Extracto
Cambio en el huésped y /o virus del papiloma humano (VPH) el perfil de metilación del ADN es probablemente una de las principales factores responsables de la progresión maligna de las lesiones cervicales cáncer. Para investigar esos cambios se estudiaron 173 muestras cervicales con diferentes grados de lesión cervical, de normal a cáncer de cuello uterino. El estado de metilación de nueve promotores de genes celulares,
CCNA1
,
CDH1
,
C13ORF18
,
DAPK1
,
HIC1
,
RARβ2
,
hTERT1
,
hTERT2
y
TWIST1
, se investigó por metilación específica de la polimerasa Chain Reaction (MSP). La metilación de HPV18 L1-gen también fue investigado por MSP, mientras que las citosinas metiladas dentro de las cuatro regiones, L1, 5'LCR, potenciador, y el promotor del genoma HPV16 que cubre 19 sitios CpG se evaluaron mediante la secuenciación de bisulfito. biomarcadores de metilación estadísticamente significativas para distinguir entre lesiones precursoras cervicales de cuello uterino normal eran principalmente
C13ORF18
y en segundo lugar
CCNA1
, y aquellos distinguir el cáncer cervical a partir de lesiones cervicales normales o precursores eran
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
y
TWIST1
. Además, el análisis de metilación de sitios CpG individuales del genoma HPV16 en diferentes grupos de la muestra, en particular, los 7455 y 7694 sitios, demostró ser más importante que la frecuencia de metilación global. La mayoría de las muestras positivas HPV18 L1 contenida gen metilado y no metilado tanto, y muestras con formas metiladas genes L1-solo no tuvo mejor pronóstico cuando se correlacionó con los perfiles de metilación de genes promotores de la célula huésped. En conclusión, ambos biomarcadores de metilación celular y viral se deben utilizar para el seguimiento de la progresión de la lesión cervical para prevenir el cáncer de cuello uterino invasivo
Visto:. Milutin Gašperov N, Sabol I, Planinić P, G Grubišić, Fistonić I, Ćorušić A, et al. (2015) Cell Host metilado Tipo de genes promotores y virus del papiloma humano 16 y 18 Predicción de lesiones cervicales y cáncer. PLoS ONE 10 (6): e0129452. doi: 10.1371 /journal.pone.0129452
Editor Académico: Robert Dante, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Francia |
Recibido: December 24, 2014; Aceptado: May 8, 2015; Publicado: 9 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Milutin Gašperov et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia, Educación y Deportes (subvención 098-0982464-2510) croata. MG también fue apoyado por el Séptimo Programa Marco de la Unión Europea para la investigación, desarrollo tecnológico y demostración en virtud de acuerdo de subvención No 316289. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La relación entre el virus del papiloma humana (VPH) y el desarrollo de cáncer cervical (CC) está bien establecida. Hay al menos 15 tipos oncogénicos El VPH o de alto riesgo (HR), de los cuales los tipos 16 y 18 aportar hasta el 71% de los casos de cáncer [1]. En contraste, la metilación del ADN de genes celulares y virales, lo que resulta en el silenciamiento de la expresión génica, ha sido menos estudiado en la carcinogénesis cervical [2], a pesar de que es uno de los primeros acontecimientos de la carcinogénesis en muchos otros tipos [3] cancerosas. la metilación del ADN se produce a menudo en las citosinas en los dinucleótidos CpG de genes supresores de tumores para, factores de transcripción y los reguladores del ciclo celular inhibiendo de este modo la expresión del gen por el promotor silenciar [4].
La ocurrencia CC es relativamente rara comparada con la infección generalizada HPV ; la mayoría de las mujeres son probablemente infectadas con al menos uno si no varios tipos de VPH durante su vida sexual, y sólo una pequeña proporción se desarrollan lesiones precancerosas del cuello uterino y luego cáncer invasivo [5,6]. Los factores asociados con la progresión de las lesiones precancerosas del cuello uterino,
i
.
