de noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Tsuei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas INDH-EX93-117BN, INDH-EX95 (96, 97, 98) -9418BI del Instituto Nacional de Investigación en Salud de Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los principales tipos de cáncer en el mundo [1]. Los principales factores de riesgo identificados incluyen el virus de la hepatitis B (VHB) o infección por el virus de la hepatitis C (VHC), la exposición a las aflatoxinas, y el sexo masculino [2]. La razón hombre-mujer de HCC según se informa promedios 4-5:1 y es particularmente alto en el CHC relacionado con el VHB (5-11:1) [3]. Los estudios epidemiológicos mostraron que un nivel elevado de testosterona en suero se asoció significativamente con un mayor riesgo de HCC en los portadores del VHB macho [4]. Sin embargo, el predominio de sexo masculino con una relación de 3-4:1 también se observa en HCC infancia con inicio temprano, tan jóvenes como de & lt; 10 años de edad antes de la pubertad, y no se puede explicar directamente por efecto de andrógenos [5], [6] .
el receptor de andrógenos (AR) se ha demostrado que contribuyen a la preferencia de sexo masculino de hepatocarcinogenesis en HBV y los portadores del VHC [7], [8]. La proteína AR media la acción de los andrógenos y puede promover el desarrollo de HCC masculina en ratones [9]. Después de la unión a ligandos, AR forma homodímeros y activa la transcripción de genes diana tales como el factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) y factor de crecimiento similar a la insulina proteína de unión 3 (IGFBP-3) [10], [11]. La función AR se regula por los co-activadores o co-represores [12], la isoforma AR45 inhibitoria [13], y más cortas repeticiones de CAG (que conduce a una mayor actividad de AR) en el primer exón del gen AR [14]. La proteína del VHB X es un conocido AR co-activador [15], [16] y se informó de contribuir al predominio masculino en el varón humano relacionado con el VHB HCC [17]. En el VHB no HCC, otros factores desconocidos específicos de género que promueven la formación de HCC en los hombres se han convertido en una preocupación importante.
La desregulación de los genes del cromosoma Y específico se ha encontrado en HCC masculina, pero su papel en el predominio masculino de CHC hasta el momento no se han abordado [18], [19]. El gen motivo de unión al ARN en el cromosoma Y (RBMY) es un gen específico de la célula germinal masculina de expresión que contiene motivos de reconocimiento de ARN en el extremo N-terminal [20]. Su expresión se limita a los núcleos de las células germinales masculinas y su eliminación puede causar la detención de las células germinales en la etapa meiótica de la espermatogénesis [21]. funciones RBMY como un germen regulador de corte y empalme específica de la célula masculina, por la modulación de la actividad de factores de empalme expresadas constitutivamente [22], [23]. Su activación aberrante se detecta en aproximadamente un tercio de los tejidos HCC y tumorales hepatoblastoma masculinos, pero no en tejidos emparejados no tumorales de hígado, HCC hembra, u otros tipos de cáncer [24]. Aunque RBMY puede interactuar con AR co-activador Sam68,, todavía no se ha informado [25] [26] su papel en la vía de señalización AR.
El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia de transformación y anti-apoptótica de RBMY en células de hepatoma humano, y la eficacia de hepatocarcinogénica RBMY en ratones transgénicos, y para explorar sus posibles mecanismos moleculares subyacentes. Nuestros resultados
in vitro
,
in vivo
, y en el varón humano clínica HCC tejidos sugieren que RBMY puede aumentar la actividad de AR y hepatocarcinogénesis mediante la reducción de la expresión de AR variante AR45 inhibitoria.
