Extracto
proteína de choque térmico 70 cognado (Hsc70) actúa como una chaperona molecular para el mantenimiento de las proteínas intracelulares, que permite a las células cancerosas para sobrevivir bajo estrés proteotoxic. Hemos tratado de utilizar Hsc70 para identificar moléculas clave en la supervivencia de las células cancerosas. A continuación, se realizó un análisis de la proteómica basada en la espectrometría de masa utilizando la purificación por afinidad con anticuerpos anti-Hsc70; Como resultado, 83 proteínas expresadas diferencialmente se identificaron bajo condiciones de estrés. Este resultado implica que hubo un cambio en las proteínas con las que Hsc70 interactuó en respuesta al estrés. Entre las proteínas identificadas en ambas condiciones tratados con 5-fluorouracilo suero empobrecido y, Rab1A se identificó como una molécula esencial para la supervivencia de células de cáncer. Hsc70 interactuó con Rab1A de una manera dependiente de chaperona. Además, Hsc70 desmontables disminuyó el nivel de Rab1A y aumentó el nivel de su ubiquitinación bajo condiciones de estrés, lo que sugiere que Hsc70 prevenirse la degradación de Rab1A desnaturalizado por exposición al estrés. También se encontró que Rab1A caída la muerte celular inducida por la inhibición de la formación de autofagosoma. Por lo tanto, Rab1A puede contribuir a la superación de los insultos proteotoxic, que permite a las células cancerosas para sobrevivir bajo condiciones de estrés. Análisis de los interactores Hsc70 proporcionó información sobre los cambios de estado intracelular. Esperamos que el estudio adicional de la interactoma Hsc70 para proporcionar una comprensión más completa de la fisiología de las células cancerosas
Visto:. Tanaka M, Mun S, Harada A, Ohkawa Y, Inagaki A, Sano S, et al. (2014) Hsc70 Contribuye a la célula de supervivencia del cáncer mediante la prevención de la degradación de Rab1A bajo condiciones de estrés. PLoS ONE 9 (5): e96785. doi: 10.1371 /journal.pone.0096785
Editor: Ram Nagaraj, Case Western Reserve University, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Octubre, 2013; Aceptado: April 11, 2014; Publicado: 6 Mayo 2014
Derechos de Autor © 2014 Tanaka et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo, en su totalidad o en parte, por la JSPS KAKENHI (http://www.jsps.go.jp/english/index.html) Grant números 24650637 (Masayuki Shiota) y 23650617 (Hiroshi Iwao), y Grant-in- Ayuda para el JSP Fellows (24 a 2543 para Masako Tanaka). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la proteína de choque térmico 70 familiares (Hsp70s) es un conocido grupo de las chaperonas moleculares que apoyan la síntesis de proteínas
in vivo
, ayudar en el plegado de polipéptidos nacientes, y prevenir la formación de agregados al detener las interacciones no específicas [1], [2]. En la presencia de proteínas mal plegadas y desnaturalizadas, Hsp70s también facilitar su replegamiento o, en el caso de las proteínas irreparablemente con discapacidad, su eliminación por la maquinaria de degradación de la proteína de la célula [3] - [5]. Hsp70s se expresan a un alto nivel en células de cáncer y juegan un papel en el mantenimiento de la homeostasis de la proteína, que promueve el crecimiento de células de cáncer y la supervivencia [6], [7]. También se conocen Hsp70s estar involucrado en el desarrollo de tumores, incluyendo metástasis, invasión, y la resistencia a fármacos [8] - [11]; como tales, varios inhibidores dirigidos Hsp70s se han desarrollado como agentes anti-cáncer [12] - [15]
Hsc70 es una chaperona molecular expresada constitutivamente que pertenece a la familia Hsp70.. Tiene algunas similitudes estructurales y funcionales a Hsp72. Sin embargo, Hsc70, que no es inducido por choque térmico u otras tensiones, mantiene la homeostasis de proteínas tanto en condiciones normales y de estrés, mientras que inducible por estrés Hsp72 es importante para permitir que las células para hacer frente a estrés agudo. Hsc70 se informa de estar involucrado en una multitud de limpieza chaperones funciones, incluyendo el plegamiento de polipéptidos nacientes, la translocación de proteínas a través de membranas, la autofagia chaperona mediada, la prevención de la agregación de proteínas en condiciones de estrés, y el desmontaje de vesículas revestidas de clatrina [16 ]. Por lo tanto, los ratones knockout Hsc70 no pueden ser creados por el papel esencial de esta proteína en la supervivencia celular [17].