e
. infección por HPV subclínica con el cáncer no están bien establecidos. Tanto las células virales y del huésped genes pueden ser dirigidos por la maquinaria de metilación del ADN [4]. El hecho de que la metilación de genes celulares se puede detectar incluso en las muestras tomadas hasta siete años antes del diagnóstico de cáncer cervical [7], fue una de las razones de este estudio. Además, sobre la base de nuestra observación de los grupos metilo son estables durante años después de aislamiento del ADN y el almacenamiento a -20 ° C y en línea con el diagnóstico tomado sobre muestreo. Además, la metilación de genoma de HPV podría ser un mecanismo de defensa del huésped para la supresión de la transcripción del ADN o la estrategia exterior que el virus utiliza para mantener una infección a largo plazo por el escape immunosurveilance, o ambos [8,9]. La hipótesis de que la metilación de sitios CpG en HPV16 y HPV18 genomas que reprime la transcripción de genes de VPH es uno de los factores que son relevantes en la progresión posiblemente carcinógeno cervical. Por lo tanto, en este estudio, nos centramos en muestras cervicales HPV16 y HPV18 positivo y analizado la metilación de CpG de HPV16 y HPV18 genomas, así como varios genes clave células huésped.
Hay una fuerte necesidad de establecer diagnóstico y precisa perfil de metilación de pronóstico para un grupo de genes que podrían discriminar entre cérvix normal, lesiones del cuello uterino y el cáncer. Después de revisar la literatura se centra en el uso de esta materia conjunto de muestras similares y equipos de laboratorio [10-14], hemos reducido la elección de nueve genes celulares para ser investigados en este estudio:
CCNA1 gratis (CCNA1, ciclina A1) ,
CDH1 gratis (CDH1, cadherina 1, tipo 1, E-cadherina),
C13ORF18 gratis (KIAA0226L, KIAA0226-like),
DAPK1 gratis (DAPK1, asociada a la muerte proteína quinasa 1),
HIC1 gratis (HIC1, hypermethylated en el cáncer 1),
RARβ2 gratis (RARB, receptor de ácido retinoico, beta),
hTERT1
,
hTERT2 gratis (de TERT, la telomerasa transcriptasa inversa), y
TWIST1 gratis (TWIST1, familiares giro bHLH factor de transcripción 1). Metilación del promotor de
CCNA1
,
C13ORF18
y
RARβ2
conduce a la interrupción del ciclo celular, la metilación de
CDH1
,
DAPK1
,
hTERT1
,
hTERT2
y
HIC1
contribuir a la progresión del cáncer mediante el aumento de la proliferación, invasión y /o metástasis, mientras metilado
TWIST1
significa alteración celular diferenciación. El objetivo de este estudio fue determinar el perfil de metilación de los promotores de los genes de la célula huésped y al mismo tiempo el estado de metilación de HPV16 y 18 genomas para identificar la mejor metilación biomarcadores de diagnóstico y pronóstico de cambios cervicales.
Este es uno de los pocos estudios sobre una serie amplia colección de muestras cervicales con diagnóstico citológico diferente /histopatológico bien definido que analiza la metilación del ADN de varios promotores de genes celulares, así como HPV16 y HPV18 genomas. Estudios similares se han llevado a cabo por varios autores, pero ya sea en un número limitado de genes promotores celular o número limitado de tipos de VPH analizados [15-17].
Hay algunos datos de la literatura relevantes sobre el estado de metilación de genes celulares, la siguiente
CCNA1
,
CDH1
,
C13ORF18
,
DAPK1
,
HIC1
,
RARβ2
,
hTERT1
,
hTERT2
y
TWIST1 Hoteles en líneas celulares de cáncer de cuello uterino CaSki, SiHa y HeLa [12,18-20]. En este documento, los perfiles de metilación de los nueve promotores de genes probados en líneas celulares SiHa y CaSki confirmaron que todos los promotores de genes probados se metilado en CC. En la línea celular HeLa, sólo el
DAPK1
promotor no fue metilado. los perfiles de metilación de promotores de genes anteriormente mencionados se evaluaron en diferentes grupos de muestras: muestras con normalidad, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 y HSIL citología /CIN3, y CC histopatológicamente confirmado (Tabla 1). En el grupo de muestras con citología normal había 20,0% (8/40) HPV positivo con uno o más HR-HPV, de los cuales cuatro HPV16. La mayoría de las muestras se metilado en los promotores de genes más probadas.
