Extracto
Cambio en la expresión de genes asociados con el cáncer de páncreas podría atribuirse a la variación en modificaciones postraduccionales de las histonas que conducen a la posterior remodelación de la plantilla de la cromatina durante la transcripción. Sin embargo, la red interconectada de moléculas implicadas en la regulación de estos procesos sigue siendo difícil de alcanzar. hPaf1 /PD2, una subunidad del complejo PAF-humana, que participan en la regulación de la elongación transcripcional tiene potencial oncogénico. Nuestro estudio explora la posibilidad de que la regulación de la metilación de las histonas por hPaf1 puede contribuir a la alteración en la expresión génica mediante transposición nucleosomal. Aquí, mostramos que desmontables de hPaf1 /PD2 conduce a una disminución de di- y tri-metilación en histona H3 lisina 4 residuos en las células de cáncer de páncreas. Curiosamente, hPaf1 /PD2 colocaliza con mLL1 (de linaje mixto Leukemia 1), una histona metiltransferasa que metila residuos H3K4. Además, una reducción en el nivel hPaf1 resultó en la reducción de expresión mLL1 y una disminución correspondiente en el nivel de CHD1, una enzima remodelación de la cromatina dependiente de ATPasa que se une específicamente a H3K4 di y trimetil marcas (Chromohelicase proteína 1 de unión a ADN). hPaf1 /PD2 también fue encontrado para interactuar y colocalize con CHD1 en ambos extractos citoplásmicos y nucleares de células de cáncer pancreático. Además, la reducción del nivel de CHD1 localización en el núcleo de las células hPaf1 /PD2 derribo podría ser rescatado por la expresión ectópica de hPaf1 /PD2. digestión con nucleasa microcócica mostró una estructura de la cromatina alterada en células hPaf1 /PD2-KD. En general, nuestros resultados sugieren que hPaf1 /PD2 en asociación con mLL1 regula la metilación de residuos de H3K4, así como interactúa y regula shuttling nuclear de la proteína remodelación de la cromatina CHD1, facilitando su función en las células de cáncer de páncreas
Visto:. Dey P, Ponnusamy MP, Deb S, Batra SK (2011) Human ARN polimerasa II-Asociación Factor 1 (hPaf1 /PD2) Regula la metilación de histonas y la remodelación de la cromatina en el cáncer pancreático. PLoS ONE 6 (10): e26926. doi: 10.1371 /journal.pone.0026926
Editor: María Bryk, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: Septiembre 4, 2011; Aceptado: 5 Octubre 2011; Publicado: 27 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Dey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores en este trabajo son apoyados por subvenciones de los Institutos nacionales de Salud (CA78590, CA111294, CA127297, CA133774 y CA131944) y el Departamento de Defensa (BC073541). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las modificaciones post-traduccionales de las proteínas histonas básicos, tales como fosforilación, metilación, acetilación, o ubiquitylation sumoylation, juegan un papel importante en la regulación de la expresión génica. Una forma en la que la función de este tipo de modificaciones de las histonas es por el reclutamiento de proteínas efectoras abajo que realizan funciones específicas independientes en la plantilla de la cromatina. Estos incluyen la remodelación de la cromatina proteínas que "leen" las marcas de las histonas modificadas y utilizan la energía del ATP para alterar la posición de los nucleosomas en el ADN. Como resultado, la plantilla de la cromatina es bloqueado o se hace accesible a la maquinaria de transcripción, por lo tanto, la regulación de la expresión génica aguas abajo. metilación de las histonas, específicamente la histona H3 lisina 4 mono residuos, di- y trimethylation, se asocia sobre todo con las regiones 5 'de los genes activamente transcrito [1]. Sin embargo, un estudio reciente muestra que en las regiones del daño en el ADN, las proteínas ING reclutan complejos de HDAC para silenciar la transcripción de genes de proliferación celular a través del reconocimiento de los residuos H3K4 trimethylated por sus dominios PHD [2]. Este es el primer informe que une trimethylation K4 a los genes reprimidos activamente también.
