Extracto
La medicina tradicional china ha ganado popularidad debido a su capacidad para matar las células tumorales. Recientemente, se han investigado los efectos apoptóticos y anti-angiogénicos de Trametes robiniophila murr (Huaier). El objetivo de este estudio fue investigar su efecto sobre la movilidad celular y el crecimiento tumoral en el cáncer de ovario. La viabilidad celular y la motilidad se midieron usando ensayos SRB, arañazos y migración. apoptosis celular se analizó mediante tinción con anexina V /PI. El uso de un ensayo de matriz de proteínas de fase inversa (RPPA), se analizaron los niveles de 153 proteínas y /o fosforilaciones en las células tratadas con Huaier y no tratados. Huaier viabilidad celular y inhibida inducida tanto temprana y tardía de la apoptosis en SKOV3, SKOV3.ip1 y células Hey de una manera tiempo y dependiente de la dosis. invasividad celular y la migración también se suprimieron significativamente. Los resultados RPPA mostraron diferencias significativas (de al menos 30%; p & lt; 0,05) en los niveles de 7 moléculas en las células SKOV3 y 10 en las células SKOV3.ip1 entre las células tratadas y no tratadas. La mayor parte de las funciones de reproducción moléculas identificadas en la proliferación celular, apoptosis o la adhesión celular /invasión. Western blot validada, además, que el tratamiento Huaier generado una disminución en la fosforilación de AKT, el aumento de la expresión del total de GSK3, la inhibición de la fosforilación de GSK3 en S9, la reducción de la expresión tanto β-catenina citoplasmática y la translocación β-catenina nuclear, y la represión de la transcripción de varias Wnt /β-catenina genes diana (
DIXDC1, LRP6, WNT5A
, y ciclina D1). Después de eliminar a GSK3, la expresión de β-catenina no podía ser inhibida por Huaier. Finalmente, Huaier inhibió el crecimiento de xenoinjertos de tumores de ovario in vivo. Estos estudios indican que Huaier inhibe la movilidad de las células tumorales en el cáncer de ovario a través de la vía de señalización de AKT /GSK3 /β-catenina
Visto:. Yan X, Lyu T, Jia N, Yu Y, Hua K, Feng W ( 2013) Huaier extracto acuoso de ovario inhibe la motilidad celular del cáncer a través de la AKT /GSK3 /β-catenina. PLoS ONE 8 (5): e63731. doi: 10.1371 /journal.pone.0063731
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Octubre, 2012; Aceptado: 5 Abril 2013; Publicado: May 8, 2013
Derechos de Autor © 2013 Yan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, el número de concesión 30973185 (http://www.nsfc.gov.cn). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es una causa principal de muerte por cáncer ginecológico en los Estados Unidos y la quinta causa más común de muerte por cáncer en las mujeres [1]. La incidencia de cáncer de ovario aumenta con la edad. El setenta por ciento de los pacientes se presentan con enfermedad avanzada, y menos del cuarenta por ciento podrían ser curados. La supervivencia global del cáncer de ovario avanzado no ha demostrado ser prometedor, incluso después de la cirugía combinada con nuevas estrategias adyuvantes, tales como la quimioterapia de dosis alta con trasplante de células madre de sangre periférica, paclitaxel semanal de dosis densa con carboplatino, y la terapia dirigida con carboplatino /paclitaxel. Recientemente, los resultados de un ensayo aleatorizado de fase III (GOG 0208) demostraron que el uso de bevacizumab (un receptor del factor de anticuerpo de crecimiento endotelial) durante y hasta 10 meses después de carboplatino y paclitaxel prolonga la mediana de supervivencia libre de progresión en aproximadamente 4 meses en pacientes con cáncer de ovario epitelial avanzado [2]. Sin embargo, la supervivencia global es similar a la terapia convencional a pesar del alto costo. Debido a que ninguna de estas estrategias puede proteger completamente a los pacientes con cáncer de ovario de recurrencia y metástasis, se necesitan urgentemente nuevos medicamentos.