fue encontrado CDH1
a ser metilado en la mayoría de los casos (82,5%), seguido por
HIC1 gratis (67,5%),
RARβ2 gratis (62,5%), y
DAPK1 gratis (55,0%). Puesto que se han encontrado altamente metilada en el cuello uterino normal, estos promotores de genes no son biomarcadores de metilación ideales para la carcinogénesis cervical. Contrariamente a nuestros resultados, Flatley
et al
. [21] encontró
CDH1
promotor metilado en muestras cervicales normales sólo el 2,3%. Por el contrario,
hTERT1
no metilado se encontró en todos los casos. El
hTERT1
promotor parece ser un biomarcador de metilación prometedora ser metilado en el cuello uterino normal. En cuanto a esto, hay hallazgos contradictorios de Iliopoulos
et al
. [22] encontró que el
hTERT1
promotor metilado en una mayor proporción del 26,6% en el cuello uterino normal. El hecho de que el perfil de metilación del
hTERT1
promotor sigue siendo relativamente baja en los cambios cervicales precursoras, a saber, LSIL /CIN 1 (12,5%), HSIL /CIN2 (5,1%) y HSIL /CIN 3 (7,1%), y aumentos en las muestras de CC (70,0%) favorece nuestra hipótesis (Tabla 1). Si bien, la dinámica de metilación similares ligeramente menos expresadas se observa con los
hTERT2 Opiniones y
TWIST1
promotores. En consecuencia, la hipermetilación de los tres promotores de genes,
hTERT1
,
hTERT2
y
TWIST1
podría ser un buen biomarcador del cáncer de cuello de útero, después de la confirmación de la piscina muestra más grande. En el grupo de muestras con diagnóstico de LSIL /CIN 1 hubo 55,0% de las muestras positivas (22/40) de VPH incluidos seis HPV16 y HPV18 y nueve. Los
CDH1
y
HIC1
promotores se metilado en la mayor proporción de casos (75,0%), ambos, mientras que
TWIST1
fue metilado en todos los casos. Por el contrario, Flatley
et al
. [21] han encontrado
CDH1
y
HIC1
promotores metilado en medida mucho menor en las muestras con el mismo diagnóstico, en el 1,8% y el 7,7% de los casos, respectivamente. En línea con nuestro hallazgo, alta
HIC1
metilación (67,6%) y completamente falta de metilación en
TWIST1
promotor dentro del mismo diagnóstico fue encontrado por Feng
et al
. [23]. VPH se detectó en 32 de 40 muestras (80,0%) con diagnóstico de HSIL /CIN2, incluyendo seis HPV16 y HPV18 siete. Debido a la conversión de bisulfito sin éxito en una muestra, el grupo de estudio incluyó a más de 39 muestras /CIN2 HSIL, que se clasifican específicamente como tal por la clasificación citología cervical croata, "Zagreb 2002" [24], con el fin de descifrar las diferencias sutiles entre LSIL y HSIL. Una vez más, la mayoría de las muestras se metilado en los promotores de genes más ensayadas,
CDH1 sobre ser metilado en la mayoría de los casos (79,5%), mientras que
hTERT2
fue metilado en todos los casos. Entre 42 muestras con H-SIL /CIN3 VPH diagnóstico se detectó en 36 muestras (85,7%), de los que 17 HPV16 y HPV18 cinco. Se observó el mayor número de casos metilados en el
CDH1 gratis (76,2%), y la más baja en el promotor de
hTERT2 gratis (2,4%). Otros autores informaron metilación de los mismos genes dentro del mismo grupo de muestra pero ligeramente diferentes porcentajes de metilación por cada promotor del gen [21,23]. Sin embargo, con respecto a la dinámica del perfil de metilación de estos dos promotores de genes, parece que
CDH1
promotor se hypermethylated constantemente, mientras que
hTERT2
promotor es mucho menos metilado de normal a lesiones cervicales de alto grado . En el grupo de CC hubo 81,8% (9/11) muestras positivas para el VPH-AR, de los cuales siete HPV16 y HPV18 uno. Una muestra de CC, en la etapa IV-A, muy necrótico, HPV-negativos y no metilado, ya sea en el promotor del gen se excluyó del análisis adicional. La mayor parte de los promotores de genes investigados se metilado en este grupo de muestra, que van desde el 60,0% para
DAPK1
a 100,0% para
CDH1
promotor. Entre diagnóstico CC
hTERT2
promotor fue metilado en el 60,0% de las muestras. En el caso de
hTERT