Materiales y Métodos
muestras de tejido humano
tejidos tumorales hepáticas pareadas y no tumorales se obtuvieron de 66 pacientes varones con HCC quirúrgica (44 VHB-relacionado, 10 relacionada con el VHC, 5 VHB /VHC y VHB 7 no /se obtuvieron HCV-relacionada) en el hospital de la Universidad Nacional de Taiwán (NTUH) en 2007. Todas las muestras clínicas después de la aprobación del Comité de Ética de Investigación de la NTUH (aprobación NTUHREC Nº 9361701139) .
cultivo de células y transfección
las líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano HepG2 y Hep 3B se obtuvieron originalmente de la colección Biorecursos y Centro de Investigación (BCRC, Taiwán). HepG2, Hep3B y Huh7 (de Dr. Hui-Lin Wu de NTUH Hepatitis Centro de Investigación), las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Hyclone, Logan, UT). Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamine (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
interferencia de ARN
La estrategia basada en pSUPER se utilizó para derribar la expresión RBMY. RBMY RNA pequeña horquilla (shRNA) se generó mediante la ligación de tres secuencias de 19-nucleótidos específicas para la región RBMY SRGY (exones 7-10) en el vector (OligoEngine, Inc., Seattle, WA). Las secuencias se muestran en la Tabla S1. Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia para la transfección y se seleccionaron las células transfectadas con 300 mg /ml de geneticina.
Semi-RT-PCR cuantitativa y cuantitativa PCR
El ARN total se extrajo utilizando RNeasy Mini kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Alemania) y se sometió a transcripción inversa utilizando superíndices III Reverse Transcriptase (Invitrogen). El primer secuencias y condiciones de reacción se muestran en la Tabla S1. PCR cuantitativa se realizó mediante la mezcla de ensayo TaqMan Expresión génica para RBMY objetivo (Hs00359074_m1) o control endógeno hipoxantina fosforribosil transferasa 1 (Hs99999909_m1) (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR cuantitativa para AR, AR45, IGF-1, IGFBP-3, y el control endógeno S26 se realizó usando la mezcla maestra Plus para SYBR Green (Applied Biosystems). señales de amplificación fueron detectados por un PRISM7700 ABI 7500 o del sistema de PCR en tiempo real rápida (Applied Biosystems).
ensayos
agar blando y supervivencia
Para el ensayo de agar blando, 2500 células por pocillo en medio de crecimiento que contiene 0,35% de agarosa se colocaron en placas de 6 pocillos con la base de agarosa al 0,5%. Después de 14 días de incubación, las colonias se tiñeron con 0,005% de cristal violeta a temperatura ambiente durante 1 hr y se contaron para cada placa.
Para el ensayo de supervivencia, las células HepG2 transfectadas con plásmidos shRNA fueron tratados con 0,5 o 0,75 peróxido de hidrógeno mM durante 24 horas para inducir la apoptosis. La viabilidad celular se midió usando el kit de proliferación celular I (MTT) (Roche Diagnostics, Alemania). Se midió la absorbancia a 590/690 nm usando un lector de microplacas MRX (Dynex Technologies, Inc., VA) y la supervivencia celular se expresó como la absorbancia relativa a la de control no tratado.
Determinación del receptor de andrógenos repetición de CAG longitud en HCC tejidos humanos
la región genómica que contiene la repetición de trinucleótidos CAG se amplificó por PCR y se marcó con FAM, sometido a la ABI 3700 Genetic Analyzer, y obtuvo usando el software GeneMapper (Applied Biosystems). La curva estándar para calcular el número de repeticiones de CAG se basó en cuatro muestras de control con los números de repetición CAG que van del 17 al 35. El análisis de secuenciación se realizó en HCC tejidos de 66 sujetos de estudio con un número de repetición CAG de la curva estándar.
Establecimiento de ratones transgénicos RBMY y el seguimiento de la histopatología
la secuencia de codificación se amplificó RBMY y sub-clonado en el pBS-HCRHPI-un vector con un promotor de α1-antitripsina específico del hígado. El constructo fue digerido con
SpeI
para generar un fragmento del transgen para la inyección en los pro-núcleos de huevos fertilizados de FVB /N ratones. El Comité para el Cuidado y Uso de Animales institucional de la Facultad de Medicina y la Facultad de Salud Pública, Universidad Nacional de Taiwán aprobó el cuidado de los animales y los procedimientos experimentales (la aprobación del IACUC No. 20060217) guía.
