Extracto
fosfatidiletanolamina-proteína de unión 4 (hPEBP4) es una nueva molécula de anti-apoptosis asociada con la resistencia de los tumores a los agentes apoptóticos humano. Aquí hemos tratado de investigar el papel de hPEBP4 en el radioresistance del cáncer de recto. análisis de inmunohistoquímica mostró hPEBP4 se expresó en 27/33 de los especímenes de cáncer de recto, pero sólo en 2/33 de la mucosa normal vecina. Silenciamiento de la expresión de hPEBP4 con siRNA redujo significativamente la supervivencia clonogénico y mejorado la apoptosis de células de cáncer rectal sobre la irradiación. En su lugar, la sobreexpresión forzada de hPEBP4 promueve su supervivencia y la disminución de la apoptosis. Western blot mostró hPEBP4 podría aumentar la activación de Akt inducida por la radiación, para los que se requieren espécimen reactivas de oxígeno (ROS). El efecto de radioresistance hPEBP4 se invirtió después de dada LY-294002 para inhibir la activación de Akt o antioxidante para suprimir la producción de ROS. También confirmó que el efecto de hPEBP4 in vivo con ratones desnudos. Por lo tanto concluimos que hPEBP4, expresa específicamente en las células del cáncer de recto, se asocia con radioresistance del cáncer de recto, lo que implica que la modulación de hPEBP4 puede tener importantes implicaciones terapéuticas en la radioterapia del cáncer de recto
Visto:. Qiu J, Yang G , Lin a, Shen Z, Wang D, L Ding (2014) fosfatidiletanolamina-Binding Protein 4 Promovido el radioresistance de cáncer rectal humano mediante la activación de Akt en una forma dependiente de ROS-humano. PLoS ONE 9 (3): e90062. doi: 10.1371 /journal.pone.0090062
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Agosto, 2013; Aceptado 28 de enero de 2014; Publicado: 3 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Qiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo financiero del Fondo Nacional de Ciencias Naturales de China (número de proyecto 81101876), el Fondo de investigación médica de Zhejiang Departamento de Salud Provincial (número de proyecto 2011RCA035), y el Fondo de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (número de proyecto Y2110782) y el Fondo de investigación médica de la ciencia departamento de tecnología de la provincia de Zhejiang (número de proyecto 2012C33SA100045). Los proveedores de fondos anteriores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es uno de los cánceres más prevalentes en todo el mundo. Se estima que hay cerca de 1,2 millones de hombres y mujeres que viven en los Estados Unidos con un diagnóstico previo de cáncer colorrectal, y un adicional de 143.460 serán diagnosticados en 2013 [1]. Entre los pacientes, avanzada cuentas cáncer rectal locales para una parte importante de ellos. Hoy en día la quimiorradioterapia preoperatoria se ha convertido en un componente integral en el tratamiento del cáncer de recto avanzado local, que se cree que es capaz de reducir el riesgo de recurrencia local y aumentar la probabilidad de que la cirugía de preservación del esfínter [2]. Desafortunadamente, no todos los cánceres rectales son sensibles a la radioterapia. Por ejemplo, se estima que sólo alrededor del 20% de los pacientes logran respuestas patológicas completas a radioterapia preoperatoria [3]. Así que la profundización de la comprensión de radioresistace nos puede ayudar a seleccionar a los pacientes con cáncer de recto radiosensibles para recibir radioterapia preoperatoria, evitar el retraso de la cirugía para los pacientes radioresistance e incluso superar radioresistance con nuevas estrategias radiosensibles.
hPEBP4 es un nuevo miembro de la familia PEBP [4]. Sobreexpresan en una amplia gama de tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama, cáncer de ovario y cáncer de próstata, hPEBP4 se ha demostrado para inhibir la apoptosis de las células cancerosas mediante la regulación de la degradación de las moléculas de apoptosis, tales como Bcl-2 /Bcl-X y la caspasa-3 [ ,,,0],5] - [8]. Teniendo en cuenta que la evasión de la apoptosis es una de las características de los cánceres humanos [9] y la citotoxicidad inducida por la radioterapia está mediada, en gran medida, por la inducción de apoptosis en células de cáncer [10], [11], se especula que hPEBP4 puede participar en la resistencia del cáncer de recto a la radioterapia preoperatoria. En realidad, nuestro estudio reciente demuestran hPEBP4 era un biomarcador predictivo independiente para la respuesta del cáncer de recto a la radioterapia preoperatoria, lo que sugiere que hasta la regulación de hPEBP4 podría ser un posible mecanismo por el cual las células cancerosas rectales evitar los efectos destructivos de la irradiación [12]. Sin embargo, aún no existe una prueba experimental directa sobre el papel de hPEBP4 en el redioresistance del cáncer de recto hasta el momento.