Entre las terapias complementarias, la medicina tradicional china (MTC) ha ganado popularidad por su capacidad para matar las células tumorales con menos daño a las células normales. Además, TCM tratamiento a base de hierbas es relativamente barato y se ha reportado para aumentar la eficacia de la quimioterapia, reducir la toxicidad, prolongar el tiempo de supervivencia y mejorar la calidad de vida y las funciones inmunes [3]. Trametes robiniophila Murr (Huaier) es un tipo de hongo de China, que se utiliza en la medicina tradicional china para aproximadamente 1600 años. Sin embargo, sus efectos y mecanismos antitumorales se han estudiado sólo en los últimos años. Los ingredientes efectivos fueron extraídos y analizados por chromatophy líquida de alto rendimiento (HPLC) y electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) de los análisis, que identificó proteoglicanos como los principales componentes del extracto Huaier, que consistía en 41,53% de polisacáridos, 12.93 % de aminoácidos y 8,72% de agua [4], [5]. La droga, que ha sido aprobado por la Food and Drug Administration de Chino (FDA), ha sido utilizada en pacientes con cáncer hepatocelular. En experimentos in vitro mostraron que Huaier puede inhibir el crecimiento de células de hepatocarcinoma (HepG2, MHCC97H), células de adenocarcinoma de pulmón humano (A549), y células de cáncer de mama humano (MCF-7, MDA-MB-231) mediante la inducción de la apoptosis [6] - [8]. Recientemente, Wang et al. informaron que el extracto Huaier podría servir como un agente anti-angiogénico y antitumoral potente [9]. Sin embargo, si Huaier afecta el comportamiento biológico de las células de ovario no ha sido explorado. En este estudio, además de sus efectos anti-proliferativos y apoptóticos, la novela posibilidad de que Huaier ejerce un efecto anti-invasivo en las células de cáncer de ovario a través de se investigó la vía de señalización de AKT /GSK3 /β-catenina.
materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
El medio RPMI-1640 se adquirió de Jinuo Co., Ltd (Shanghai, china). de suero bovino fetal (FBS) fue suministrado por Gibco-BRL (Rockville, IN, EE.UU.). Los anticuerpos contra AKT (1:1000), pAKT-Thr308 (1:1000), PS6-S235 (1:1000), PS6-S240 (1:1000), ciclina D1 (1:2000), ciclina A (1:2000 ), e-cadherina (1:1000), glucógeno sintasa quinasa 3 beta (GSK3, 1:1000), GSK3 fosfo S9 (1:500, Epitomics, CA, EE.UU.). y β-catenina (1:1000) fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.). El H1 anti-histona (1:300) y anti-ratón y anti-conejo IgG peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:5000) anticuerpos se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Anti-GAPDH (1:3000) y anti-β-actina (1:3000) fueron adquiridos de Biyuntian Biotech Co., Ltd (Shanghai, China). Todos los demás productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE.UU.) y Biyuntian Biotech Co., Ltd.
Preparación de extracto de Huaier acuosa
El ungüento electuario de Huaier fue un regalo Gaitianli de Medicina Co Ltd (Jiangsu, china). Los métodos de preparación para el extracto Huaier y sus ingredientes se han descrito en otra parte [4], [5] se disolvió un total de 2 g de la pomada electuario en 50 ml de medio completo y se esterilizó con un filtro de 0,22 micras para obtener los 40 mg /ml de solución madre, que se almacenó a -20 ° C.
cultivo de células
se utilizaron los tres tipos de líneas celulares de cáncer de ovario epitelial en este estudio. células SKOV3 y Hey se obtuvieron de la American Type Culture Collection. SKOV3.ip1 células fueron regalos de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) [10]. Las líneas celulares se mantuvieron rutinariamente en medio RPMI-1640 que contiene 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2.