Los ratones fueron sacrificados a las 4-24 meses de edad. Sus hígados se fijaron en formalina al 10% tamponada neutra o incrustados en compuesto OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA). Las secciones en parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina para examen histopatológico, mientras que las secciones congeladas se tiñeron con aceite rojo O para detectar acumulación de gotas de grasa. La gravedad de la esteatosis se estimó por el porcentaje de tinción positiva utilizando un método semi-cuantitativo morfológicas y clasifica en grado 1 (& lt; 33%), grado 2 (33-66%), o de grado 3 (& gt; 66%) como descrito anteriormente [27].
diethylnitrosamine tratamiento y la histopatología en ratones
en el modelo carcinógeno químico, viejos transgénicos RBMY o de control de ratones de 14 días recibieron aleatoriamente una sola inyección intraperitoneal de diethylnitrosamine ( DEN) (Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO) a 10 mg /kg de peso corporal o solución salina de igual volumen, respectivamente. Los ratones se sacrificaron a las 26 y 34 semanas después del tratamiento. Además, a principios de sacrificio a las 14 semanas fue aprobado específicamente para ratones macho que según los informes altamente susceptibles a hepatocarcinogénesis inducida-DEN. Se registraron mediciones de masas tumorales visibles en la superficie del hígado. Las lesiones microscópicas se contaron a partir de dos secciones representativas (distancia de 50-M) de cada hígado de ratón.
Immuno-histoquímica
tinción inmunohistoquímica para el antígeno RBMY se realizó en secciones de hígado congelado. Después de la recuperación de antígeno y de enfriamiento de la peroxidación endógeno, el anticuerpo de conejo anti-SRGY [24] se incubó con secciones a dilución 1:400 durante la noche a 4 ° C. HRP-DAB se utiliza como un sistema de detección (I + amp; D Systems, Inc., Minneapolis, MN) y contra-teñidas por hematoxilina
Western Blot
La extracción de proteína total, Western. El análisis de transferencia, y la preparación de anticuerpos anti-SRGY se realizaron como se describe anteriormente [24]. En resumen, 50 g de proteína total extraído a partir de tejido de hígado de ratón individuales se separaron por electroforesis utilizando el estándar SDS-PAGE. Las transferencias se incubaron con anticuerpos anti-SRGY policlonales de conejo a la dilución y 1:5000 monoclonal de ratón anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) anticuerpos (Abcam, Cambridge, UK) a una dilución 1:1000.
el análisis estadístico
las diferencias estadísticas en la asociación entre AR-repeticiones CAG y RBMY, ensayo de viabilidad, doble cambio en la expresión del ARN, y el análisis del tratamiento fueron analizados por DEN de
t-test
Student de dos colas . Diferencia de incidencias esteatosis entre los ratones transgénicos y de control se analizó mediante la prueba de Chi-cuadrado. ensayo de colonias en agar blando se evaluó mediante ANOVA de una vía seguido por
t-test
. Después de la normalización en contra S26, los valores relativos de expresión de AR y AR45 fueron analizados por el estudiante de
t-test
con una varianza desigual. Un
p
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo, mientras que un
p valor
entre 0,05 y 0,1 se consideró como teniendo una tendencia de la diferencia
Resultados
caída RBMY reduce la eficiencia de la transformación y anti-apoptóticos de células HepG2
nativa expresaban RBMY en la línea celular de hepatoma humano HepG2 fue interferido por shRNA dirigido específicamente al dominio de SRGY RBMY. RT-PCR cuantitativa mostró que & gt; 95% de las transcripciones RBMY se inhibieron en pSUPER-914 células HepG2 transfectadas pSUPER-680 y, mientras que pSUPER-778 no tuvo ningún efecto knockdown comparación con las células transfectadas (vector Fig. 1A). análisis de inmunohistoquímica confirmó además desmontables eficiente de RBMY en pSUPER-680 y pSUPER-914 transfectadas las células (fig. 1B). Los vectores sólo transfectantes expresan niveles similares de RBMY comparación con las células HepG2 parentales y por lo tanto se utilizaron como controles para
in vitro
experimentos de células en.