mayor expresión de los genes se consigue por hipermetilación. En el estudio de Kumari
et al
. [25] el tratamiento con 5-azacitidina y la consiguiente desmetilación de
hTERT
promotor llevó a la reducción en la expresión génica. Esto fue en contraste de lo que se ha observado para genes supresores de tumores convencionales. La posible explicación de este fenómeno es que la metilación de
hTERT
promotores es heterogéneo y que sólo los alelos no metilados se expresan [12]. De hecho, se observó que en el estudio de Zinn
et al
. [26] donde la mayoría de las líneas celulares de cáncer tenían
hTERT promotor
densamente metilado CpG, sino en todo el sitio de inicio de la transcripción de un número sustancial de
hTERT
alelos fueron metilado. En conclusión, la hipometilación en este documento se observa en el cuello uterino normal significa una menor expresión de
hTERT
de genes y la actividad de la telomerasa inferior. Esto puede explicar mejor pronóstico de los pacientes con CC cuyas células tumorales carecen de
hTERT
la metilación del promotor [27]. Los hallazgos de metilación del promotor de otros autores en muestras de CC se correlacionan bien con los nuestros. La metilación varía más del 65% de
hTERT
y
DAPK
promotores [22], el 41% de
DAPK
, y menos de
CDH1
,
HIC
y
RARβ
promotores [21]. Para un mayor número de promotores,
hTERT
,
CDH1
,
DAPK
,
HIC1
y
RARβ of the metilación varía incluso más, que van de 0 a 100% [27-29].
Aquí, hemos identificado cinco principales candidatos de biomarcadores de metilación,
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
, y
TWIST1
, cuyo estado de metilación del promotor de CC distingue normal y muestras HSIL /CIN3 (Tabla 2). La progresión de SIL de alto grado /CIN 1 a HSIL /CIN2 parece estar relacionado con una mayor metilación de
RARβ2
y
TWIST1
promotor, aunque la significación estadística es menor para los
RARβ2 gratis ( la prueba exacta de Fisher p = 0.024696) que
TWIST1 gratis (prueba exacta de Fisher p = 0,001030). La última etapa de cambios cervicales, CC parece caracterizarse por una alta metilación de
hTERT1
,
hTERT2
, y
TWIST1
promotor, y en menor medida en
RARβ2
promotor. También agrupamos lesiones precursoras del cuello del útero (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 y HSIL /CIN3) para evaluar las diferencias entre individuos normales, lesiones cervicales, y CC. En tal comparación
CCNA1
y
C13ORF18
promotores revelado para ser estadísticamente significativa en hypermethylated lesiones precursoras del cuello del útero en comparación con los cuellos uterinos normales (prueba exacta de Fisher p = 0.023742 0.022603 y, respectivamente). Además, la metilación de estos dos biomarcadores potenciales en comparación con los cuellos uterinos normales parece ser un evento temprano en la carcinogénesis cervical, con
C13ORF18
promotor metilado siendo estadísticamente significativa en LSIL /CIN 1 y H-SIL /CIN2 (prueba exacta de Fisher p = 0.036738 en ambos casos), mientras que
CCNA1
promotor metilado siendo estadísticamente significativa en HSIL /CIN3 (prueba exacta de Fisher p = 0,010994). Por lo tanto, estadísticamente significativas diferencias de metilación entre cuellos de útero, lesiones normales y CC se han observado durante cinco promotores de genes:
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
y
TWIST
. En resumen, los promotores de genes representan posibles buenos biomarcadores de metilación para la detección de cambios cervicales y podría ser útil en la práctica clínica. Parece que en la carcinogénesis cervical hay una cascada de metilación del ADN. Principalmente algunos promotores de genes están metilados, tales como
C13ORF18
seguido por
CCNA1
, y luego los demás, es decir,
hTERT1
,
hTERT2
y
TWIST1 gratis (figura 1)
LSIL, lesión intraepitelial de células escamosas de bajo grado.; SIL de alto grado, de alto grado de lesión intraepitelial de células escamosas; CIN, neoplasia intraepitelial cervical; ↑, hypermethylated; ↓, hypomethylated.