En el presente estudio, se analizó el estado de la expresión de hPEBP4 en muestras de cáncer de recto y de la mucosa normal adyacente así por inmunohistoquímica y explorado si hPEBP4 tiene un papel en la radioresistance de células de cáncer rectal humanos. Nuestros datos indican hPEBP4 fue relativamente expresa en tejidos de cáncer de recto y participó del radioresisitance del cáncer de recto, que era dependiente de Akt y ROS. Nuestro estudio implica que la modulación farmacológica o genética de hPEBP4 puede tener importantes implicaciones terapéuticas para mejorar el efecto curativo de la radioterapia preoperatoria para el cáncer rectal.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
todos los animales fueron criados utilizando protocolos que habían sido aprobados por el Comité de Cuidado y uso de animales del hospital de la tercera gente de Hangzhou, china según las directrices nacionales e internacionales pertinentes y el Comité para el Cuidado y uso de animales también aprobó este estudio para llevar a cabo. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito del donante para el uso de tejidos humanos en esta investigación, que también fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la tercera gente de Hangzhou.
Reactivos y la célula Cultura y
Lipofectamina reactivo y DCF-DA eran de Invitrogen (Carlsbad, CA). Los anticuerpos específicos para fosfo-Akt (Ser473) y Akt total fueron de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). Los inhibidores de PI 3-quinasa, LY-294002 se obtuvo de Calbiochem. N-acetil-Lcysteine (NAC) antioxidante (Sigma) se utilizó para inhibir la producción de ROS. Todas las células de cáncer colorrectal humano se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se mantuvieron en medio DMEM (Gibco, EE.UU.) suplementado con 10% (v /v) de suero de ternera fetal, 4,5 g /litro D-glucosa, no esencial aminoácidos (100 mM cada uno), 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, y glutamina 2 mM a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%.
Análisis inmunohistoquímico de hPEBP4 Expresión en Human cáncer rectal
Todos los cancerosas y cancerosas adyacentes tejidos rectales humanos confirmados mediante patología se obtuvieron de muestras de tumor resecado radicalmente con el consentimiento informado de cada paciente en el Departamento de Cirugía colorrectal, hospital de la tercera gente de Hangzhou, china. Las muestras fueron fijadas con formalina, incluidos en parafina, y immunostained con anticuerpos anti-hPEBP4 [4] utilizando el método complejo avidina-biotina peroxidasa (Cybrdi, Xian, Shanxi, China). La inmunorreactividad se evaluó basado en el porcentaje de células positivas teñidas. La intensidad se designa como 0 cuando no hay células tumorales mancha (negativo), 1 cuando el 10-20% de las células de tinción (tinción débil), 2 cuando el 20-50% de las células de tinción (tinción moderada), y 3 cuando más de 50% de las células de tinción (tinción fuerte). Para el análisis estadístico, los tejidos anotando 2 y 3 fueron combinados como definida positiva y tejidos anotando 0 y 1 fueron designados como negativo.
Cell La transfección
El vector de expresión hPEBP4 construido como se describe anteriormente [4] se transfectó en células SW480 usando reactivo Lipofectamine con pcDNA3.1 /Myc-His (-) B como control simulado. 48 h después de la transfección, las células se seleccionan bajo 0,8 mg /ml G418 (Merck, Darmstadt, Alemania) durante tres semanas.
colonias individuales resistentes a G418 se subclonaron como SW480 /hPEBP4 y SW480 /Mock. La expresión hPEBP4 se determinó por RT-PCR y análisis de transferencia Western.
hPEBP4 RNA interferencia en el ensayo
Para el silenciamiento estable de la expresión hPEBP4 en células humanas de cáncer rectal HRT-18, las células fueron transfectadas con la hPEBP4-siRNA o plásmido Neo usando el reactivo Lipofectamina como se describe anteriormente [5]. 48 h después de la transfección, las células se seleccionan bajo 0,6 mg /ml de G418 durante 25 días. Individuales colonias resistentes a G418 se subclonaron como HRT-18 /Mock y HRT-18 /hPEBP4-siRNA, y silenciar resultado de hPEBP4 se determinó por RT-PCR y análisis de transferencia Western.