(A) El análisis cuantitativo de RT-PCR de RBMY en parental (G2), vector plásmido (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, y pSUPER-914 plásmidos transfectaron células HepG2. (B) tinción inmunohistoquímica de HepG2 y los transfectantes correspondientes para la proteína RBMY. formación (C) Colonia de células HepG2 transfectadas parentales o en agar blando. (D) Porcentaje de viabilidad celular por MTT posterior ensayo de 0,5 o 0,75 mM de peróxido de hidrógeno al tratamiento (H
2O
2). Los datos se presentan como media ± desviación estándar de cuatro experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p
. & Lt; 0,01
El ensayo de la independencia de anclaje mostró que RBMY-que expresan las células HepG2 tenían mayor habilidad en comparación con las células clonogénico RBMY desmontables (
p
& lt; 0,0001, ANOVA de una vía). Los números de colonias de pSUPER-680 y pSUPER-914 células transfectadas en agar blando se redujeron en 45% y 40%, respectivamente, en comparación con los transfectantes vector vacío (Fig. 1C). La formación de colonias de RBMY-expresión de pSUPER-778 transfectantes también fue significativamente mayor que los transfectantes desmontables (680 vs. 778,
p
& lt; 0,0001; 914 vs. 778,
p
= 0,001).
Las capacidades anti-apoptóticos de RBMY-expresar y transfectantes HepG2 desmontables se analizaron mediante ensayo de supervivencia después de tratamiento con peróxido de hidrógeno. En comparación con los transfectantes de vector vacío, la viabilidad de los transfectantes pSUPER-680 shRNA con tratamiento con peróxido de hidrógeno 0,5 o 0,75 mM se redujo en un 46% y 53% (
p
& lt; 0,05), respectivamente, y las de pSUPER- 914 transfectantes se redujeron en 34% y 54% (
p
& lt; 0,05), respectivamente (Fig 1D.). La viabilidad de RBMY expresan transfectantes pSUPER-778 era 16 a 19% menor que la de los transfectantes del vector (
p
= 0,5).
knockdown RBMY aumentó la expresión de inhibidor de la variante del receptor de andrógenos AR45 y disminución de la actividad de trans-activación AR, mientras que la sobreexpresión RBMY suprime los niveles AR45
se ha informado de que Sam68, como un regulador de corte y empalme alternativo y la interacción de proteínas de RBMY, podría modular la actividad transcripcional AR-regulada en células de cáncer de próstata [ ,,,0],25]. Para examinar si la relación de expresión de AR y su isoforma inhibitoria AR45 se vieron afectados por RBMY, semi-cuantitativos de RT-PCR se realizó durante RBMY que expresan las células HepG2 o desmontables. Densitometría análisis mostró un aumento de tres veces de los niveles de AR45 en transfectantes RBMY desmontables (pSUPER-680 y pSUPER-914) en comparación con sólo para transfectantes del vector (VC) (
p Hotel & lt; 0,05) (Fig. 2A) . niveles AR45 en células HepG2 de los padres y pSUPER-778 transfectantes fueron similares a los de los transfectantes del vector. No hubo ningún cambio significativo en los niveles de AR entre RBMY-expresar y desmontables células. Las relaciones de AR /AR45 en transfectantes RBMY desmontables (pSUPER-680 y pSUPER-914) se redujeron en un 2 a 2,5 veces en comparación con sólo para vector transfectantes (VC) (Fig. 2A).