Las células de cáncer experimentan múltiples tensiones microambientales, como la hipoxia, la privación de nutrientes, y la exposición a agentes quimioterapéuticos [18 ] - [21]. Además, las células malignas sufren de tensiones internas, tales como la acumulación de proteínas mutadas e incorrectamente plegadas y la actividad inapropiada de las vías de señalización desreguladas, que también amenazan su supervivencia [22]. Por lo tanto, las células cancerosas necesitan para superar el estrés proteotoxic que surge por la acumulación intracelular de proteínas mal plegadas. Similar a Hsp72, la expresión de Hsc70 es mayor en algunas líneas celulares de cáncer que en las normales [23]. Aunque Hsc70 se sobreexpresa en las células cancerosas, se sabe poco acerca de cómo Hsc70 contribuye a la supervivencia de células de cáncer en comparación con Hsp72. En condiciones normales de crecimiento, citoplásmica Hsc70 puede moverse dentro y fuera del núcleo. Sin embargo, se concentra en el núcleo cuando las células están expuestas a tensiones tales como choque de calor. Este Hsc70 nuclear luego se traslada al citoplasma durante la recuperación [24], [25]. El calor también fue mostrado para inducir la rápida Hsc70 unión a estructuras citoplásmicas insolubles que son distintos de citoesqueleto y la membrana interna de la célula [26]. por lo tanto, Hsc70 actúa rápidamente en respuesta a estrés, pero se expresa constitutivamente. También hay un cambio en las proteínas con las que Hsc70 interactúa con la exposición al estrés. En condiciones proteotoxic, la función de Hsc70 en la asistencia de plegado cotraduccional se interrumpe y esta molécula en vez facilita la reparación de proteínas mal plegadas [27]. Por lo tanto, proteínas cliente Hsc70 son importantes para la homeostasis celular y son moléculas esenciales en las respuestas al estrés. Dado que se requiere Hsc70 para el plegamiento de proteínas cliente, sus proteínas cliente bajo condiciones de estrés son moléculas potencialmente clave para la supervivencia de las células cancerosas.
En este estudio, se realizó en masa basado en la espectrometría de análisis de proteómica utilizando la purificación por afinidad con anticuerpos anti-Hsc70 para Hsc70 interactoma perfiles de la línea celular de cáncer de colon humano HT29. Mediante la comparación de los perfiles de proteínas cliente Hsc70 entre las condiciones normales y de estrés, hemos identificado las moléculas que son potencialmente crítico para la supervivencia de las células cancerosas.
Materiales y Métodos
Anticuerpos primarios y productos químicos
Los anticuerpos contra Rab1A, ubiquitina, Hsp72, y p62 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra todas las formas de poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1) y las formas escindidas de la caspasa-3 se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra el anticuerpo β-actina y LC3B fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). El anticuerpo anti-Rab1B se adquirió de Abgen (San Diego, CA). anticuerpos secundarios conjugados con HRP fueron adquiridos de GE Healthcare Bio-Science (Little Chalfont, Bucks, Reino Unido). Dos anticuerpos anti-Hsc70 diferentes utilizados en la purificación por afinidad fueron producidas en nuestro laboratorio [25], y el anticuerpo anti-Hsc70 utilizado en los otros experimentos se adquirió de Enzo (Farmingdale, NY). MG132 se adquirió de Sigma (St. Louis, MO). 5-fluorouracilo (5-FU), y brefeldin A (BFA) se obtuvieron de Wako (Osaka, Japón), diluido en sulfóxido de dimetilo (DMSO), y se almacenó a -20 ° C.