proliferación de las células de ensayo
El efecto inhibidor del crecimiento de Huaier se determinó usando un ensayo de sulforrodamina B (SRB). Brevemente, las células SKOV3 (2,5 × 10
3), las células SKOV3.ip1 (2 × 10
3) y Hey células (1,5 × 10
3) se sembraron en placas de 96 pocillos y se trata con el extracto acuoso Huaier a diferentes concentraciones. En los tiempos indicados, se lavaron las células, se fijaron con 30% (vol peso /) de ácido tricloroacético y se tiñeron durante 30 minutos a temperatura ambiente con 0,4% sulforodamina B (SRB) en ácido acético 1%. El colorante se lavó con 1% (vol /vol) de ácido acético y después se disolvió en una solución de base Tris 10 mM. Las placas se leyeron con un lector de microplacas (Bio-Rad) a 570 nm. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió al menos tres veces |
Anexina V /PI tinción
La célula Kit apoptosis muerto con Anexina V Alexa Fluor ® 488 & amp.; Yoduro de propidio (PI) (Invitrogen, CA, EE.UU.) se utilizó para investigar si el tratamiento con Huaier induce las células SKOV3, células y células SKOV3.ip1 Hey someterse a apoptosis. Las células se marcaron con fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante. En general, las células cultivadas SKOV3 breves (2 × 10
5), SKOV3.ip1 (2 × 10
5) las células y las células Hey (5 × 10
3) en una placa de 35 mm fueron tratados con diferentes concentraciones de Huaier durante 48 horas. Las células se recogieron y se resuspendieron a 1 x 10
6 células /ml en tampón de unión. Entonces, verde colorante fluorescente (AlexaFluor® 488) conjugado con anexina V y PI se añadieron y se incubaron en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron mediante un citómetro de flujo FACScan (Beckman) equipado con software CellQuest. El porcentaje de células apoptóticas se calcula a partir del porcentaje de células en el cuadrante inferior derecho (LR) de la gráfica de puntos, que representa el número de células apoptóticas tempranas (anexina V + /PI-) dividido por el número total de células. Cada experimento se repitió al menos tres veces.
in vitro cero ensayo
Un ensayo cero in vitro se realizó para evaluar cómo la migración celular se vio afectada por la administración del extracto acuoso Huaier. Un total de 2 × 10
4 células se sembraron en una placa de 24 pocillos. Los puntos de referencia cerca de la "cero" fueron marcados para asegurar el uso de la misma zona para la adquisición de imágenes. Después de un período de incubación de 24 horas, las monocapas confluentes de la SKOV3, SKOV3.ip1 y células Hey estaban rayados usando una punta de pipeta de 200 l para crear un "cero" recta. Después de lavar 2 veces con PBS, medio libre de suero que contiene extracto de Huaier se añadió (5 mg /ml) a cada pocillo. La anchura cero se midió en cuatro ubicaciones predefinidas en el inicio y en 12 y 24 horas después del cero en las células SKOV3 y SKOV3.ip1. Y el ancho rayado se mide en Hey células al inicio ya las 6 y 12 horas después de cero. Se midieron las distancias entre los 2 bordes del cero en los puntos de referencia y se analizaron estadísticamente
ensayos de invasión de Matrigel
El sistema Transwell (24 pocillos de inserción;. tamaño de poro, 8 micras; Corning Costar, Lowell, MA, EE.UU.) se utilizó para explorar el efecto del extracto acuoso Huaier en la invasividad de la SKOV3, SKOV3.ip1 y Heycells. Los insertos se revistieron con 30 l de Matrigel (B.D. Biosciences Pharmingen). Un total de 3 y Hey células × 10
4 SKOV3, SKOV3.ip1 cada suspendió en 0,2 ml de medio fresco sin suero fetal bovino se añadieron al pocillo superior de la cámara. En el grupo control, se añadieron 600 l de medio completo al pozo inferior, mientras que en el grupo de prueba, el medio contenía 5 mg /ml Huaier. Después de la incubación durante 24 horas, las células de la superficie superior de la membrana se pasáses con hisopos de algodón. A continuación, las células que se adhieren a la superficie inferior de los insertos fueron fijadas y teñidas con hematoxilina. Seis campos representativos de cada inserto se contaron al azar usando un microscopio óptico Olympus.