(A ) semi-cuantitativos de RT-PCR y análisis densitométrico de RBMY, AR y AR45 en los padres (G2), el plásmido vector (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, y pSUPER-914 transfectadas plásmidos células HepG2. (B) El análisis cuantitativo de RT-PCR de RBMY, AR45, IGF-1 y IGFBP-3 en transfectantes RBMY desmontables (680 y 914) y los transfectantes no desmontables (VC y 778). Los valores se normalizaron contra el S26 de control interno. Los datos son la media ± SD se pliega sobre el control del vector (VC). análisis (C) RT-PCR cuantitativa de AR y AR45 en el control de vector o RBMY transfectaron células Hep 3B y Huh7. Los datos son la media ± SD se pliega sobre el control del vector (VC). (D) El análisis semicuantitativo RT-PCR de RBMY en el tumor (T) y las partes no tumoral (N) de los HCC humanos masculinos. S26 es un control y alfa fetoproteína interna (AFP) como marcador tumoral. (E) tinción inmunohistoquímica de la proteína RBMY nuclear en los tejidos HCC única (x400). expresión (F) y AR AR45 mRNA en 7 RBMY que expresan y 5 que no expresa HCC tejidos masculinos humano. Los resultados fueron la media de tres experimentos diferentes. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p
. & Lt; 0,01
Como se informó AR45 para suprimir la actividad de AR trans-activación [13], la expresión de los genes diana de AR IGF-1 e IGFBP-3 fue evaluado y comparado entre las células que expresan RBMY y HepG2 desmontables. El análisis cuantitativo de RT-PCR reveló que las células RBMY desmontables expresaron altos niveles de AR45 pero redujo significativamente (p
y lt; 0,05) IGF-1 y IGFBP-3 (p
& lt; 0,01) los niveles (Fig. 2B), demostrando que RBMY desmontables correlacionado con la expresión AR45 mejorada y actividad AR reprimido.
además, la supresión de la expresión AR45 por sobre-expresión de RBMY también se demostró en células Hep 3B y Huh7. niveles AR45 se redujeron a 42% en RBMY transfectadas Hep3B y 60% en las células Huh7 (
p
& lt; 0,05) (Fig. 2C). No hubo ningún cambio significativo en los niveles de AR entre las células transfectadas con el vector transfectadas con RBMY y.
expresión RBMY correlacionado con niveles reducidos AR45 y más corto AR-CAG repite en HCC tejidos masculinos humana
Sobre la base de los resultados mencionados anteriormente muestran que la expresión RBMY se asoció con niveles más bajos en las células HepG2 AR45, AR45 AR y se compararon las expresiones más en RBMY que expresan y que no expresa HCC tejidos masculinos humano. Semi-RT-PCR cuantitativa mostró que RBMY se detectó en 35% (23/66) de sexo masculino tejidos tumorales HCC, que fueron confirmados por la expresión de fetoproteína marcador tumoral alfa (Fig. 2D). La tinción inmunohistoquímica confirmó la expresión nuclear de RBMY sólo en tejidos tumorales de HCC (Fig. 2E) .La tasa positiva de las transcripciones RBMY fue del 36% (16/44) en el CHC relacionado con el VHB, el 40% (4/10) en el VHC -relacionado HCC, el 20% (1/5) de HCC VHB /VHC, y el 29% (2/7) de HCC relacionada no viral. No hubo transcripciones RBMY detectables o proteínas en las porciones no tumorales de los tejidos del hígado 66 HCC
.
Se determinó la expresión de la variante de AR y AR45 en siete RBMY-expresar y cinco no expresan HCC tejidos humanos varones por 2exp
- método para la cuantificación relativa (ΔΔCt). Los niveles de mRNA en tejidos HCC se normalizaron contra el control interno S26 y se comparan con los niveles en vector de sólo transfectantes HepG2. Se detectaron niveles significativamente más bajos de AR45 en RBMY-expresión de HCC macho en comparación con no RBMY expresando tejidos HCC (
p
& lt; 0,05) (Fig 2F.), lo que refleja la supresión RBMY en AR45 de la transcripción. No hubo una diferencia significativa de los niveles de AR entre RBMY que expresan y que no expresa HCC tejidos.
A fin de evaluar la asociación entre la actividad de AR, la longitud de repetición de CAG del gen AR, AR RBMY una actividad- y factor asociado, se determinó en RBMY que expresan o no expresan HCC tejidos humanos masculinos. La longitud media de repetición CAG-49 en tejidos masculinos HCC relacionado con el VHB (RBMY positivo /negativo = 17/32) fue significativamente menor en aquellos con que en aquellos sin expresión RBMY (21,0 ± 2,8 vs. 22,9 ± 2,8,
p Hotel & lt; 0,05). La asociación de repetición CAG-expresión y la longitud RBMY reveló una tendencia de la diferencia (21,4 ± 2,54 vs. 22,7 ± 2,75,
p = 0,064
) cuando se incluyeron los tejidos no VHB HCC (RBMY positivo /negativo = 23 /43).