Cultivo de células y Tratamientos experimentales
La línea celular de adenocarcinoma de colon humano HT29 se adquirió de DS Pharma Biomédica (Osaka, Japón) y se mantuvo en medio 5A de McCoy (Invitrogen) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml penicilina, y 100 U /ml de estreptomicina en una incubadora humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células se pasaron cada siete días cuando se acerque a la confluencia. Las células se trataron con 3,2 M (IC
50 a 48 h) 5-FU o sin FBS (agotamiento de suero) durante seis horas. Para la proteómica en masa a base de espectrometría, se usó 10 mM 5-FU. Todos los tratamientos se realizaron a una concentración final de 0,1% DMSO.
inmunotransferencia e inmunoprecipitación
Las células se lisaron en tampón RIPA, y las proteínas se aislaron a partir de lisados de células por inmunoprecipitación como se describe anteriormente [28] . Para la inmunotransferencia, las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras, seguido por transferencia electroforética a membranas de PVDF como se describe anteriormente [29]. Se detectaron las membranas con LAS-4000 sistema de análisis lumino-imagen (GE Healthcare Bio-Science) utilizando la técnica de quimioluminiscencia (Immobilon occidental HRP Sustrato; Millipore).
Aislamiento y análisis de proteínas Proteómica Hsc70 cliente
para el análisis de espectrometría de masas, las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 1% a temperatura ambiente durante 20 min, seguido de inactivación con glicina 125 mM. Las células fijadas se lisaron en tampón RIPA que consiste en 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, mM NaF 100, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, DTT 0,2 mM, y cóctel inhibidor de la proteasa. Los lisados celulares (1 mg de proteína) fueron limpieza previa con cuentas inactivas NHS-Sepharose (GE Healthcare Bio-Science) durante una hora a temperatura ambiente y se inmunoprecipitaron con dos tipos de anticuerpos en el local específicas para HSC70 inmovilizado sobre NHS-Sepharose activada en la sala temperatura durante dos horas. Los inmunoprecipitados se lavaron tres veces con tampón RIPA, y se sometieron a desalinización y concentración por SDS-PAGE en un gel de gradiente de poliacrilamida al 5-20% (Wako), seguido por tinción con Quick-CBB (Wako). El gel se cortó en rebanadas de aproximadamente 1 mm de espesor por carril. Las piezas de gel se destiñeron en NH mM 25
4HCO
3 y 50% de acetonitrilo, seguido de decoloración adicional en NH 25 mM
4HCO
3, 30% de acetonitrilo, y la reducción en NH 25 mM
4HCO
3 que contenía DTT 10 mM a 56 ° C durante una hora. Los residuos de cisteína reducidos fueron posteriormente alquilada en 55 mM de yodoacetamida en 25 mM NH
4HCO
3 y luego las piezas de gel se lavaron en acetonitrilo y se secaron. Las piezas de gel secas se trataron con 10 mg /ml de tripsina (tripsina oro; Promega, Madison, WI) en mM NH 50
4HCO
3 en hielo durante 30 min, se eliminó el exceso, y se dejó que la digestión completa que se produzca a 37 ° C durante 18 h en 50 mM NH
4HCO
3. Las muestras se desalaron usando Zip Tip C18 (Millipore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. a continuación, se añadió ácido trifluoroacético a una concentración final de 0,1% y se utiliza para el análisis de nano-cromatografía líquida de ionización por electrospray-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS /MS).
nanoelectropulverización LC-MS /MS y análisis identificación de proteínas
análisis LC-MS /MS se realizaron en un sistema nano LC Dina-AI (KYA Technology, Tokio, Japón) acoplado a un espectrómetro de masas híbrido QSTAR Elite (AB Sciex, Concord, Ontario, Canadá) a través de una fuente de iones de nanopulverización (AB Sciex). Los detalles de este análisis se describen en otra parte [30]. La adquisición de datos se realizó mediante QS analista de software 2.0 (AB Sciex) en el modo de iones positivos. Ambos conjuntos de datos fueron procesados por ProteinPilot usando el algoritmo de búsqueda Paragon ™ (AB Sciex). MS /MS datos fueron utilizados como una consulta de búsqueda en la base de datos NCBI (RefSeq liberación 55, septiembre de 2012, ftp://ftp.hgc.jp/pub/mirror/ncbi/refseq/) usando un
Homo sapiens
filtro de taxonomía. El umbral mínimo para la identificación de proteínas se fijó en una puntuación de proteína de 0,47, lo que corresponde a un nivel de confianza mayor que 66% y una tasa de falso descubrimiento del 1%.
iTRAQ Etiquetado y cuantificación de la expresión de la proteína
Las proteínas de control o células Rab1A-silenciado se extrajeron como se describe para la inmunotransferencia. Los lisados celulares se concentraron y el tampón de disolución (100 mM de bicarbonato de trietilo-amonio, pH 8,0) fue sustituido con Microcon filtros centrífugos con un peso molecular de la membrana límite de ultrafiltración nominal 3 K, seguido de digestión y etiquetado con 4-plex reactivos iTRAQ de acuerdo con procedimientos estándar [31]. Las muestras fueron etiquetadas como sigue: 114, control de caída; y 115, Rab1A caída. Cada muestra contenía 100 g de proteína. Las concentraciones de proteína se midieron mediante ensayo de proteína BCA.