Otros autores determinaron algunos de los genes seleccionados como buenos marcadores biológicos, pero sobre todo como un único biomarcador para distinguir un diagnóstico particular. Por ejemplo, Yang
et al
. [13] se selecciona
CCNA1 Opiniones y
C13ORF18
como buenos biomarcadores de metilación para distinguir muestras con CIN2 + diagnóstico de las muestras normales. Kitkumthorn
et al
. [18] eligieron hipermetilación de
CCNA1
promotor como biomarcador para el diagnóstico precoz de CC invasivo, De Wilde
et al
. [12] escogieron al diferenciarse de metilación de
hTERT
para diagnosticar CC, mientras que Eijsink
et al
. [14] identificó
C13ORF18
y
de TERT, junto con
EPB41L3
y
JAM3
, como mejores biomarcadores de metilación de CC. Por lo tanto, de la literatura que es difícil determinar las mejores biomarcadores de metilación. En un estudio de todo el genoma con el método de Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip hemos confirmado el alto nivel de metilación de
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
y
TWIST1
promotores de CC en comparación con el tejido normal. Sin embargo, la agrupación jerárquica sin supervisión llevó a otro grupo de genes como biomarcadores candidatos,
RGS7
,
LHX8
,
STGALNAC5
,
TBX20
,
KCNA3
, y
ZSCAN18
[30], que no fueron evaluados en este documento. Además, en el mismo estudio [30], utilizando los conjuntos de datos de expresión de ARNm para la validación externa, hemos demostrado una buena coherencia entre los datos de la metilación del ADN y la matriz de la expresión génica. Por lo tanto, se puede concluir que la metilación del ADN es un buen predictor de la expresión génica; en consecuencia, las pruebas de metilación del ADN son buenas y suficientes opciones para mejorar el diagnóstico, estadificación y pronósticos en la investigación clínica debido a la ventaja de costes y tiempo durante el análisis de la expresión génica.
También investigó el estado de metilación de CpG de HPV16 y HPV18 genomas en correlación con citológico diagnóstico /histopatológico y el estado de metilación de genes celulares. Los patrones de metilación del genoma de HPV16 se ha analizado mediante secuenciación de bisulfito para cada uno de 19 sitios CpG debido a datos de la literatura discrepantes. Como era de esperar, los patrones de metilación de genoma HPV16 en 12 muestras con diferentes diagnósticos, correlacionados con los de la línea de células SiHa (S1 Tabla). La mayoría de los CpG metilados en el genoma HPV16 de células SiHa se detectaron en L1 y la región promotor, mientras que la mayoría de los CpG no metilados en la región 5'LCR y potenciador (Fig 2). A menudo, se encontraron dos copias de HPV16, metilado y no metilado en todos los diagnósticos que van desde los cuellos uterinos normales al cáncer de cuello de útero, en el que los perfiles de metilación de las muestras de CC eran muy similares a una de las líneas de células SiHa. En casi todas las muestras con citología normal (N) el perfil de metilación era diferente de los de las células SiHa y muestras de CC. Los tres grupos de muestras con cambios precursoras cervicales (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 y HSIL /CIN3) tenían perfiles de metilación HPV16 muy similares. Debido a esta similitud del patrón de metilación, los tres cambios precursoras cervicales se muestran juntos en la figura 3B. Además, todos los sitios CpG que fueron metilados y no metilados en la misma muestra se presentan como metilado (Fig 3). Nuestros resultados apoyan los hallazgos de Kalantari
et al
. [31] que el genoma del VPH es normalmente hypermethylated y necesita sólo una copia para ser transcripcionalmente activo. Por otra parte, tal como se presenta en este documento, para un buen biomarcador de metilación es más importante para determinar con precisión el porcentaje de metilación de sitios CpG específicos dentro del genoma HPV16 que la metilación total en los diferentes grupos de muestra. Aquí, hemos observado que el grupo de lesiones precancerosas del cuello uterino tenido la tasa de metilación total más bajo (33%), mientras que las muestras con citología normal y CC tenían 53% de tasa de metilación global, ambos. Estos resultados son parcialmente en desacuerdo con las conclusiones