En los mamíferos, la metilación en el residuo de H3K4 se lleva a cabo por la metiltransferasa de histona mLL1, un dominio SET que contiene proteína que permanece en un complejo con otras proteínas de subunidades WDR5, rbbp5 y Ash2 [3]. El homólogo de levadura de mLL1, Set1, es una parte de un complejo macromolecular denominado COMPASS (complejo de proteínas asociadas con Set1) que interactúa con el complejo PAF levadura para la metilación de la histona [4]. Se ha postulado que algunos genes conservados, de Drosophila para el ser humano, llevan esta marca exclusiva de metilación y la expresión de estos genes está regulada por Pol II factores de elongación generales [1]. Las marcas de metilación H3K4 histonas se pueden reconocer además por proteínas específicas, dando como resultado el reclutamiento y la posterior enzimática o actividad fisiológica en el sitio de reclutamiento. CHD1 (ADN helicasa cromodominio de la proteína de unión 1) es una proteína perteneciente a la familia de la ATPasa de cromatina dependiente de factores de remodelación que se asocian específicamente con H3K4 dimethylated y trimetilada [5], [6]. El CHD1 humano se une al residuo de la histona H3K4 metilado a través de sus dos chromodomains en tándem, mientras que la levadura no puede enlazar CHD1 residuos H3K4 metilado [7].
desarrollo y progresión del cáncer se atribuye a la expresión génica desregulada que puede a menudo correlacionar a cualquiera de activación epigenética defectuoso o el silenciamiento de genes [8]. los patrones de modificación de histonas alterados causan mala focalización de la cromatina enzimas de remodelación que podrían conducir a la expresión de genes no controlada y por lo tanto hacen que las células normales se transforman en células cancerosas. El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de cáncer con un pronóstico, y cinco años la tasa de supervivencia muy baja de menos del 5%. Como otras formas de malignidad, cáncer pancreático también se correlaciona con alteraciones epigenéticas como la metilación del ADN y las histonas modificaciones, lo que lleva a una expresión génica alterada [9].
PD2 es el homólogo humano de la ARN polimerasa de levadura II- factor asociado 1 (yPaf1) que constituye la subunidad núcleo del complejo factor asociado RNA polimerasa II humana (HPAF). De manera similar a su homólogo de la levadura, el complejo HPAF se compone de cuatro subunidades, a saber hLeo1, hCtr9, hSki8 y parafibromin [10] - [12]. Las funciones principales del complejo HPAF implica elongación transcripcional, la transformación y la maduración del ARNm, similar a la del complejo de levadura PAF [12]. modificación de la cromatina y la remodelación son también algunas de las características de los factores de transcripción. Evidentemente, una serie de modificaciones de las histonas se han relacionado con el alargamiento complejo y la transcripción del PAF, así [4], [13]. Tanto la levadura y el complejo PAF humano se encuentran para ser necesario para ubiquitylation Rad6 /Bre1 dependiente de la histona H2B [14]. El monoubiquitylation de H2B por HPAF elimina la barrera nucleosomal, que es un requisito previo para la elongación de la transcripción eficiente en la cromatina por la RNA Pol II [14]. La presencia de H2B ubiquitylated desencadena más H3K4 di y tri-metilación. En la levadura, la función Paf1C en la formación de H3K4-Me3 es conferida por la subunidad rtf1 mediante el reclutamiento del complejo SET1 histona metiltransferasa [15], que es homóloga a la MLL humano complejo [16]. Los estudios muestran que la levadura también se requiere el complejo pAF1 para el reclutamiento del complejo metiltransferasa COMPASS para la ARN polimerasa II subunidad través de la interacción. En las células humanas, hCdc73 parece ser necesario para los niveles completos de H3K36-Me3 [17], pero no H3K4-Me3, mientras que en la levadura se requiere Cdc73 para ambas modificaciones [18]. Por lo tanto, el papel del complejo PAF en elongación de la transcripción ha estado estrechamente correlacionada con modificaciones de las histonas.