RBMY ratones transgénicos desarrolló hepática cambios grasos y lesiones neoplásicas
ratones transgénicos con la expresión específica del hígado de RBMY se establecieron
(Fig. 3A). Western blot mostró expresión baja en RBMY fundadores transgénicos RF1 y RF2, pero el nivel de alta RBMY en RF4 y RF6 (Fig. 3B). No hubo RBMY transgénico detectado en el cerebro, corazón, riñón, pulmón, bazo, estómago, testículo o por RT-PCR (Fig. 3C), lo que indica una expresión específica del hígado de RBMY en ratones transgénicos. RT-PCR cuantitativa resultados apoyaron aún más RF4 como fundador expresión de alto (Fig. 3D). IHC tinción mostró que RBMY se encuentra principalmente en el núcleo de los ratones transgénicos los tejidos del hígado (Fig. 3E).
(A) Mapa genético del transgén RBMY 4,2 kb, que incluye una región de control del locus hepática de la apolipoproteína E gen (ApoE-HCR), promotor de α1-antitripsina específica del hígado (hAAT-Pr), truncada del factor IX intrón (hFIX-IA), y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (bGHpA). (B) Análisis de transferencia Western de RBMY preparado a partir de los hígados de los transgénicos individuales (RF1-6, RF2-265, RF4-89, RF6) y el control de los ratones (TR1, TR2). (C) la expresión específica del hígado de RBMY en ratones transgénicos por RT-PCR usando GAPDH como control interno. Reacciones sin molde de ARN (RTC) o ADNc (NTC) eran controles negativos. (D) Expresión de RBMY en ratones transgénicos (RF1-176, RF1-278, RF2-62, RF2-390, RF4-19, RF4-21) y el control (TR1, TR2) ratones mediante RT-PCR cuantitativa. (E) tinción inmunohistoquímica de transgénicos (RF4-89) y control (NT) para los tejidos del hígado de ratones RBMY. ratón transgénico mostró tinción nuclear para RBMY (x400). (F) Aceite de tinción con rojo mostró cambios grasos hepática en los ratones de control (TR1 y TR2), bajo RBMY (RF2-62 y RF2-390) y alta RBMY (RF4-19 y RF4-21) ratones transgénicos (× 400).
cambios hepatocelulares se analizaron a partir de secciones de hígado de ratones transgénicos 79 y 30 de control FVB /N ratones. Altas fundadores RF4 RBMY que expresan (RF4-19 y RF4-21) muestran más grave depósito de grasa de baja RBMY expresan fundadores RF2 (RF2-62 y RF2-390) (Fig. 3F). En ratones transgénicos RBMY, la incidencia de desarrollo de moderada a severa esteatosis hepática fue 60 a 89% (promedio 73%), que era ~ 2,5 veces mayor que la del grupo de control (promedio 30%,
p
& lt; 0,001) (Tabla 1). RBMY expresión no aumentó fibrosis o cirrosis en el modelo de ratones transgénicos.
Entre los 45 ratones transgénicos que eran mayores de 15 meses, tres de ellos desarrollaron lesiones cancerosas hepáticas (Tabla 1). Un nódulo (1 mm de diámetro) se encontró en el lóbulo derecho del ratón RF1-278 (15 meses) y el examen histológico reveló una lesión pre-neoplásica (Fig. 4A-C). El ratón RF4-21 (24 meses) tenía un nódulo adenoma (4 mm de diámetro) en el lóbulo derecho (Fig. 4D-F) HCC mientras RF2-390 (21 meses) había diferenciado moderadamente (6 mm de diámetro) en el lóbulo medio (Fig. 4G-I). No se observaron cambios grasos de mediano a severo en las piezas tumorales de los tres ratones. Ninguno de los 17 ratones de control de más de 15 meses desarrollaron lesiones cancerosas hepáticas.