de otros autores que afirman que la metilación de HPV16 es el más bajo de lo normal y la más alta en las muestras de CC [17,32,33]. En este estudio, a partir de la piscina de 19 sitios CpG examinados de genoma HPV16, dos parecen ser los más significativos, CpG 7455 (5'LCR) y CpG 7694 (potenciador), en el que se encontró la completa falta de metilación en muestras de carcinoma y la línea celular SiHa, mientras estaban altamente metilados (100% de cérvix normal y el 83% de las lesiones precursoras en CpG 7455) y moderadamente metilado (75% de cérvix normal y el 33% de las lesiones precursoras en CpG 7694) en otros grupos de la muestra. Además, los CpG en las posiciones 7434 y 7461 se metilado en el 50% de las muestras con citología normal, pero no se observó metilación en las lesiones precursoras, CC o línea celular SiHa. En contraste, el 31 de CpG metiladas sólo en muestras de CC (50%) y la línea celular SiHa. CpG en las posiciones 37 y 52 se metilado en 75% de las muestras con citología normal y el 100% de las lesiones precursoras, CC y línea celular SiHa. CpG 58 fue metilado en 50% de las muestras con citología normal y 100% de las lesiones precursoras y CC, así como en la línea celular SiHa. La metilación no se observó en los CpG en las posiciones 7535 y 7862 en ninguno de las muestras o línea celular SiHa. Por el contrario, CpG 7682 fue metilado en todas las muestras examinadas, las lesiones cervicales precursoras, CC y la línea celular SiHa (Figs 2 y 3). Diferentes frecuencias de metilación del genoma dentro de HPV16 en los mismos sitios CpG de nuestros resultados y conclusiones diferentes han sido reportados por Kalantari
et al
. [34]. Sin embargo, los resultados similares en los perfiles de metilación de CpG en muestras de CC a los nuestros se identificaron en el estudio de Bhattacharjee y Sengupta [35]. Por lo tanto, la falta completa o baja metilación CpG en 5'LCR y potenciador, en lugar de en la región de promotor es crucial para la actividad HPV y en consecuencia la inmortalización de las células huésped
N, citología normal.; Yo, el diagnóstico de LSIL /CIN 1; II, LSIL /diagnóstico CIN2; III, H-SIL /diagnóstico NIC3; CC, cáncer de cuello uterino; SiHa, línea celular de cáncer de cuello uterino; M, metilada; U, no metilada; M + U, metilado y no metilado con ADN metilado predominantemente; T + M, metilado y no metilado con el ADN no metilado predominantemente
cérvix normal (N = 40).; lesiones precursoras del cuello del útero, LSIL /CIN 1, H-SIL /CIN2 y HSIL /CIN3 (N = 121); muestras de carcinoma de cuello uterino (N = 10). sitios CpG que estaban metilado y no metilado en la misma muestra se presentan en este documento como metilado.
La investigación de HPV18 L1-metilación de genes en 22 muestras (S1 tabla) por el método de MSP se observó que se correlaciona con la citológico /diagnóstico histopatológico, y puede predecir mejor pronóstico de la enfermedad. En particular, la mayor parte de las muestras analizadas y línea celular HeLa contenía formas tanto metilados y no metilados de HPV18 L1-gen (Tabla 3). El hecho es que el gen L1-permanece intacto en las lesiones cervicales y muestras de cáncer, incluso cuando genoma HPV integra en una célula huésped [36]. La metilación del gen HPV18 L1-cervical en lesiones precursoras y las muestras de CC estaba en línea con el diagnóstico y el perfil de metilación de la línea de células HeLa. En particular, las muestras que contienen sólo forma metilada de HPV18 L1-gen tenían mejor pronóstico;
i
.
e
. en esas muestras de genes celulares se metilado en menor medida y en su mayoría los que no se ha demostrado estadísticamente como biomarcadores potenciales. Turan
et al
. [37,38] también encontraron dos copias de HPV18 en línea de células HeLa, y el excedente de forma metilada, mientras que la hipermetilación del VPH 18 L1 en todos los carcinomas y la falta de metilación en la mayoría de los frotis asintomáticos y lesiones de bajo grado. Por otra parte, Badal
et al
. [39] han declarado que la hipermetilación del genoma HPV18 en la línea celular HeLa y CC muestras indican que el VPH es de hecho el blanco de la maquinaria de metilación del ADN celular que puede afectar a la transcripción de genes tarde y temprano.