Además de su papel en la regulación de la transcripción, las subunidades de complejos de PAF humanos también se han vinculado a un fenotipo maligno. Parafibromin (hCdc73) se encuentra mutado en tumores paratiroideos y amplificado en el carcinoma de hígado y de mama. Leo1, presente en el locus 15q21, se amplifica en el cáncer colorrectal y el histiocitoma fibroso maligno del hueso, mientras que el
Ctr9
locus del gen se encuentra para ser eliminado en el cáncer de páncreas. La subunidad hPaf1 del complejo PAF humano, también conocido como PD2, se amplifica y sobreexpresa en el cáncer de páncreas y su posible papel en la tumorigénesis se indica mediante la inducción de un fenotipo transformado en la sobreexpresión [19]. En este estudio, se identifica un papel de hPaf1 /PD2 en la regulación de metilación de las histonas en el residuo de H3K4 en las células de cáncer de páncreas por la interacción con la histona metiltransferasa mLL1. También se encontró para regular la expresión del factor de remodelación de la cromatina, CHD1 que se une específicamente a di y trimetilada H3K4 y facilitar su importación nuclear, probablemente a través de interacciones directas. Además, los ensayos de digestión con nucleasa micrococcal muestran que desmontables de PD2 conduce a la alteración de posicionamiento nucleosomal en células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer pancreático humano Panc1 y MiaPaca se obtuvieron de ATCC. Las células se cultivo en medios DMEM (Sigma) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Sigma) y 1% penicilina-streptamycin solución (Sigma). El medio de cultivo se cambió cada 2 días y se subcultivaron las células mediante tratamiento con tripsina-EDTA.
Aislamiento de ARN y QRT-PCR
ARN celular total se extrajo de las células Panc1 utilizando el kit RNAeasy (Qiagen) y procesado para la transcripción inversa. El paso inicial de activación de la PCR fue a 94 ° C durante cuatro minutos, seguido de la etapa de desnaturalización a 94 ° C durante un minuto, paso-primer recocido a 58 ° C durante 30 segundos, etapa de extensión a 72 ° C durante un minuto, y la etapa de extensión final a 72 ° C durante diez minutos. productos de reacción de PCR fueron separados por electroforesis usando un gel de agarosa al 2%. Los geles se tiñeron usando 0,5 mg /ml de bromuro de etidio, iluminadas con luz UV. RNA celular total fue inverso-transcrito y se ensayó por cuantitativa en tiempo real PCR utilizando SYBR verde incorporación. La expresión de todos los genes se normalizó a la del control interno β-actina y expresa en relación con la muestra de referencia indicada (media ± S.D. de las reacciones por triplicado). Las expresiones de los genes específicos de linaje se compararon entre las celdas PD2 caída Panc1 revueltos y por la prueba t de Student de dos colas. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
ARN de interferencia
La región de pAF1 /PD2 fue atacado con siRNA (secuencia 5'-3 AACAGGUUCGUCCAGUACAAA) '.. sentido sintético y oligonucleótidos antisentido (Dharmacon, Lafayette, CO) se hibridaron en acetato de potasio 100 mM, 30 mM HEPES-KOH (pH 7,4), y acetato de magnesio 2 mM durante un minuto a 90 ° C y una hora a 37 ° C, y congelados. Los oligonucleótidos se transfectaron en células con
Trans
-TKO (Mirus, Madison, WI) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
Ensayo de inmunotransferencia
líneas celulares
Panc1 y MiaPaCa eran procesados para extracción de proteínas y transferencia de Western usando procedimientos convencionales. Brevemente, las células se lavaron dos veces en PBS y se lisaron en tampón RIPA (Tris 100 mM, EDTA 5 mM, 5% de NP40; pH 8,0) inhibidores de la proteasa que contienen (1 mM fenil-metil fluoruro de sulfonilo, 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina) y se mantuvieron a 4 ° C y se recogieron los sobrenadantes. Veinte g de proteína lisados se resolvió en 10% SDS-PAGE. proteínas resueltas se transfirieron a la membrana PVDF. Después del lavado rápido en PBST (tampón fosfato salino y 0,1% de Tween 20), las membranas fueron bloqueadas en leche descremada en polvo 5% en PBS durante al menos 2 h y después se incubó con anticuerpos primarios (anti-pAF1 /PD2, anti-Leo1, anti-Cdc, anti-Ski8, anti- Oct3 /4, anti-SOX2, anti-β-actina) (diluido en 3% de BSA en PBS) durante la noche a 4 ° C. La membrana se lavó (3 x 10 min) en PBST a temperatura ambiente y se sondeó con 1:2000 rábano picante diluido anti-ratón o anti-conejo de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa durante 1 h a temperatura ambiente y se lavó 5 x 10 min con PBST . La señal se detectó con un kit de quimioluminiscencia ECL (Amersham Bioscience, RU). Todas las transferencias de Western se cuantificaron utilizando el software ChemiImager 4400. Los gráficos de barras muestran generan error representan los errores estándar calculada a partir de tres réplicas experimentales independientes. La diferencia en cada nivel de proteína entre t-test revueltos y se analizan las células desmontables PD2 por estudiantes con un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Microscopía Confocal
Las células se sembraron sobre cubreobjetos estériles cubierta redonda (CIR 18-1 Fisher marca 12-545-10) y cultivadas en placas de 12 pocillos durante 24 horas. Las células se fijaron en metanol enfriado con hielo (pre-enfriado a -20 ° C) y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en PBS. Entonces, las células se lavaron en PBS y se bloquearon con 10% de suero de cabra durante 30 minutos. Después de bloquear, se incubó con primaria (monoclonal de ratón PD2, CHD1 policlonal de conejo) anticuerpos durante una hora y fluorescente marcado con anticuerpos secundarios (FITC de cabra anti-ratón, Texas-Red de cabra anti-conejo) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos se diluyeron en suero de cabra al 5%. Finalmente, después de la incubación el anticuerpo secundario, las células se lavaron con TBST tres veces y cubreobjetos se montaron con Vectashield que contiene DAPI (Vector).