(A-C) de lesiones preneoplásicas en un 15 meses de edad RF1-278 ratón macho. (D-F) Adenoma (AD) en un 24 meses de edad RF4-21 ratón hembra. (G-I) CHC en un 21 meses de edad RF2-390 ratón macho. Ampliación: B, E, H, × 50; C, F, I, × 200.
RBMY aceleró dietil nitrosamina inducida hepatocarcinogénesis
Los efectos promotores de tumores de RBMY se evaluaron adicionalmente en el modelo de carcinogénesis química. Debido a la alta susceptibilidad de los ratones macho a DEN, los grupos de machos fueron sacrificados a las 14 semanas después del tratamiento. Se observó una mayor incidencia de lesiones cancerosas en ratones macho transgénicos, en comparación con la del grupo control (12/14 vs. 5/12,
p
& lt; 0,05). A las 34 semanas después del tratamiento, RBMY ratones transgénicos macho desarrollaron más tumores con un diámetro & gt; 3 mm en comparación con el grupo control (52 frente a 19,
p Hotel & lt; 0,05) (Tabla 2). También había una mayor incidencia de lesiones cancerosas trabecular en ratones transgénicos femeninos en comparación con el grupo de control a las 26 semanas (7/9 vs. 1/10,
p
& lt; 0,01) y 34 semanas (9/10 frente a 3/13,
p
. & lt; 0,01) de tratamiento post DEN (Tabla 2) guía empresas
Discusión
RBMY es considerado como un empalme prueba específica factor en la espermatogénesis [22], [23]. Se ha informado que se expresa en más de un tercio de los tejidos macho HCC humanos [24]. Este estudio demuestra además que RBMY caída se correlaciona con el aumento de expresión variante AR45 y redujo el crecimiento de anclaje independiente y capacidades anti-apoptóticos de la línea celular de hepatoma humano HepG2. Se ha informado de AR45 isoforma de actuar como un inhibidor dominante negativo de la función de AR a través de la formación de heterodímeros AR-AR45 [13]. También demuestran que RBMY caída reduce la actividad de trans-activación de AR en las células HepG2. Por lo tanto, RBMY puede funcionar como un oncogén específico masculino y aumentar el riesgo de hepatocarcinogénesis masculina humana a través de la regulación de la expresión y la actividad del gen AR.
El gen AR, en lugar de andrógenos, se ha demostrado que desempeñan un papel clave en el predominio masculino de HCC en un modelo de ratón transgénico VHB [17]. AR humano está compuesto de N dominio de transactivación terminal, un dominio central de unión a ADN y un dominio de unión a ligando C-terminal. AR45, una forma variante natural de receptor de andrógenos humano, carece del dominio N-terminal requerido para la plena ligando activado actividad transcripcional [13]. La asociación inversa de AR expresión y AR45 se ha observado en corazón y los músculos tejidos humanos con los más altos niveles de AR45 y los niveles más bajos de AR [13]. En este estudio, RBMY desmontables aumenta la expresión de AR45 en la línea celular de hepatoma humano HepG2, mientras que la sobreexpresión RBMY reduce los niveles de AR45 en líneas de células Hep 3B y Huh7. Por otra parte, RBMY positivos masculinos humana HCC tejidos expresan niveles más bajos en comparación con AR45 HCC RBMY-negativo. La baja regulación de los genes diana AR IGF-1 y IGFBP-3 en células HepG2 RBMY desmontables ilustra además el efecto potenciador de RBMY sobre la actividad de trans-activación AR. proteína HBV X se ha informado para funcionar como un virus que codifica AR co-activador que contribuye significativamente a la predominancia masculina de HCC humano relacionado con el VHB [16]. Sin embargo, no se puede explicar la disparidad de género de HCC no relacionada con el VHB. proporción similar de expresión RBMY en relacionado con el VHB, relacionadas con el HCV, y Male relacionada no viral HCC sugiere que RBMY puede ser un factor de riesgo común aumento de la susceptibilidad macho para el cáncer de hígado. Nuestros resultados proporcionan un nuevo mecanismo interpretar el predominio masculino en todos los tipos de cánceres de hígado a través del gen RBMY-cromosoma específico Y.