array de proteínas de fase inversa
SKOV3 y células SKOV3.ip1 (5 × 10
5) se cultivaron en placas de 6 cm de diámetro. Después de una incubación de 24 horas, las células se dividieron en cuatro grupos para recibir diferentes tratamientos: medio completo solamente durante 72 horas, el extracto acuoso Huaier (5 mg /ml) durante 72 horas, de medio completo durante 60 horas más inanición durante la noche y 10 min de estimulación con factor de crecimiento epidérmico (EGF, 20 ng /ml) y el extracto acuoso Huaier (5 mg /ml) durante 60 horas más inanición durante la noche y la estimulación de 10 minutos con EGF (20 ng /ml). El (RPPA) ensayo de matriz de proteínas de fase inversa se llevó a cabo en el Centro Funcional de proteínas de matriz Core Proteómica fase inversa en el Anderson Cancer Center Doctor. Brevemente, los lisados celulares se ajustaron por sus concentraciones de proteína, desnaturalizado con SDS, y se diluyeron en serie (de no diluido a la dilución 1:16) para definir el intervalo lineal de cada reacción antígeno-anticuerpo. Los lisados fueron vistos en portaobjetos de nitrocelulosa recubierto (Whatman, Inc.) usando un microarrayer G3 GeneTAC (Genomic Solutions), junto con controles positivos y negativos. Un total de 153 anticuerpos validados específicos para las proteínas o sus sitios fosforilados que están involucrados en diferentes vías de señalización estaban disponibles y utilizados en la RPPA (Ver Tabla S1 para las proteínas y los sitios de fosforilación usados en estudios RPPA). Cada portaobjetos se sondeó con un anticuerpo primario más un anticuerpo secundario conjugado utilizando el enfoque de amplificación Dako CSA (tiramida) y se visualizó usando la reacción colorimétrica de DAB. Los datos recogidos se cuantificaron utilizando el software de MicroVigene cuantitativa, que fue desarrollado específicamente para este enfoque. Los niveles de fosforilación de proteínas se expresaron como una proporción de las proteínas totales equivalentes. Los valores derivados de la pendiente y el intercepto se expresaron en relación a los lisados celulares de control estándar de la matriz. Todos los valores se compararon con la media dentro de cada sonda de anticuerpo y se visualizaron con mapas de calor creados por el software Matlab (Mathworks Inc.).
Cell fraccionamiento
proteínas nucleares se aislaron mediante el BestBio nuclear y citoplasmática reactivos de extracción (BestBio, Shanghai, China) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Brevemente, 1 × 10
6 Las células se lavaron dos veces con PBS frío y se lisaron con 100 l de reactivo de extracción enfriado en hielo citoplásmica (CER) y 1 l de cóctel inhibidor de proteasa. Después de recoger la fracción citoplásmica (sobrenadante), el reactivo de extracción nuclear (NER) y cóctel inhibidor de proteasa se añadieron a la fracción insoluble, el mantenimiento de la relación de volumen de CER: NER: cóctel de proteasa a 100:500:1. Tras una incubación de 60 min y una centrifugación de 5 min (16.000 ×
g
a 4 ° C), se recogió la fracción nuclear. El sobrenadante fracción nuclear y se sometieron a análisis de transferencia de Western de β-catenina.
Western blot
Las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 por 3,5 cm plato de diámetro y recogido después del tratamiento indicado. Las células se lisaron en tampón de lisis (Biyuntian Biotech Co., Ltd, Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cantidades iguales de proteína (20 g por carril) se separaron por 12% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA). Después del bloqueo, las manchas se sondearon con los anticuerpos primarios y se incubaron durante la noche a 4 ° C, seguido de marcaje con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiadas. bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el sistema de detección ECL (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). GAPDH, β-actina y la histona H1 se utilizaron como los controles de carga.
inmunocitoquímica
Las células cultivadas se lavaron con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehído. Los portaobjetos se lavaron de nuevo, se trató con 1% de Triton durante 15 minutos y se bloquearon con 3% de H
2O
2 para 20 min. Después del lavado, los portaobjetos se bloquearon con suero normal de cabra durante 10 minutos a RT y se incubaron primero con 1:200 anticuerpo E-cadherina anti-humana (Epitomics, CA, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche y luego con un anti-conejo biotinilado anticuerpo secundario durante 30 minutos a TA. A continuación, los portaobjetos se incubaron con el sistema avidina-biotina-peroxidasa durante 10 minutos a RT y se tiñeron con diaminobenzidina (DAB) durante 2 minutos. Por último, se tiñeron por contraste con hematoxilina y observar bajo un microscopio de luz.