Aislamiento de extracto citoplasmático y nuclear
El protocolo para citoplasmática y la preparación de extracto nuclear fue adaptado de los procedimientos publicados anteriormente. Las células se lavaron dos veces en PBS frío y se incubaron en hielo durante 30 minutos en tampón de extracción citoplasmática hipotónico (10 mM Hepes, pH 7,4, KCl 10 mM, 0,2% NP-40, EDTA 0,1 mM, glicerol al 10%, MgCl 1,5 mM
2, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, Na mM 5
3Vo
4, 5 mM NaF), suplementado con completa cóctel inhibidor de la proteasa [Roche]. La disrupción celular se llevó a cabo por varios pasajes a través de una aguja 25G. Los núcleos se recogieron por centrifugación a 16.000 g, y el sobrenadante se centrifuga a 16.000 g para obtener el extracto citoplásmico final. nódulos nucleares se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo seguido de la incubación en tampón de extracción nuclear hipertónica (Hepes 20 mM, [pH 7,6], NaCl 420 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 20%, MgCl 1,5 mM
2 mM, DTT 1 , PMSF 1 mM, Na 5
3Vo
4, 5 mM NaF), suplementado con completa cóctel inhibidor de la proteasa [Roche]. La solución se sometió a ultrasonidos, además, al 60% de la amplitud dos veces durante 10 segundos cada uno. Los materiales insolubles fueron precipitados por centrifugación. Se recogió el sobrenadante y se utiliza como extracto nuclear.
Análisis de inmunoprecipitación
Igual cantidad de proteína A + G-Sepharose bolas (Oncogene Research, Boston, MA) se incubaron durante la noche con anti-PD2 (conejo policlonal) y anticuerpos en un volumen total de 1 ml anti-CHD1 (policlonal de conejo). A continuación se lavó dos veces para eliminar el anticuerpo no unido y se añadió a la mezcla de microesferas-anticuerpo y se incubaron en una plataforma giratoria durante 5 horas a 4 ° C 1,5 mg de lisado de proteínas. Después del período de incubación, las mezclas se lavaron cinco veces con tampón de lisis. Los inmunoprecipitados o lisados de células totales se resolvieron por electroforesis en SDS-PAGE (10%). proteínas resueltas se transfirieron a la membrana PVDF. Después del lavado rápido en PBST (solución salina tamponada con fosfato y 0,1% de Tween 20), las membranas se bloquearon en leche en polvo sin grasa al 5% en PBS durante al menos 2 h y después se incubó con anticuerpos primarios (anti pAF1 /PD2, Oct3 /4 y ARN Pol II). Las inmunotransferencias se lavaron cinco veces (5 x 10 min), se incubaron 1 h con rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, se lavó cinco veces (5 x 10 min), se hacen reaccionar con mayor reactivo de quimioluminiscencia ECL (Amarsham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido), y expuso a una película de rayos X para detectar la señal.