RT-PCR para hPEBP4
ARN se recogió con TRIzol (Invitrogen) y se sintetizó ADNc con 1 ug de RNA total usando primera síntesis de ADNc kit-ReverTra Ace-α (Toyobo) a 42 y 99 ° C durante 20 y 5 minutos, respectivamente. reacción de PCR se realizó en un volumen de reacción de 10 l que consistía en un paso inicial de desnaturalización a 95 ° C durante 30 segundos y después de la amplificación de 30 ciclos a 95 ° C durante 5 seg, 56 ° C durante 30 seg. Cebadores específicos para hPEBP4 fueron 5'-GGGTTGGACAATGAGGCTG-3 '(sentido) y 5'-TGTGCTTGGGCTCGCTGGC-3' (antisentido).
Apoptosis Ensayo
Las células se lavaron, se resuspendieron en el tampón de tinción , y se tiñeron con Anexina V /PI apoptosis (Invitrogen) o R123 (R-302, Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante. Las células teñidas se analizaron por fluorescencia de células activadas por la clasificación (FACScalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA) .Experiments se repitieron tres veces.
Análisis Western Blot
BCA Protein Assay Kit Reactivo ( Pierce) se utilizó para medir la concentración de proteínas. Las muestras que contenían cantidades iguales de proteína fueron separadas por 12% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Protran. Las transferencias se sondearon con los anticuerpos indicados con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante apropiada como anticuerpos secundarios (Cell Signaling Technology). Se utilizó SuperSignal West Femto máxima sensibilidad sustrato (Pierce) para la visualización de quimioluminiscencia de proteínas [5].
Clonigénicas Ensayo de Supervivencia
en crecimiento exponencial las células del cáncer de recto en cultivo en monocapa se irradiaron en 100 mm placas de Petri utilizando una de rayos X 250-kVp (0,61 Gy /min) por exposición a la radiación sola. Después de la exposición a la radiación ionizante, se recogieron las células para el análisis de supervivencia clonogénico. La supervivencia después de exposición a la radiación se define como la capacidad de las células para mantener su capacidad clonogénica y de formar colonias. En pocas palabras, después de la exposición a la radiación, se tripsinizaron las células, se contaron, y se sembraron para la formación de colonias en 100 mm en placas de Petri 500-1000 células /placa. Después de intervalos de incubación de 21 días, las colonias se tiñeron con violeta cristal y se contaron manualmente. Las colonias que constan de más de 50 células se puntuaron, y tres platos replicados se contaron para cada tratamiento. Los experimentos se llevaron a cabo al menos 3 veces para todos los puntos de datos. se corrigieron Los resultados experimentales de los efectos inducidos por el control no irradiado. Los experimentos se repitieron tres veces.
Ensayo de activación de la caspasa
TRH /HRT Mock y /siRNA células se sembraron en placas de 96 pocillos (10.000 células por pocillo) y se irradiaron (8 Gy). Después de 24 horas de incubación, la activación de caspasas celulares 3/7 se midió mediante un ensayo de fluorescencebased (Apo-ONE homogénea caspasa-3/7 Ensayo; Promega). Seis pocillos por condición de tratamiento se utilizaron para obtener las señales de fluorescencia promedio y normalizado a las células HRT de control tratados con placebo.
Medición de ROS
Para el análisis de contenido de ROS, tratados y tratados con IR (8 Gy ) células de cáncer rectal adherentes se ensayaron primero para la viabilidad por exclusión de tripan colorante azul y se incubaron con 4 M DCF-DA durante 45 min a 37 ° C.Then las células se analizaron por citometría de flujo como se describe anteriormente [13]. Los experimentos se llevaron a cabo al menos 3 veces para todos los puntos de datos.