ARN de interferencia
Todos los siRNAs contra humana
Hsc70 gratis (
HSPA8
),
Rab1A
, y
Ran
, y el número de control negativo silenciador 1 siRNA (control) se obtuvieron de Invitrogen. Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) se utilizó para revertir-transfectar siRNAs en células (concentración final, 30 nm o 10 nm) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
MTS Ensayos
siRNA células transfectadas fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 o 1 × 10
5 células por pocillo. Después de 48 h de la transfección, las células se cultivaron con medio de suero empobrecido o con 5-FU (3,2 M) durante 24 h. La viabilidad se determinó mediante el ensayo con Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón). Se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.
Apoptosis Ensayo
células siRNA transfectadas se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 10
4 células por pocillo . Después de 48 h de la transfección, las células fueron sometidas a agotamiento de suero o tratamiento con 5-FU durante 24 h. Las células apoptóticas se identificaron por tinción nuclear con Hoechst 33258 después de la fijación con glutaraldehído al 0,5% durante cinco minutos a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se montaron con fluorescencia medio de montaje (Dako, Glostrup, Dinamarca). Las células teñidas se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia. (Biozero; Keyence, Osaka, Japón) con un objetivo seco de 20 ×
Preparación de ARN y análisis en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
Total se aisló ARN de Hsc70- o Rab1A-caída, o células de control desmontables usando reactivo ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japón). a continuación, la transcripción inversa se realizó usando 1 g de ARN y un Master Mix ReverTra Ace qPCR TA con gDNA Remover (Toyobo, Osaka, Japón). En tiempo real el análisis de PCR se llevó a cabo utilizando un Sistema de 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) con el kit LightCycler FastStart DNA-Maestro SYBR Green I (Roche, Penzberg, Alemania). El nivel de ARN se normalizó utilizando
GAPDH
. Todos los datos se analizaron mediante comparativo C
T utilizando 7500 Software ver. 2.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Cell Growth IncuCyte Medición Ensayo
Cuarenta y ocho horas después de la transfección siRNA, un total de 5 × 10
4 células HT29 se sembraron en placas de 24 pocillos. las células no transfectadas se trataron con 5 mg /ml BFA o DMSO en el inicio de la medición. La placa se incubó en un sistema de imagen cinética IncuCyte (Essen BioScience, Ann Arbor, MI) en el interior de una incubadora de cultivo celular. Las imágenes fueron capturadas en cuatro campos por así cada tres horas para controlar la proliferación.
Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media ± S. D. Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante análisis unidireccional de la varianza. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a
p
. & Lt; 0,05
Resultados
Hsc70 es crítica para la supervivencia de la célula del cáncer
Para investigar la contribución de Hsc70 de supervivencia de las células HT29, se realizó el ensayo de MTS en Hsc70 desmontables células (Fig. 1A). En comparación con el control, Hsc70 knockdown disminución de la viabilidad celular, que era independiente de la intensidad de tensiones. Aunque las células HT29 fueron particularmente resistentes a la privación de suero, Hsc70 caída aumenta la sensibilidad a la privación de suero y condujo a la muerte celular (fig. 1B y Fig. S1). A pesar de la posterior inducción de Hsp72 como una respuesta de estrés adaptativo (Fig. 1C), Hsp72 no a prevenir la muerte celular inducida por Hsc70 caída. Por lo tanto, Hsc70 es crítico para la supervivencia celular y Hsp72 no pudo compensar completamente su pérdida.