microcócica nucleasa ensayo
el ensayo de nucleasa micrococcal se llevó a cabo como se ha mencionado anteriormente [20] con algunas modificaciones. Cincuenta × 10
6 células se sedimentaron a 2000 rpm a 4 ° C durante 10 minutos, seguido de lavado con 10 ml de PBS enfriado con hielo y de nuevo sedimentaron como antes. Las células se resuspendieron en 5 ml de tampón de lisis enfriado en hielo NP-40 (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 10 mM, MgCl 3 mM
2, 0,5% Nonidet P-40, espermina 0,15 mM y espermidina 0,5 mM), se incubaron durante 5 minutos en hielo y los núcleos volvieron a sedimentar. Los núcleos se lavó con 2,5 ml de tampón MNase digestión (10 mM Tris-HCl, NaCl 15 mM, KCl 60 mM, espermina 0,15 mM y espermidina 0,5 mM) y después de la centrifugación se volvieron a suspender más en 1 ml de tampón de digestión MNase que contiene CaCl 2 mM
2. De las soluciones resuspendidos, se tomaron alícuotas de 100 l y se incubaron con cantidades crecientes de la nucleasa enzima microcócica (0, 80 y 100 unidades) durante 5 y 10 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 80 l de tampón de digestión MNase, 20 l de tampón de parada MNase (mM EDTA 100 mM, EGTA 10), 3 l de proteinasa K (25 mg /ml) y 10 l de 20% SDS y se incubó durante la noche a 37 ° C. El día siguiente, las muestras se extraen con 200 l de solución de fenol-cloroformo. Las muestras se centrifugaron y se recogió una capa acuosa. Se añadieron dos l de RNAsa A (10 mg /ml) a la solución y se incubaron a 37 ° C durante 2 horas y de nuevo se llevó a cabo extracción con fenol-cloroformo. Además, el ADN se precipitó mediante la adición de 100% de etanol y después de la centrifugación, el sedimento de ADN se resuspendió en tampón de hidratación de ADN o agua. Cinco mg del ADN aislado se resolvió en un gel de agarosa al 1,4% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. ImagJ software se utilizó para el análisis de densitometría de los patrones de bandas de ADN en el control, revueltos y células PD2 KD PC.
Resultados
hPaf1 /PD2 afecta a otras subunidades de complejos de PAF en células PC
el complejo PAF humano consta de cinco subunidades, similar a su homólogo de la levadura, a saber hPaf1, parafibromin (hCdc73), hCtr9, hLeo1 y la subunidad hSki8, que también es una parte del complejo SKI humano. Los informes anteriores han demostrado que las subunidades del complejo PAF humano demuestran expresión coordinada donde desmontables de cualquiera hCtr9 o la subunidad hSki8 condujo a una reducción en los niveles de las otras subunidades tales como hPaf1 y hLeo1 [12]. Esto es consistente con la observación en la levadura, donde la supresión de subunidades individuales conduce a diferentes grados de reducción en los niveles de proteína de otras subunidades [21]. Curiosamente, los datos recientes de nuestro laboratorio han demostrado que, las subunidades de complejos de PAF funcionan de manera independiente en las células madre embrionarias de ratón, de manera que la precipitación de la subunidad pAF1 no afecta al nivel de las otras subunidades [22]. Para analizar la importancia funcional de hPaf1, la subunidad principal del complejo HPAF, en el cáncer de páncreas, transitoriamente derribado hPaf1 /PD2 en las líneas celulares de cáncer de páncreas y Panc1 MiaPaCa. En corroboración con los informes anteriores, hemos encontrado que hPaf1 /PD2 tiene una expresión coordinada con las otras subunidades del complejo HPAF. El análisis de Western Blot de hCdc73 (parafibromin), proteínas hLeo1, hSki8 y hCtr9 y posterior cuantificación mostró disminución de los niveles de expresión de la subunidad hLeo1, hCdc73 y hCtr9 en el hPaf1 desmontables células Panc1 y MiaPaCa en comparación con las células siRNA tratados revueltos (Fig. 1) aunque no estadísticamente significativa. (P & gt; 0,05) Sin embargo no hubo ningún cambio observable en el nivel de proteína de la subunidad hSki8 a regulación a la baja de la subunidad hPaf1. Además, confirmó los resultados mediante el uso de una piscina diferente de siRNAs (Santa Cruz, CA) dirigidos contra PD2 y observaron efectos similares (Fig. S3). Estos resultados muestran que desmontables de una subunidad del complejo HPAF afecta a la expresión de los otros miembros a fin de mantener una relación estequiométrica general del complejo en las células de cáncer de páncreas. Además, se destaca también la expresión diferencial y la función de las subunidades individuales del complejo PAF en diferentes carcinomas.