tiempo real RT-PCR cuantitativa
Las células fueron tratadas con o sin 7,5 mg /ml Huaier durante 48 h. El ARN total se extrajo de las células tratados y de control usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó a partir de 1 g de ARN usando el kit de RevertAid Primera Strand cDNA Synthesis (Fermentas, St-Leon-Rot, Alemania). Los niveles de expresión de genes relacionados con la vía de señalización Wnt [DIX dominio que contiene-1 (
DIXDC1)
], proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 6 (
LRP6)
, y de tipo sin alas MMTV familia del sitio de integración, 5A miembro (
WNT5A)
) fueron evaluados con un sistema en tiempo real Illumina Eco utilizando un kit perfecto en tiempo real (Takara). β-actina se utilizó como control interno en cada reacción. Los conjuntos de cebadores para estos genes se pueden suministrar a petición. Los cambios veces relativos se calcularon utilizando el método ΔΔCt.
Ratón xenotrasplante y la medición del tamaño del tumor
El animal experimentos fueron aprobados por el comité de ética del Hospital de Obstetricia y Ginecología de la Universidad de Fudan. ratones Balb /c hembra de seis semanas de edad, fueron adquiridos de la SIPPR China y Gran Bretaña /BK de animales de laboratorio Ltd., Co. (Shanghai, China). células SKOV3 (4 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón. Entonces, los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos (n = 6 ratones /grupo) para recibir ya sea solución salina normal (NS) como control, Huaier (4 g /kg de peso corporal), cisplatino (DDP) (5 mg /kg de peso corporal ) o más Huaier DDP. Huaier se administró diariamente por vía oral. DDP se inyectó una vez a la semana durante tres semanas. Los ratones de control fueron tratados con el mismo volumen de solamente NS. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces a la semana usando un calibrador digital y se calculan utilizando la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm
3) = (longitud de tumor [mm] x anchura x altura tumor [mm]) pi /6. Los ratones fueron sacrificados en el día 42 después de la inyección de células tumorales. Los pesos corporales se midieron también para evaluar los efectos secundarios. Se promediaron los medios de tres mediciones independientes
siRNA mediada por silenciamiento génico
Los dúplex de siRNA GSK3 que se dirigen a las secuencias:. (5'-GAGCAAAUCAGAGAAAUGAdtdt-3 ') fue sintetizado por Genechem (Shanghai , china), para la transfección de siRNA, 5 × 10
5 células /placa se sembraron en placas de cultivo de 60 mm. El día siguiente, se añadieron 10 l de Lipofectamine reactivo 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 0,5 ml reducido OPTI-MEM medio de suero (Invitrogen, Carlsbad, CA) sin antibióticos y suero, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min (solución UN). 200 pmol ARNsi fue añadido a 0,5 ml de medio Opti-MEM sin antibióticos y suero (solución B). Solución A y la solución B se mezclaron a continuación y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min. El medio de cultivo celular se eliminó, y se añadieron luego 1 ml de la mezcla de 2000-siRNA Lipofectamine y 4 ml de medio fresco 1640 sin antibióticos a cada placa de cultivo y se mezcló suavemente. 24 horas después, el medio se reemplazó con medio fresco de cultivo o 5 mg /ml de extracto acuoso Huaier. Las células se recogieron para el análisis de transferencia Western después de 24 horas de incubación.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Los experimentos fueron repetidos tres veces. Los resultados fueron analizados utilizando el software SPSS 11.5. p & lt; 0,05 fue aceptado como significativo
Resultados
Huaier inhibe la viabilidad celular en SKOV3, SKOV3.ip1 y Hey células
Para evaluar el efecto de la Huaier extraer en el. SKOV3, SKOV3.ip1 y células Hey, que mide la viabilidad celular utilizando el ensayo SRB. Después de que las células se trataron con Huaier para 24, 48, 72 y 96 horas a diversas concentraciones (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 mg /ml), Huaier inhibió significativamente el crecimiento de la SKOV3, SKOV3.ip1 y Hey células en un tiempo y manera dependiente de la dosis (Figura 1). El efecto citotóxico se inició 24 horas después de la 5 mg /ml tratamiento Huaier y se hizo más evidente a las 48, 72 y 96 horas en el SKOV3 y células Hey, mientras que comenzó a las 48 horas en las células SKOV3.ip1. El Hey y células SKOV3.ip1 eran más sensibles al tratamiento Huaier, ya que las tasas de viabilidad se redujo a 31,94% (72 horas, p & lt; 0,001) y 20,43% (96 horas, p & lt; 0,001) en las células SKOV3.ip1, 4,9% (72 horas, p & lt; 0,001) y 3,1% (96 horas, p & lt; 0,001) en la Hey células en comparación con el 61,1% (72 horas, p = 0,01) y 40,1% (96 horas, p & lt; 0,001) en el células SKOV3. Se observó una disminución significativa de la viabilidad celular cuando las células se trataron con 10 mg /ml Huaier, independiente de la duración del tratamiento.