(A) Derribo de Hsc70 disminución de la viabilidad de las células cancerosas. células HT29 fueron transfectadas con siRNA para
Hsc70
o control de mezcla aleatoria. A las 48 h después de la transfección de ARNsi, las células fueron sometidas a privación de suero o fueron tratados con 5-FU a la concentración indicada por 48 h. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTS. Los puntos de datos representan la media ± S.D. (N = 5). (B) Efecto de Hsc70 caída en la morfología celular. Hsc70 o células de control desmontables fueron tratados de la misma forma que en
Un
. imágenes de contraste de fase de células en condiciones de suero alimentados con o sin suero 24 horas después de los tratamientos. Barra de escala, 200 micras. (C) Hsc70 caída indujo la expresión de Hsp72 compensatoria. A las 48 h después de la transfección de ARNsi, desmontables células o de control Hsc70 fueron sometidas a agotamiento de suero durante 6, 12, o 24 h. Después de la lisis celular, Hsc70 y Hsp72 se detectaron por inmunotransferencia. SD, el agotamiento de suero.
Los análisis de Hsc70 Interactianos identificados en suero empobrecido y tratado en 5-FU Las células HT29
Como una variedad de tensiones inducir la acumulación intracelular de mal plegada y se desnaturalizó proteínas, Hsc70 se une y se repliega estas proteínas dañadas. Esta función de Hsc70 permite a las células sobrevivir en circunstancias de tensión proteotoxic. Por lo tanto, hemos intentado analizar interactores Hsc70 bajo condiciones de estrés con el fin de identificar las moléculas clave para la supervivencia de las células cancerosas. Un diagrama de flujo de la identificación de los interactores Hsc70 se muestra en la Fig. 2A. células HT29 fueron expuestos a la depleción de suero o 5-FU, y también tratados con DMSO como un control de vehículo para 6 h. Perfilado de interactores hsc70 en las células de cáncer se llevó a cabo por aislamiento usando perlas de afinidad Hsc70, seguido de la identificación basada en espectrometría de masas. Un total de 124 proteínas únicas se identificaron en & gt; 95% de confianza (Fig. 2B y el cuadro S1). De éstos, 41 proteínas únicas para el control del vehículo estaban involucrados en los procesos homeostáticos normales. Ontología de genes (GO) el análisis reveló que estas proteínas estaban involucrados en la producción de energía mitocondrial, el citoesqueleto, y la síntesis de proteínas. Entre las proteínas restantes, 30 proteínas únicas para el agotamiento de suero fueron particularmente implicado en el transporte de proteínas, síntesis de proteínas, y el ciclo celular, mientras que 29 proteínas únicas para tratamiento con 5-FU se asocian comúnmente con el metabolismo de la glucosa. Estos resultados indican que hubo un cambio en las proteínas con las que Hsc70 interactuó en respuesta a diferentes tipos de estrés. Por lo tanto, la interactome Hsc70 refleja los cambios de estímulo-dependiente en las respuestas a estrés y podría ser utilizado para monitorear los cambios fisiológicos de células. Nuestro análisis también identifica un número limitado de proteínas que eran comunes en ambas condiciones de estrés, que estuvieron involucrados en la mitocondria, el citoesqueleto, y el transporte de proteínas. De estos, nos centramos en Rab1A en la superfamilia Ras, que se expresa en un alto nivel en células de cáncer. Esta molécula regula los procesos celulares clave tales como la transducción de señales, la proliferación celular, y el transporte de vesículas (Fig. 2B y en la Tabla S2).
(A) una vista esquemática de la identificación de los interactores Hsc70. Las células se expusieron al agotamiento de suero (SD), 5-FU, o DMSO durante 6 h. Hsc70 interactores fueron aisladas con anticuerpos anti-Hsc70 del extracto celular, y se identificaron mediante el análisis posterior por cromatografía de líquido tándem espectrometría de masas (LC-MS /MS). Identificación (B) y la clasificación funcional de los interactores Hsc70 que se asociaron con cambios en la respuesta al estrés. Un diagrama de Venn que representa interactores Hsc70 que fueron identificados en & gt; 95% puntuación de confianza (1.3 ProtScore) utilizando el software ProteinPilot 2.0. los gráficos de columnas indican el número y la funcionalidad de las proteínas identificadas.