Panc1 y células de cáncer de páncreas MiaPaCa fueron transfectadas con siRNA oligos revueltos y PD2 específicos y los lisados de proteínas se recogieron a las 72 horas después de la transfección. Western blot de los lisados celulares usando anticuerpos correspondientes mostró la expresión de hPaf1 /PD2 y otras moléculas complejas (PAF parafibromin, hLeo1, hSki8 y hCtr9) en las células Panc1 y MiaPaCa revueltos y pAF1 /PD2 RNAi tratados. La expresión de la histona 3 4 Lisina mono residuos, di y tri-metilación marcas mostró un nivel reducido en las células Panc1 y MiaPaCa hPaf1 /PD2 desmontables en comparación con las células tratadas RNAi revueltos. El nivel total de la histona H3 es la misma en tanto canales codificados y PD2 derribado células. β-actina sirvió como control de carga. La cuantificación de las transferencias de Western para cada línea celular se proporciona a continuación las cifras de inmunotransferencia con barras de error correspondiente. * Representa un cambio significativo (p & lt; 0,05) en el nivel de proteína entre revueltos y desmontables células PD2
hPaf1 /PD2 influye en la metilación de histonas en células PC
El complejo de levadura PAF tiene un pozo. papel establecido en las modificaciones de histonas como la ubiquitinación y metilación [4], [23] - [25]. Es conocido para mediar en la interacción entre el complejo Rad6-Bre1, COMPASS histona metiltransferasa, y el ARN Pol II, que conduce a la ubiquitinación de H2B de la histona en la lisina 123 residuo, que es un disparador posterior para la metilación en el residuo de lisina 4 de la histona H3 [24]. Un estudio anterior ha demostrado que el ARNi contra hCtr9 o hSki8 condujo a una reducción en el nivel celular de mono y trimethylation marcas de histona H3K4 pero no dimethylation marcas en células Hela, lo que indica un posible papel del complejo PAF humano en la metilación de histona, así [12 ]. Encontramos que desmontables transitoria de hPaf1 /PD2 utilizando RNAi específica en células de cáncer de páncreas afecta a la metilación de la histona en el residuo de H3K4 (Fig. 1). El análisis de Western Blot de mono, di y trimethylation marcas en la histona H3 lysine4 residuo mostró una reducción significativa (* p & lt; 0,05) en los niveles de H3K4 di- y trimetilada en las células Panc1 y MiaPaCa PD2 desmontables en comparación con las células tratadas RNAi revueltos. Sin embargo, no había mucha variación en los niveles de H3K4 monometilación debido a agotamiento PD2 en células de cáncer pancreático. Los experimentos se repitieron con una piscina diferente de siRNAs específicos PD2 en ambas líneas celulares (Fig. S3). Observamos de nuevo regulación a la baja de las marcas de histona di- y trimethylation como antes, con poca o ninguna variación en los niveles de histona monometılicos.
hPaf1 /PD2 regula la histona metiltransferasa nivel de proteína mLL1
En base a la observación de que hPaf1 /PD2 regula la histona di y tri-metilación en el residuo H3K4, queríamos investigar el efecto de la caída en hPaf1 histonas methyltransferases. La proteína mLL1 perteneciente a la familia SET1 de methyltransferases lisina es conocido para regular específicamente di-y trimethylation en la histona H3 lisina 4 residuos. Por lo tanto, se analizó el efecto de hPaf1 /PD2 caída en la expresión de la proteína mLL1 utilizando dos conjuntos diferentes de PD2 siRNAs en líneas celulares de cáncer de páncreas y Panc1 MiaPaCa. El análisis de transferencia Western reveló que una disminución en el nivel hPaf1 /PD2 en células de cáncer pancreático conduce a una disminución significativa (* p & lt; 0,05) en el nivel de proteína mLL1 (Fig 2A, S3.). Los gráficos se proporcionan a continuación los resultados de inmunotransferencia representan la cuantificación de las transferencias de Western para cada línea celular. Nos parecía más a fondo en proteínas y PD2 mLL1 en células de cáncer de páncreas mediante microscopía confocal y encontramos que las dos proteínas colocalize en el núcleo, lo que sugiere una posible interacción entre ellos (Fig. 2B). Sin embargo, la cantidad de colocalización de las dos proteínas era relativamente bajo, lo que indica una interacción posiblemente débil y /o transitoria. Estos resultados estaban en corroboración con estudios anteriores que mostraron que tanto la levadura y complejos de PAF humanos interactúan con el homólogo de la proteína correspondiente MLL o Set1 [4], [26], [27]. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que hPaf1 /PD2 regula, y posiblemente interactúa con mLL1, para controlar H3K4 metilación en las células de cáncer de páncreas.