El efecto inhibidor del crecimiento de Huaier se midió utilizando el ensayo SRB. SKOV3 (A) SKOV3.ip1 (B) y las células Hey (C) se trataron con Huaier para 24, 48, 72 y 96 h. Los experimentos se realizaron por triplicado, y los datos se presentan como la media ± SD de tres experimentos separados.
apoptosis de la célula analizada utilizando PI-anexina-V tinción
Debido a que el Huaier extraer el crecimiento celular significativamente inhibido, hemos explorado más a fondo si este efecto se logró mediante la inducción de la apoptosis. El ensayo V tinción PI-anexina mostró que después del tratamiento Huaier de 48 h, la apoptosis o muerte celular tasa tarde (UR) y la tasa de apoptosis temprana (LR) tanto aumentaron de una manera dependiente de la dosis en SKOV3, SKOV3.ip1 y Hey las células (Figura 2 y Tabla 1).
el porcentaje de células apoptóticas se midió por citometría de flujo utilizando el ensayo de PI-anexina V. (A, B, C) Las gráficas de puntos que muestran apoptosis en SKOV3 (A), SKOV3.ip1 (B) y las células Hey (C) con tratamiento Huaier en 0, 2,5, 5 y 10 mg /mL para 48 h.
motilidad celular disminuyó debido a la exposición a Huaier extraer
para explorar si la Huaier extracto de la motilidad celular afectada, se realizaron ensayos de invasión celular y arañazos. Cuando las células SKOV3 se trataron con 5 mg /extracto Huaier ml, el número de células invasoras través de la membrana recubierta con Matrigel se redujo significativamente en comparación con el grupo no tratado (218 ± 35 frente a 18 ± 7, p & lt; 0,001,), indicando que se inhibió la capacidad de invasión. Resultados similares se encontraron en el SKOV3.ip1 y Hey células (SKOV3.ip1: 438 ± 26 frente a 83 ± 25; Hey: 264 ± 21 frente a 62 ± 16 p & lt; 0,001, Figura 3).
(A ) el efecto de Huaier sobre la invasión de SKOV3, SKOV3.ip1 y células Hey se examinó utilizando el sistema Transwell. Se presentan imágenes representativas. (B) Después de un tratamiento de 24 horas con 5 mg /ml Huaier, el número de invadir con éxito SKOV3, SKOV3.ip1 y las células se contó Hey. Los datos se presentan como medias ± SD. ** P & lt;. 0,01 en comparación con el control
Un ensayo de rayado se realizó para evaluar la migración celular in vitro. Como se indica en la Figura 4, el índice de migración (correspondiente a la herida de la capacidad de curación) se inhibió de manera significativa en las células SKOV3 tratados con Huaier durante 48 horas en comparación con las células no tratadas (23,3% frente a 69,8%, p & lt; 0,01), mientras que fue similar en células tratado con Huaier durante 24 horas y las células no tratadas (17,5% frente a 24,7%, p & gt; 0,05). Sin embargo, el índice de migración disminuye tan pronto como 24 horas después del tratamiento en las células Huaier SKOV3.ip1 en comparación con las células no tratadas (19,3% frente a 60,6%, p & lt; 0,05). Para las células Hey, la herida puede casi cerrada durante solamente 12 horas de curación en las células no tratadas, y el índice de migración se inhibió significativamente en las células tratadas con Huaier simplemente por 6 h (58,2% frente a 29,1% p. & Lt; 0,01).