Rab1A Knockdown daño por estrés exacerbado por suero agotamiento y tratamiento con 5-FU
Para ampliar nuestros hallazgos proteómica, el próximo evaluó la contribución de Rab1A a la supervivencia de células de cáncer. En comparación con la transfección de control, Hsc70 caída reduce tamaño de las colonias, sin ninguna alteración de la morfología celular (Fig. 3A). Sin embargo, Rab1A caída causada atenuación de adhesión célula-célula y disminuyó notablemente el número de células, que se ve reforzada por el agotamiento de suero. Para cuantificar los efectos de Rab1A desmontables, se realizó el ensayo MTS (Fig. 3B). Las células se sembraron a 1 x 10
5 por pocillo en placas de 96 pocillos con el fin de eliminar la influencia de la proliferación celular. Tanto el agotamiento de suero y el tratamiento 5-FU tuvieron poco efecto en la viabilidad de las células de control, lo que indica que estos tratamientos sólo constituían estrés leve para las células. En comparación con las células de control, Hsc70 desmontables disminuyó significativamente la viabilidad celular (
p
& lt; 0,01) a pesar de la exposición al estrés leve. Esto demuestra que Hsc70 knockdown indujo la muerte celular en condiciones de estrés, como también se indica en la figura. 1A y B. Sin embargo, desmontables Rab1A disminuyeron significativamente la viabilidad celular (
p
& lt; 0,05) sin exposición al estrés, lo que indica, además, que Rab1A desmontables muerte celular inducida por sí solo en condiciones normales. Por otra parte, a pesar del carácter leve de estas tensiones, el agotamiento de suero y tratamiento con 5-FU se redujeron aún más la viabilidad de las células Rab1A desmontables. Estos resultados indican que Rab1A contribuye a la supervivencia celular y es muy importante en condiciones de estrés que están más allá de la capacidad de Hsc70 para asegurar la supervivencia celular.
Células
HT29 transfectadas con
Hsc70
,
Rab1A
, o
Control de siRNA
fueron sometidos a un agotamiento de suero, 5-FU, o tratamiento con vehículo durante 24 h. Efectos (A) de supresión de Hsc70 y sus interactores en la morfología celular. imágenes de contraste de fase representativos de células. Barra de escala, 100 micras. (B) desmontables Rab1A disminución de la viabilidad celular. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTS. Los asteriscos indican significancia estadística. **,
p Hotel & lt; 0,01, *,
p Hotel & lt; 0,05 frente a vehículo;
†,
p Hotel & lt; 0,05 frente a control de derribo por dos vías ANOVA seguido por el test de Tukey-Kramer post hoc; Los valores son las medias ± S. D. (
n
= 7). Veh, de vehículo. SD, el agotamiento de suero. FU, 5-fluorouracilo.
Hsc70 Rab1A impedido el deterioro
Para investigar los efectos de Hsc70 en Rab1A bajo condiciones de estrés, que se centró en la interacción de estas dos moléculas. Verificamos la interacción física de Hsc70 endógena y Rab1A mediante ensayos de co-inmunoprecipitación con anticuerpos comerciales (Fig. 4A). Esto confirmó los resultados del análisis de espectrometría de masas que Hsc70 interactuó con Rab1A en condiciones de suero empobrecido. Se confirmó, además, que Hsc70 interactuó con Rab1A de una manera dependiente de la chaperona porque Hsc70 y Rab1A se disocian unas de otras por ATP. También se encontró que Hsc70 forma homodímeros, pero no lo hicimos Rab1A. elución secundaria en tampón de muestra SDS para el resto de las proteínas unidas a perlas de agarosa se realizó para detectar las proteínas de cebo porque ATP no interfiere con la interacción antígeno-anticuerpo. A continuación, se evaluó el nivel Rab1A cuando Hsc70 fue suprimida; que mostró una disminución en condiciones de estrés a pesar de un aumento compensatorio del nivel de Hsp72 (Fig. 4B). Sin embargo, Hsc70 caída no tuvo ningún efecto en el nivel de Rab1A en las condiciones de control. Se observó que esta regulación a la baja de Rab1A bajo condiciones de estrés a nivel de proteínas, pero no en el nivel de mRNA (Fig. 4C). Por lo tanto, se demostró hsc70 no para regular la síntesis Rab1A, por lo menos. Seguidamente, se encontró que la supresión Hsc70 aumentó el nivel de Rab1A ubiquitinada en condiciones de suero empobrecido (Fig. 4D). Además, la degradación Rab1A que fue inducida por Hsc70 caída en condiciones de estrés fue inhibida por el inhibidor del proteasoma MG132 (Fig. 4E). En conjunto, estos resultados sugieren que Hsc70 evita la degradación de Rab1A que ha sido mal plegadas en condiciones de estrés.