células de cáncer pancreático Panc1 y MiaPaCa (A) fueron transfectadas con los oligonucleótidos revueltos y PD2 y RNAi Los lisados se recogieron a las 72 horas después de la transfección. El análisis de Western Blot usando anticuerpos específicos muestra una disminución en la expresión de la proteína mLL1 histona metiltransferasa en desmontables células en comparación con las células revueltos. β-actina sirvió como control de carga. los datos de cuantificación de la transferencia de western se proporcionan a continuación los resultados de inmunotransferencia correspondientes para las líneas celulares respectivas. Las barras de error representan el error estándar indicados calculado a partir de tres experimentos independientes. * Representa un cambio significativo (p & lt; 0,05) en el nivel de proteína entre revueltos y PD2 desmontables células. imágenes de microscopio (B) que ilustran Confocal PD2 y localización mLL1 en el núcleo de las células Panc1. MLL1 colocaliza con PD2 en regiones discretas dentro del núcleo (teñidas con DAPI) de las células Panc1. En el recuadro se representa una imagen ampliada de los puntos de colocalización de PD2 y mLL1.
Desmontables de hPaf1 /PD2 disminuye el nivel de CHD1 en las células de cáncer de páncreas
La regulación de metilación de las histonas por el hPaf1 /PD2 subunidad del complejo HPAF plantea la posibilidad de que podría afectar varias otras proteínas, tales como factores de remodelación de la cromatina, que interactúan con histonas modificadas en los sitios de la transcripción. Un complejo de remodelación de la cromatina putativo, CHD-1, fue identificada adventicia como una proteína de unión a ADN de mamífero, que contiene tres motivos de secuencia de firma (cromodominio de helicasa proteína 1 de unión a ADN): la chromodomain ácido 52-amino que se encuentra en la proteína heterocromatina HP- 1 y la Polycomb homeóticos represor, el dominio SNF2 /SWI2 ATPasa, y motivos característicos del surco menor del ADN proteínas de unión [28], [29]. Curiosamente, la proteína de remodelación de la cromatina CHD1 se sabe que se une específicamente a la metilado lisina 4 residuos de la histona H3, que es un sello de la transcripción activo. Se postula que los chromodomains CHD1 humanos son responsables del reconocimiento y la interacción con las marcas de histona de metilación [30]. Dado que hPaf1 /PD2 regulada metilación de las histonas en el residuo de H3K4, se investigó la regulación CHD1 por hPaf1 por caída transitoria de hPaf1 /PD2 en células de cáncer pancreático y analizado la variación en los niveles de la proteína CHD1. análisis de transferencia de Western junto con los datos de cuantificación se proporcionan a continuación las cifras de inmunotransferencia (Fig. 3A) correspondiente muestra que desmontables de hPaf1 /PD2 en células de cáncer pancreático conduce a una disminución en el nivel de CHD1 en comparación con las células de control revueltos. Regulación a la baja de CHD1 como un efecto de caída PD2 se confirmó en las mismas líneas celulares utilizando una piscina siRNA contra PD2 diferente (Fig. S3). Con el fin de validar este efecto, se utilizó microscopía de inmunofluorescencia. En consonancia con los datos bioquímicos, el análisis de inmunofluorescencia mostró que el nivel CHD1 se reduce en las células Panc1 y MiaPaCa hPaf1 /PD2 desmontables en comparación con las células MiaPaCa o Panc1 revueltos (Fig. 3B). Cuantitativa en tiempo real de análisis PCR muestra además que junto con PD2 ARNm, también hay una disminución en el nivel de ARNm en CHD1 PD2 siRNA células tratadas Panc1, lo que indica que hPaf1 regula la expresión CHD1 tanto en la transcripción y de la traducción niveles (Fig. S1A). Al mismo tiempo, la sobreexpresión de PD2 en células de cáncer de páncreas HPAF /CD18 también aumenta la expresión de CDH1 (Fig. S1B). Estos resultados indican que hPaf1 /PD2 regula la expresión de la proteína de remodelación de la cromatina CHD1, lo que sugiere su posible papel en la reorganización de la estructura de la cromatina durante la elongación de la transcripción en células de cáncer pancreático.