Los estudios futuros deben validar la metilado uso de HR-HPV como un biomarcador predictivo de diagnóstico y /o por el riesgo de cáncer de cuello uterino en las mujeres VPH positivas [32,40,41]. En particular, los cebadores para MSP genoma HPV16 que cubren los CpG 7455 y 7694 deben ser diseñados con el fin de evitar el costoso y consume tiempo secuenciación de bisulfito, y, como tal, simplificar las aplicaciones clínicas. Nuestro examen de las pruebas de VPH genoma metilación junto con la prueba de metilación de genes celulares como triaje de las mujeres con alto riesgo de desarrollar cáncer de cuello uterino también se ya se ha discutido [10,27,42], pero la pregunta sigue siendo qué tipos de VPH, que las regiones del genoma del VPH y que los genes celulares para analizar. Creemos que los resultados presentados en este estudio, después de la confirmación implícita en un número mayor de muestras, podrían resolver esos problemas. Por lo tanto, sugerimos que todas las mujeres HR-HPV-positivas se hagan la prueba para la metilación del
CCNA1
,
C13ORF18
,
hTERT1
,
hTERT2
y
TWIST1
los promotores, así como al menos HPV16 CpG 7455 y 7694, y los sitios de metilación del gen HPV18 L1-. Los resultados de las pruebas deben ser correlacionados, y en caso de aumento de la metilación de genes candidatos de biomarcadores y cambiaron el perfil de metilación de HPV16 y 18 mujeres genoma debe ser administrado y posteriormente un seguimiento más a fondo (figura 1). Además, sobre la base de un conocimiento real de la metilación del ADN celular y viral del posible uso de drogas desmetilación [27,43], como los inhibidores de la DNA methyltransferases podrían ser consideradas como agentes terapéuticos, pero debe aplicarse con gran precaución.
Materiales Métodos y
grupo de estudio
El grupo de estudio incluyó 173 muestras cervicales de mujeres con citología normal, lesiones precancerosas (lesiones escamosas intraepiteliales de células, de bajo grado, y L-SIL de alto grado, HSIL),
i
.
e
. neoplasia intraepitelial cervical (CIN) de grado 1 a 3, clasificadas de acuerdo con "Zagreb 2002", que está en línea con "NCI Sistema Bethesda 2001" [24], y el estudio histopatológico confirmó CC [44]. Desde la piscina de muestras recogidas para el diagnóstico regulares en el Instituto Rudjer Boskovic, Zagreb, 40 muestras con citología normal, 40 con LSIL /CIN 1, 40 con HSIL /CIN2 y 42 muestras con H-SIL diagnóstico /CIN3 se tomaron al azar para los análisis de metilación. Además, se tomaron muestras (8 de carcinoma de células escamosas y 3 de adenocarcinoma) 11 cc con cytobrush justo antes de los procedimientos quirúrgicos.
se obtuvo Ética Declaración
Verbal consentimiento del paciente /participante para cada espécimen cervical que se recogió tanto para fines de diagnóstico y de investigación de HPV. Escrito el consentimiento del paciente /participante no era necesario, ya que cada muestra cervical se acompaña de los formularios de solicitud de servicios de laboratorio, los cuales tienen que ser firmado y aprobado por el médico en ejercicio que es responsable del consentimiento del paciente /participante verbal (registrado por el médico en el Laboratorio las formas de solicitud de servicio). Por lo tanto, sólo las muestras de pacientes /participantes que aceptaron verbalmente se incluyeron en este estudio. Los datos pertinentes a los pacientes (edad, diagnóstico citológico, detección de VPH y tipificación de resultados) y el ADN extraído fueron codificados y procesados adicionalmente de forma anónima en el laboratorio. El estudio se realizó dentro del proyecto de investigación "metilación aberrante del ADN del VPH en las lesiones asociadas" (Grant 098-0982464-2510 apoyado por el por el Ministerio croata de Ciencia, Educación y Deportes), el cual fue aprobado, así como el procedimiento de recogida de muestras por el Consejo de ética del Instituto Rudjer Boskovic, y la Junta de ética de las Hermanas de Mercy hospital y clínica del hospital Centro de Zagreb que está en línea con la Declaración de Helsinki (DOH /Oct2008).