(a) un área de la herida recta se generaron en cada pocillo de cultivo al principio, y la administración de Huaier (5 mg /ml) mostró un proceso retardado de cierre de la herida en comparación con las células no tratadas. Imágenes representativas de las células control y células tratadas 5 mg /ml-Huaier fueron adquiridos a 0, 12,24 h (SKOV3, SKOV3.ip1) o 0, 6, 12 h (Hey). (B) Los índices de migración se inhibió significativamente por Huaier. Las barras representan el índice de migración para cada tratamiento, expresado como un valor relativo a la distancia recorrida por la monocapa de células. Los datos se presentan como medias ± SD. Los experimentos se repitieron al menos tres veces. ** P & lt; 0,01 en comparación con el control
La proliferación celular, la apoptosis y la adhesión celular o invasión de señalización de proteínas son reguladas por el tratamiento Huaier
Para investigar las vías de señalización que podrían. contribuir al efecto inhibidor de Huaier sobre la motilidad, se utilizó el análisis RPPA para evaluar cambios en las proteínas en las células SKOV3 y SKOV3.ip1 tratados con Huaier. RPPA es una nueva tecnología de alto rendimiento que monitoriza los cambios en la expresión de la proteína con el tiempo, antes y después de los tratamientos, entre los estados de enfermedad y no la enfermedad y entre los respondedores y no respondedores [11]. Usando RPPA, analizamos el nivel de expresión de 153 proteínas y /o sitios de fosforilación en líneas celulares de cáncer de ovario tratados con Huaier o no tratados con o sin estimulación de EGF. Para cada muestra y cada anticuerpo, la diferencia de señal entre las células no tratadas y tratadas con Huaier se calculó como sigue [12]: ([media de las células tratadas - los medios de células no tratadas] /[medio de las células no tratadas]) × 100%.
de los 153 proteínas y sitios de fosforilación analizado, 7 y 10 diferían en más de un 30% en las condiciones de tratados y no tratados en las células SKOV3 y SKOV3.ip1, respectivamente. heatmaps representativos se presentan en la Figura 5A. En las células SKOV3, el tratamiento Huaier inhibe la proliferación celular y altera los niveles de sitios de proteínas /fosforilación relacionados; por ejemplo, disminución de la fosforilación de HER2 en Y1248 y proteínas ER niveles, pero hasta reguladas p53 y la fosforilación Taz en S79. En las células SKOV3.ip1, proteínas más pro-proliferativos, tales como ER, c-kit y S6 fosforilado (proteína ribosomal S6 quinasa; fosforilada en S235-236 S240-244) y se redujeron regulado por Huaier. Además, Huaier inhibió la expresión de la isoforma más larga de Bcl (Bcl-XL) y regulado hasta la expresión de proteínas pro-apoptóticas, tales como p53 y poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa (PARP_cleaved), en la SKOV3.ip1 las células (Figura 5B).
(a) análisis de agrupamiento jerárquico de cuatro muestras (control, Huaier-tratada durante 72 horas, el hambre + EGF estimulación, estimulación inanición + EGF + Huaier durante 60 horas) en SKOV3 y SKOV3 células .ip1 de acuerdo con la expresión de 16 moléculas de señalización. Cluster tecla de color: rojo - hasta reguladas; verde - las reguladas; negro - sin cambios. (B y C): Doblar los cambios en la expresión o la fosforilación de diversas proteínas después del tratamiento Huaier y la adición de EGF se analizaron usando el ensayo de RPPA en el SKOV3 (B) y las células SKOV3.ip1 (C). Los valores relativos del grupo control y los grupos de estimulación de hambre + EGF se establecieron como 1,0. *:. Factor de cambio & gt; 30%
También se encontró que Huaier puede regular la adhesión celular y la invasión, sobre la base de la baja regulación de la fibronectina, β-catenina y la caveolina-1 de expresión en ambas líneas celulares y sobre regulación de claudin 7 en las células después del tratamiento SKOV3.ip1 Huaier (Figura 5B).