(A) la interacción Hsc70-Rab1A través de la actividad chaperona. células HT29 fueron sometidas a agotamiento de suero durante 24 h, y luego se lisaron. Para verificar la interacción entre Hsc70 y Rab1A de una manera chaperona-dependiente, anti-Hsc70 o immunoprecipitant anti-Rab1A se eluyó con ATP, seguido de elución con tampón de muestra de SDS e inmunotransferencia con el fin de confirmar las proteínas cebo. (B) Hsc70 desmontables disminuyó el nivel de proteína Rab1A bajo condiciones de estrés. células HT29 transfectadas con
Hsc70
o
Control de siRNA
fueron sometidos a un agotamiento de suero, 5-FU, o tratamiento con vehículo durante 24 h. Inmunotransferencia para Rab1A endógeno y proteínas hsc70. β-actina se utilizó como control de carga. (C) Hsc70 caída no disminuyó
Rab1A
nivel de ARNm. Después desmontables de Hsc70 y en el control,
Rab1A
niveles de ARNm se determinaron mediante PCR cuantitativa a las 48 h después de la transfección. (D) Hsc70 caída promueve la ubiquitinación de Rab1A. Después se lisaron las células desmontables o de control Hsc70, se realizó la inmunoprecipitación (IP) con anti-Rab1A o anticuerpos anti-ubiquitina, seguido de inmunotransferencia con anticuerpos anti-ubiquitina o anti-Rab1A. (E) MG132 tratamiento inhibe la degradación Rab1A. Hsc70 desmontables células fueron sometidas a agotamiento de suero o tratamiento con 5-FU, y luego MG132 (10 M) o vehículo se añadió para la última 8 h antes del muestreo. SD, el agotamiento de suero. FU, 5-fluorouracilo. Ub, ubiquitina, IgG LC, cadena ligera de inmunoglobulina. Los datos (excepto en C) son representativos de al menos dos experimentos independientes que producen resultados similares.
Rab1A la muerte celular inducida Knockdown-no es de apoptosis
Para investigar si la ausencia de Rab1A induce la apoptosis, se analizó la presencia de células apoptóticas mediante tinción nuclear con Hoechst 33258. Ran, un miembro de la superfamilia Ras, interactuó con Hsc70 en todas las condiciones de acuerdo a nuestro análisis de la proteómica (Tabla S2). Ran desmontables se realizó como un control positivo para la apoptosis. Ran desmontables células mostraron fragmentación nuclear apoptótica independiente del agotamiento de suero, mientras que las células desmontables Rab1A mostraron sólo una ligera apoptosis cuando se expone al agotamiento de suero (Fig. 5A). Al contar las células teñidas con Hoechst y aquellos con la fragmentación nuclear, se encontró Rab1A desmontables para disminuir el número de células en la misma medida como Ran desmontables (Fig. 5B). Sin embargo, la apoptosis se indujo notablemente por Ran desmontables pero no por Rab1A desmontables (Fig. 5C). Debido a que también no detectamos típica de PARP-1 y la caspasa-3 firmas apoptóticas en caída Rab1A (Fig. 5D), la muerte celular exacerbada por caída Rab1A se demuestra que no es responsable de la apoptosis. Por lo tanto, estos resultados sugieren que Rab1A desmontables inducida por la muerte celular no es de la apoptosis.
HT29 células transfectadas con
Hsc70
,
Rab1A
,
Ran
o
Control de siRNA
fueron sometidos a un agotamiento de suero, 5-FU, o tratamiento con vehículo durante 24 h. (A) knockdown Rab1A tuvo poco efecto sobre la inducción de la apoptosis. La inducción de la apoptosis se analizó por tinción con Hoechst 33258. puntas de flecha blancas indican núcleos apoptóticos con cromatina condensada. Barra de escala, 50 micras. (B, C) La disminución del número de células por Rab1A caída no era debida a la apoptosis. El número de células totales y las células apoptóticas se cuantificaron contando las células teñidas con Hoechst y las células con la condensación nuclear en (A), respectivamente. *,
p Hotel & lt; 0,05, **,
p Hotel & lt; 0,01 frente a control /veh;
†,
p Hotel & lt; 0,05,
††,
p Hotel & lt; 0,01 frente a control /SD;
##
p Hotel & lt; 0,01 frente Rab1A /SD por dos vías ANOVA seguido del test de Bonferroni /Dunn post hoc; Los valores son las medias ± S. D. (
n
= 3). supresión (D) Rab1A no indujo apoptosis. La apoptosis se determinó por las divisiones de PARP-1 y la caspasa-3, detectadas por inmunotransferencia. β-actina se utilizó como control de carga. Veh, de vehículo. SD, el agotamiento de suero. FU, 5-fluorouracilo. inmunotransferencia de datos son representativos de al menos tres experimentos separados que producen resultados similares.