Los estudios in vivo de radiación
atímicos nu /nu ratones macho (4 semanas de edad) fueron compradas en el Centro de Experimentación Animal de Shanghai y se plantearon a través de protocolos que habían sido aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales institucional. 48 ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 2 × 10
6 HRT-18 /Mock y HRT-18 /siRNA células en muslo derecho, respectivamente. Cuando los tumores eran de aproximadamente 0,5 a 0,8 cm en el diámetro más largo, los ratones se irradiaron con 2 Gy fuente Cs-radiación cada tres días por tres veces como se ha descrito antes [14]. Los tumores fueron monitoreados y medidos con la fórmula V = (a × b
2) /2 cada tres días. La observación se cierra una vez que el volumen promedio de tumor de cualquier grupo alcanzó aproximadamente 2,0 cm
3. Todos los ratones fueron extirpados 33 días después de exposición a la radiación y la curva de tiempo el tamaño del tumor, así como la apoptosis de los tejidos tumorales se analizó.
TUNEL ensayo
Los tumores obtenidos se fija en 10% de formalina y embebidos en parafina después se extirparon los ratones. Después de la desparafinación, las muestras tumorales fueron despojados de proteína por incubación con 20 mg /ml de proteinasa K (Sigma Chemical) durante 15 min a temperatura ambiente. TUNEL tinción se realizó utilizando un kit de detección de apoptosis en situ (Roche) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los núcleos se tiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; fluorescencia azul), y las células TUNEL positivas se visualizaron por fluorescencia verde. Más de 200 células DAPI-positivos fueron examinados en 5 campos al azar de cada grupo, y se contaron las células TUNEL positivas para calcular la apoptosis in situ.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como media Los valores ± SD. La significación estadística de las diferencias entre grupos se analizaron por la prueba t de Student o ANOVA de una vía. Diferencia de la intensidad de la expresión hPEBP4 entre los tejidos con cáncer rectal humanos y tejidos rectales normales adyacentes se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Expresión de hPEBP4 El aumento en el cáncer rectal humano
Para dilucidar el patrón de expresión de hPEBP4, que examinó por primera la expresión de hPEBP4 tanto en tejidos de cáncer de recto humanos normales y tejidos del recto adyacentes con muestras de resección después de la cirugía radical utilizando análisis inmunohistoquímico. expresión hPEBP4 estaba presente en un porcentaje muy alto de tejido de cáncer rectal (78,8%, 26/33), en comparación con los porcentajes muy bajos en los tejidos rectales normales emparejados (6,1%, 2/33; P & lt; 0,001, Tabla 1, Fig 1A , B). Los datos demuestran el patrón de expresión preferencial de hPEBP4 en tejidos de cáncer de recto humanos. Para estudiar la función de hPEBP4 en respuesta a la radiación de cáncer rectal humano, la expresión de hPEBP4 en dos modelos celulares de cáncer colorrectal se examinaron, mostrando hPEBP4 se expresó fuertemente en las células HRT-18, pero muy moderadamente expresado en células SW480 (Fig 1C) .
a, B Opiniones expresión de hPEBP4 en el cáncer de recto humano y los tejidos adyacentes normales rectales con inmunohistoquímica (× 200);
C
expresión de hPEBP4 de líneas celulares de cáncer de recto humanos midió con western blot.
hPEBP4 Promovido Clonigénicas supervivencia de las células del cáncer rectal en respuesta a la radiación
Para examinar el papel de hPEBP4 en el radioresistance del cáncer de recto, establecimos primera transfectantes estables derribando expresión hPEBP4 y que sobreexpresan hPEBP4 en HRT-18 y células SW480, respectivamente. La eficiencia de la sobreexpresión o silencio de hPEBP4 fue confirmada por RT-PCR (Fig 2A). A continuación, se realizaron ensayos de formación de colonias en las dos líneas celulares para evaluar el efecto de hPEBP4 sobre la supervivencia celular después de la radiación. Se encontró que la supervivencia clonogénico de células HRT-18 en respuesta de la radiación se vio comprometida significativamente después hPEBP4 fue silenciado, mientras que la sobreexpresión de hPEBP4 reforzada como se muestra en las células SW480 (Figura 2B, C). Para confirmar el efecto de radioresistance hPEBP4, repetimos anteriormente experimentos con HT-29 y células Lovo como gen desmontables y modelos de sobreexpresión respectivamente (Fig 2D). Se encontró que la supervivencia clonogénico de células HT-29 fue significativamente comprometida después hPEBP4 fue silenciado, mientras que la sobreexpresión de hPEBP4 mejoró la supervivencia de las células Lovo después de la irradiación (Figura 2E).