El exón-AR45 específica 1B se encuentra entre el primero y el segundo exones del gen AR. Se han propuesto dos mecanismos de regulación hipotéticos para la síntesis AR45, incluyendo un control de la transcripción por un nuevo promotor corriente arriba del exón 1B o un evento splicing alternativo [13]. RBMY actúa como un regulador de empalme-testículo específica y, según informes interactúa con la proteína de unión al ARN Sam68 en el testículo [26]. Sam68 es un regulador de empalme en todas partes y también un objetivo corriente abajo de la vía de señalización Src [28], [29]. Es hasta el momento no está claro si o no RBMY ya sea directamente regula la transcripción AR45 /o empalme a través de la interacción con Sam68. Además, Sam68 se considera un co-activador de AR, ya que puede modular la actividad de AR transcripcional en los cánceres de próstata [25]. La vía de señalización de Src también ha demostrado ser crítico para el HBV X mejora mediada por proteínas de la función de AR [30]. Ya sea RBMY está implicada en la vía de señalización mediada por Src-Sam68 es un tema interesante para ser estudiado en el futuro.
El oncogenicidad de RBMY ha sido demostrado por la transformación de la línea celular de fibroblastos de ratón NIH3T3 [24]. Este estudio demuestra además que RBMY aumenta la carcinogénesis hepática
in vivo
en un modelo de ratón transgénico. Las tasas de crecimiento de tumores de hígado espontánea reportados son el 3% y el 0% en 24 meses de edad de tipo salvaje FVB /N ratones machos y hembras, respectivamente [31]. RBMY ratones transgénicos desarrolló tumores hepáticos en el 8,7% (2/23) de los varones y el 4,5% (1/22) de los ratones hembras mayores de 15 meses, que son más de 2 veces mayor que la incidencia de tumores de hígado espontáneas.
en el modelo de hepatocarcinogénesis DEN-inducida, la importancia de RBMY efecto de mejora en la formación de lesión cancerosa se observa ya en hasta 14 semanas después del tratamiento en ratones transgénicos machos. Además, los tumores más grandes (diámetro ≥3 mm) desarrollados en ratones macho transgénicos a las 34 semanas, lo que indica la mejora en RBMY hepatocarcinogenesis DEN-inducida. Incluso los ratones transgénicos RBMY femeninas también han aumentado significativamente la incidencia de las lesiones cancerosas en ambos 26 y 34 semanas después del tratamiento. Aunque los ratones hembra de tipo salvaje son resistentes a DEN carcinogénesis debido al efecto protector de la inhibición mediada por estrógenos de la producción de IL-6 por las células de Kupffer [32], [33], los resultados aquí demuestran la entrega y la activación de un varón específica RBMY gen acelera el desarrollo del cáncer de hígado, incluso en ratones transgénicos hembra.
en conclusión, RBMY caída provoca efectos inhibitorios sobre la transformación y la capacidad anti-apoptóticos de la línea celular de hepatoma humano HepG2. El efecto inhibidor de RBMY en los niveles de AR45 se demuestra en RBMY desmontables células HepG2 y células Hep 3B y Huh7 que sobre-expresan RBMY. Por lo tanto, el mecanismo oncogénico de RBMY puede estar relacionado con su regulación de la actividad de trans-activación AR por el aumento de la variante AR45, el inhibidor de la AR. AR45 expresión detectado en RBMY que expresan masculina humana HCC es también significativamente menor en comparación con los tejidos no expresan HCC. Además, RBMY muestra actividad promotora de tumores
in vivo
en un modelo de ratones transgénicos y acelera el desarrollo de lesiones neoplásicas en un modelo animal hepatocarcinogenesis diethylnitrosamine inducida. El efecto cancerígeno en la línea celular de hepatoma y HCC tejidos humanos, además de
in vivo
la promoción de tumores en los ratones transgénicos en, proporciona un nuevo papel de RBMY como un oncogén hombres concretos para explicar el predominio masculino de cáncer de hígado.
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