cuantitativo diferencial Proteómica en células Rab1A Knockdown
Para examinar por qué la ausencia de Rab1A muerte celular inducida por la apoptosis sin incluir, se realizó un análisis cuantitativo proteómica diferencial de las células Rab1A desmontables basados en la técnica iTRAQ. Las proteínas marcadas con iTRAQ que habían sido extraídos de las células Rab1A desmontables fueron analizados y comparados con el proteoma de las células control. Como resultado, se consideró que 25 proteínas con un cambio de expresión de ≥1.2 veces que se upregulated, mientras que 27 proteínas con un cambio & lt; 0,8 veces se downregulated (Tabla S3). Para evaluar las diferencias funcionales entre estos dos subconjuntos de proteínas, se realizó un análisis IR (Fig. 6A y B). Las proteínas upregulated fueron clasificados en las categorías de transporte de proteínas, mitocondrias, y proteasoma, mientras que la clasificación en los términos del ribosoma y la transcripción /traducción fue particularmente común entre las proteínas downregulated. Estos resultados sugieren que Rab1A caída aumentó los niveles de otras proteínas implicadas en el tráfico de retículo endoplasmático (ER) -Golgi, pero no dio lugar a la compensación de la función Rab1A. La disfunción de Rab1A facilita la degradación de proteínas y se detuvo la síntesis de proteínas, lo que indica que Rab1A caída en células indujo la acumulación de proteínas mal plegadas. Por lo tanto, las células Rab1A desmontables pueden estar expuestos a proteotoxic estrés, que posteriormente induce la muerte celular.
Células
HT29 fueron transfectadas con siRNA para
Rab1A
o control de mezcla aleatoria. Identificación de proteínas en las células Rab1A desmontables se realiza a través de la proteómica cuantitativa de etiquetado de isótopos estables, utilizando iTRAQ. (A) las proteínas Upregulated con relación iTRAQ ≥1.2. (B) downregulated proteínas con relación iTRAQ. & lt; 0,8
Muerte Celular Rab1A-desmontables inducida fue causada por la inhibición de la autofagia, pero no ER-Golgi tráfico
Desde Rab1A participa en el tráfico ER-Golgi, el próximo examinó si la interrupción de este tráfico induce la muerte celular. Aunque el tratamiento con BFA, un inhibidor de tráfico ER-Golgi, la muerte celular inducida, la morfología de las células que mueren era muy diferente de la que al Rab1A desmontables (Fig. 7A y B). Debido BFA también se conoce como un inductor de estrés ER, el tratamiento BFA se predice para causar la acumulación intracelular de proteínas mal plegadas y desnaturalizadas. Por lo tanto, el próximo investigó la inducción de la autofagia. Como era de esperar, el tratamiento indujo BFA LC3B-II, mientras que Rab1A caída no lo hizo. Rab1A desmontables También dieron lugar a la acumulación de p62, que puede unirse LC3, sirviendo así como un sustrato selectivo de la autofagia (Fig. 7C). Cuando Rab1A fue suprimido, el nivel de ARNm de Rab1B aumentó dos veces, mientras que su nivel de proteína tendió a aumentar ligeramente (Fig. S2A y B). Rab1A, por lo tanto, puede tener una función desconocida única que carece de Rab1B o los niveles totales de Rab1A y Rab1B puede disminuir por debajo del umbral necesario para la supervivencia celular cuando Rab1A fue suprimida. Además, puesto que Hsc70 caída inducida LC3B-II que permitió LC3B a asociarse con vesículas autofágicos, no afectó a la formación de autofagosomas, en contraste con Rab1A desmontables (Fig. 7D). β-actina se utilizó como control de carga. β-actina se utilizó como control de carga. 2B.