A, España RT-PCR para confirmar la sobreexpresión estable de hPEBP4 en las células SW480 y el silencio de hPEBP4 en las células HRT-18;
B, C, España efecto de hPEBP4 sobre la supervivencia de las células clogenical HRT-18 y SW480;
D
, Western blot para confirmar el silencio estable de hPEBP4 en 29-HT células y la sobreexpresión de hPEBP4 en las células Lovo;
E
, efecto de hPEBP4 sobre la supervivencia de las células Lovo clogenical HT-29 y por el silencio y la sobreexpresión hPEBP4 respectivamente. *, P & lt;. 0,05
hPEBP4 participó en la resistencia de la apoptosis inducida por radiación de las células del cáncer rectal
Como se muestra en la Fig. 3
Un
, SW480 /células simuladas fueron sensibles a la apoptosis inducida por la radiación. Sin embargo, las células SW480 /hPEBP4 sobreexpresan hPEBP4 eran relativamente resistentes a la apoptosis inducida por la radiación, lo que indica que hPEBP4 confiere la resistencia a la radiación en el cáncer de recto. De acuerdo con ello después de hPEBP4 fue silenciado, HRT-18 células se volvieron más sensibles a la apoptosis inducida por la radiación en comparación con las células HRT-18 /simuladas (Fig. 3
B Opiniones). El efecto anterior de hPEBP4 también se repitió en otro experimento desmontables y sobreexpresión con células HT-29 y Lovo como modelos (Fig. 3C), lo que confirma adicionalmente el efecto de hPEBP4 en resistencia a la radiación en células de cáncer rectal. hPEBP4 podría inhibir la apoptosis inducida por la radiación mediante la restricción de la activación de caspase3 y 7 (Fig. 3D). Teniendo en cuenta que después de la activación de la cascada de caspasas, la escisión proteolítica específica de la proteína PARP es un evento importante para la aparición de la apoptosis, el efecto de hPEBP4 en PARP se examinó después de la irradiación. Con hPEBP4 silenciamiento combina con radiación, se observó una degradación obvia de 116 kDa PARP en una proteína de fragmentación 85 kDa en comparación con la radiación solamente (Fig 3 E), lo que confirma que hPEBP4 inhibe la apoptosis inducida por la radiación de las células de cáncer rectal, representada por la activación de caspasa-3 y PARP división proteolítica
a, España consecuencia Representante de FCM para mostrar el efecto de hPEBP4 en la apoptosis inducida por irradiación de las células SW480.;
B, resultado representativo de FCM para mostrar el efecto de hPEBP4 en la apoptosis inducida por irradiación de las células HRT-18; C, histograma para resumir el efecto de hPEBP4 en la apoptosis inducida por irradiación de la TRH-18 (hPEBP4-siRNA), HT-29 (hPEBP4-siRNA), SW480 (hPEBP4 sobreexpresión) y las células Lovo (hPEBP4 sobreexpresión);
D, España efecto de hPEBP4 en la inducida por irradiación capase3 /7 de activación del cáncer de recto HRT-18 células;
E, España efecto de hPEBP4 en el cleavge PARP inducida por irradiación del cáncer de recto HRT-18 células. *, P & lt; 0,05; **, P & lt;. 0,01
mediada por la radiación hPEBP4 resistencia de las células del cáncer rectal fue la activación de Akt y Akt ROS dependiente
Se ha demostrado que participan en radioresistance de numerosos tumores [15] - [17]. Así que hemos explorado el papel de Akt en la resistencia mediada por hPEBP4 a la apoptosis inducida por la radiación. En primer lugar, se analizó la activación de Akt después de la radiación. Encontramos Akt se activa de forma espectacular después de la radiación en las células de cáncer de recto que fue promovida por hPEBP4 (figura 4A). Para determinar si radioresistance mediada por hPEBP4 requiere la activación de Akt, entonces preincubaron células de cáncer rectal con 20 M LY-294002 de 1 h y se trataron las células con radiación. Se encontró que LY-294002 casi revirtió el efecto inhibidor de hPEBP4 sobre la apoptosis inducida por la radiación tanto en células SW480 (Fig. 4B) HRT-18 y. Como la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) se ha informado a desempeñar un papel importante en la apoptosis inducida por la radiación de las células del cáncer [18], también se evaluó el efecto de hPEBP4 sobre el estado redox intracelular. Como se muestra en el análisis de citometría de flujo con DCFH-DA, hPEBP4 solo no tuvo efectos sobre el estado redox intracelular. Sin embargo, la exposición a la radiación causó un aumento significativo en la acumulación de peróxidos intracelulares en células de cáncer rectal. Pero no hubo ningún cambio significativo para el nivel de peróxidos intracelulares en células de cáncer de recto después de hPEBP4 fue silenciada o sobreexpresada (Fig4 C, D). Aún así, el uso concomitante de antioxidante NAC (pretratamiento durante 4 horas a la concentración de 5 mM) con radiación casi invirtió el efecto de hPEBP4 sobre la apoptosis inducida por la radiación de las células de cáncer de recto (Fig 4E). Curiosamente, el uso concomitante de NAC y la radiación también inhibió la regulación de Akt por hPEBP4 (figura 4F), lo que sugiere que las ROS es requerido por hPEBP4 para modular Akt en el contexto de los eventos apoptóticos inducidos por la radiación. En conjunto, estos resultados indicaron que hPEBP4 promovió la radioresistance de células de cáncer de recto, actuando en el medio de la vía de señal de ROS y Akt, que puede activar más caspasas para activar la apoptosis.