(A) análisis de transferencia Western muestra una disminución del nivel de la proteína en las células PC CHD1 sobre la inhibición hPaf1 /PD2 mediada por ARNi. β-actina sirvió como control de carga. El gráfico a continuación cada figura western blot representa los resultados de la cuantificación correspondientes a las líneas de células individuales. (B) El análisis de inmunofluorescencia que muestra un nivel hPaf1 /PD2 reducida (verde) junto con una reducción correspondiente en el nivel de CDH1 (rojo) en las células PC tratada PD2 siRNA en comparación con las células tratadas ARNsi revueltos.
hPaf1 /PD2 interactúa con CHD1 tanto en el citoplasma y el núcleo de las células de cáncer de páncreas
proteína remodelación
cromatina CHD1 se sabe que interactúan con factores de elongación de la transcripción y localizar a los genes activamente transcrito [31]. En la levadura, las funciones CHD1 durante la elongación de la transcripción a través de interacciones con factores de elongación, SPT4-Spt5 y Spt16-Pob3. Curiosamente, CHD1 también se encuentra para interactuar con la subunidad rtf1 del complejo PAF levadura que asocia con la RNA polimerasa II y regula la transcripción de elongación [31]. Aunque el rtf1 está presente en los seres humanos, no es como una parte del complejo HPAF. Por lo tanto, hemos probado la posibilidad de que la subunidad hPaf1 /PD2 del complejo PAF humano interactúa con CHD1 utilizando estudios de co-inmunoprecipitación. Western blot de los co-inmunoprecipitados muestra que interactúa con PD2 CHD1 tanto en el citoplasma, así como extractos nucleares de células de cáncer de páncreas, Panc1 y MiaPaCa (Fig. 4). Además, se analizó la interacción entre PD2 y CHD1 por estudios de co-localización mediante microscopía confocal (Fig. 5A). Se encontró que la tinción CHD1 (rojo) para solaparse con el tinción PD2 (verde), tanto en el citoplasma como en el núcleo de células de cáncer de páncreas en corroboración con los datos bioquímicos. Estos resultados sugieren que PD2 y CHD1 interactuar y participar aún más en la remodelación de la cromatina estructura en el cáncer de páncreas.
(A) citoplasmática y fraccionamiento de extracto nuclear se realizó en células de cáncer pancreático Panc1 y MiaPaCa seguido de recíproco co-inmunoprecipitación de endógeno proteínas en las fracciones de células. Western blot muestra que hPaf1 /PD2 interactúa con CHD1 en ambos extractos citoplasmáticos y nucleares de las células de cáncer de páncreas y Panc1 MiaPaCa. inmunoprecipitados anti-PD2 a partir de extractos de células Panc1 y MiaPaCa se inmunotransfirieron con un anticuerpo anti-CHD1. Del mismo modo, precipitados anti-CHD1 se transfirieron con anticuerpo anti-PD2. IgG de conejo se utilizó como control.
células (A) Panc1 y MiaPaCa fueron transfectadas con revueltos y oligos PD2 RNAi y 48 horas después de la transfección análisis de inmunofluorescencia se llevó a cabo. Confocal imágenes muestran que hay una disminución de localización de CHD1 en el núcleo (azul, se tiñeron con DAPI) de las células cancerosas de páncreas PD2 KD (panel central) en comparación con las células revueltos (panel superior). Las células se retransfected más con pBABE-hygro PD2 construir para la expresión ectópica de PD2, 72 horas después de la transfección intital. Confocal imágenes ilustran además de exógeno PD2 reshuttles CHD1 vuelta al núcleo (panel inferior). El recuadro representa PD2 y CHD1 localización en el núcleo (teñidas con DAPI).