inhibición del crecimiento de células de cáncer de ovario inducida por Huaier Participación del /mTOR vía pAKT /S6 en
Uso la RPPA, se encontró que ribosomal S6 quinasa fosforilación fue reprimida por el tratamiento Huaier. S6 quinasa es un objetivo principal de la vía de mTOR, y promueve el crecimiento y la proliferación celular. La vía de AKT es un activador corriente arriba de la vía de mTOR. Por lo tanto, se analizaron los niveles de proteína de pAKT, AKT, ps6 (S235-236) y ps6 (S240-244) por el Western Blot. Se encontró que la fosforilación de AKT se redujo significativamente en células SKOV3.ip1 después de 72 h de tratamiento Huaier, ya sea con o sin estimulación de EGF. De acuerdo con la disminución de pAKT, fue también el regulado la fosforilación de S6 en S235-236 y S240-244. Sin embargo, en las células SKOV3, la fosforilación de S6 en S235-236 S240-244 y se había reducido regulado en células tratadas con Huaier solamente, pero no en los grupos de estimulación de EGF, mientras que pAKT se aumentó ligeramente en las células SKOV3 tratados con Huaier. Huaier el regulado de la fosforilación de S6 en S240-244 en los dos únicos grupos de estimulación de EGF y tratados con Huaier en Hey células. (Figura 6).
fosforilación de AKT, los niveles totales de AKT, y fosforilación S6 en S235 y S240 se midieron mediante transferencia Western de muestras de cada uno de los cuatro grupos de tratamiento (control, Huaier-tratada durante 72 horas, el hambre + EGF estimulación, el hambre + EGF + estimulación Huaier durante 60 horas). Los números de las bandas de proteínas representan los cambios veces, con los niveles basales en el control o grupos de hambre + EGF asignado un valor de 1,0.
Huaier inhibe la invasión celular a través de la vía /β-catenina GSK3
Debido a que los resultados de la tinción con anexina V /PI indicaron que Huaier induce la apoptosis y los resultados RPPA indicó además que varias proteínas pro y anti-apoptóticos fueron moduladas por el tratamiento Huaier, nuestros resultados apoyan el efecto pro-apoptótica de Huaier observado en otros estudios. Sin embargo, el análisis RPPA también mostró que las proteínas implicadas en la adhesión celular y la invasión fueron moduladas por el tratamiento Huaier (Figura 5). Esto sugiere que Huaier puede tener otro efecto terapéuticamente importante, sobre todo porque las células de cáncer de ovario epiteliales tienen una capacidad metastásica /invasiva única ya menudo se implantan en la cavidad pélvica o abdominal.
Entre esas proteínas, β-catenina es una clave componente de la cascada de adhesión célula-célula E-cadherina mediada. El uso de transferencias Western, verificamos aún más los cambios en la expresión de β-catenina en SKOV3, SKOV3ip1 y células Hey. Como se muestra en la Figura 7, Huaier disminuyó drásticamente la acumulación citosólica de β-catenina de una manera dependiente del tiempo en SKOV3, SKOV3.ip1 y células Hey. La expresión nuclear de β-catenina también se redujo. Nuestros datos indican que Huaier reprime no solamente la expresión de la proteína, sino también la translocación nuclear de β-catenina.
Tanto la expresión citoplásmica y translocación nuclear de β-catenina se inhibieron significativamente tras el tratamiento Huaier. células (A) SKOV3, (B) SKOV3.ip1 y (C) Hey fueron tratados con 5 mg /ml y 7,5 mg /ml Huaier para 24, 48 y 72 h. Las proteínas citoplasmáticas y nucleares se extrajeron por separado. Se muestra un western blot representativo. Para el análisis densitométrico de los niveles de β-catenina, los resultados se normalizaron a los niveles de GAPDH (por proteínas citoplasmáticas) o la histona 1 (proteínas nucleares). El nivel basal de los grupos no tratados en cada momento se le asignó un valor de 1,0.
Para aclarar el mecanismo que causa la baja regulación de la β-catenina, se evaluó además la expresión de GSK3 (glucógeno sintasa quinasa 3β), que se sabe que regulan negativamente la vía de señalización Wnt /β-catenina clásico mediante la fosforilación de β-catenina, que conduce a su degradación [13]. Debido a que la fosforilación de GSK3 en S9 inhibe su actividad y evita que la focalización de los β-catenina para la degradación, los lisados de células enteras fueron examinados para ambos total de GSK3 y GSK3 fosforilada en niveles S9 después del tratamiento Huaier.