preparación de ADN
ADN de muestras cervicales se aisló en el BioRobot EZ1 (Qiagen, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la extracción del ADN, el ADN purificado se disolvió en 50 a 100 l de tri-destilado agua estéril y se almacenó a -20 ° C hasta su posterior análisis. Cada ADN se analizó espectrofotométricamente y visualmente en la electroforesis en gel de agarosa al 1%, y se visualizó por irradiación UV en Alliance 4,7 (UVItec Cambridge, Reino Unido) [45].
detección de VPH y genotipado
Detección y genotipado del virus del papiloma humano fue descrito previamente por Milutin-Gasperov
et al
. [46] En resumen, tres conjuntos de cebadores consenso (PGMY09 /PGMY11, L1C1 /L1C2-1 /L1C2-2 y GP5 + /GP6 +) se utilizaron para la detección del VPH, y los cebadores específicos de tipo para el genotipado del VPH de los tipos 6/11, 16 , 18, 31, 33, 45, 52 y 58. Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio.
Las líneas celulares
Los ADN aislado a partir de células CC HPV16 positivo líneas, CaSki (ATTC CRL-1550) y SiHa (ATCC HTB-35), y HPV18 positivo, HeLa (ATTC CCL-2), se utilizaron como controles positivos de los perfiles de metilación aberrante de genes celulares y respectivos genomas de VPH. células CaSki contienen un genoma de HPV16 integrado (alrededor de 600 copias por célula), así como secuencias relacionadas con HPV18. células SiHa contienen un genoma de HPV16 integrado (de 1 a 2 copias por célula), mientras que las células HeLa contienen secuencias de HPV18.
conversión de ADN bisulfito
ADN de muestras cervicales se modificó con bisulfito de sodio usando EpiTect bisulfito Kit (Qiagen, EE.UU.) y después se purificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, todas las citosinas no metiladas se convierten en uracilo mediante tratamiento con bisulfito, mientras que las citosinas metiladas permanecen sin cambios.
génica en células de anfitrión promotores determinación metilación
Los perfiles de metilación de
CCNA1 gratis ( cromosoma 13: 36432177-3643232),
CDH1 gratis (cromosoma 16: 68737114-6.873.722),
C13ORF18 gratis (cromosoma 13: 46387345 hasta 4.638.746),
DAPK1 gratis (cromosoma 9 : 87497883-87497981),
HIC1
cromosoma 7: 19.117.831 a 19.118.031,
RARβ2 gratis (cromosoma 3: 25428191-2.542.842),
hTERT1 gratis (cromosoma 5: 1.295.019-1295259 ),
hTERT2 gratis (cromosoma 5: 1294824 a 1295014) y
TWIST1 gratis (cromosoma 7: 19117831-19118031) se identificaron genes promotores. Gen estado de metilación del promotor se obtuvo por metilación de la polimerasa específica de la reacción en cadena (MSP) con cebadores específicos para las formas metiladas de los promotores de genes. El mismo método se utiliza para la detección de formas metiladas de los mismos promotores de genes, excepto para el
C13ORF18
promotor. La positividad de las muestras con las formas metiladas de los promotores de genes sirvió como control interno, ya que los frotis cervicales contienen mezclas de células con diverso estado de metilación de los promotores de genes de acogida [17]. La forma y condiciones MSP para los genes seleccionados ya fueron descritos por Yang
et al
. [13,47], Feng
et al
. [23], Kitkumthorn
et al
. [18], y Dessain
et al
. [19], pero las condiciones se modificaron en la mayoría de los casos en el presente documento. Brevemente, 5 min de desnaturalización a 95 ° C fue seguido por 45 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, hibridación a 56 a 61 ° C durante 30 s, alargamiento a 72 ° C durante 50 años, y la extensión final 7 min a 72 ° DO. La temperatura de recocido variado con diferentes cebadores: 56 ° C para
hTERT1 gratis (U, cebadores metilados) y
TWIST1
(m, cebadores metilados), 58 ° C durante
CCNA1
(M) y
CCNA1 gratis (U), 59 ° C durante
CDH1 gratis (U),
C13ORF18 gratis (M),
DAPK1 gratis (