A,
transferencia de Western para mostrar el efecto de hPEBP4 en la activación de Akt después de la irradiación con células de cáncer rectal SW480 HRT-18 y;
B, tinción con anexina V /PI para mostrar se requiere la activación de Akt en el efecto de radioresistance hPEBP4 en HTR-18 y SW480 células por hPEBP4 silencio y la sobreexpresión respectivamente;
C
, Representante ROS resultado de la tinción para mostrar hPEBP4 tuvo ningún efecto sobre el nivel intracelular de ROS en HRT-18 células de cáncer de recto;
D
, histograma para mostrar hPEBP4 tuvo ningún efecto sobre el nivel intracelular de ROS en las células HRT-18 y cáncer de recto SW480 por hPEBP4 silencio y la sobreexpresión respectivamente;
E
, se requería Resultado de la tinción con anexina V /PI para mostrar el efecto de ROS en radioresistance de hPEBP4; .
F
, se requería resultado representativo de western blot para mostrar las ERO en la activación de Akt por hPEBP4 después de la irradiación con HRT-18 como modelo de estudio *, P & lt;. 0,05
Participa hPEBP4 la radioresistance de los cánceres rectales en vivo
Para determinar si hPEBP4 también puede mediar en la radioresistance de cáncer colorrectal en vivo, hemos examinado el efecto de la radiación sola, hPEBP4 silenciados por sí solo, o en combinación sobre el crecimiento del subcutánea HRT-18 de xenoinjertos de tumores rectales en ratones desnudos (figura 5A). Desde el día decimoquinto, el volumen del tumor en el grupo de tratamiento combinado fue significativamente menor que la de la radiación único grupo. Retraso en el crecimiento después del tratamiento combinado fue más que la causada por cualquiera de los otros tratamientos (Fig 5B). imágenes representativas del volumen del tumor en el día decimoquinto se ilustran en la figura 5C. También se observó la apoptosis de las células tumorales in situ, lo que indica que hubo un mayor índice de apoptosis dramático en HRT grupo /hPEBP4 RNAi que en HRT /grupo Mock (figura 5D, E).
a, diagrama de flujo Red de los experimentos in vivo;
B, curva de crecimiento
para el efecto de hPEBP4 en el tumor rectal humano transplantado in vivo después de la irradiación;
C, España imagen representativa del tumor rectal trasplantado en la almohadilla plantar de ratones desnudos para cada grupo de 15 días después de la irradiación;
D,
foto TUNEL representativa para mostrar in situ apopatosis de los tumores rectales trasplantados para cada grupo después se sacrificaron los ratones;
E
, in vivo Resumen de la apoptosis después de la irradiación de los ratones cada uno gourp.
Discusión
El objetivo del presente estudio fue determinar el efecto de hPEBP4 en el radiosensibilidad de cáncer colorrectal. Nuestros resultados sugieren que hPEBP4 mejora la radioresistance de células de cáncer colorrectal, tanto in vitro como in vivo, que fue mediada por la promoción de la activación de ROS dependiente de Akt.
La radioterapia preoperatoria se ha convertido en una parte estándar del tratamiento integral de la localmente avanzado cáncer de recto. Sin embargo, muchos pacientes de cáncer rectal son realmente resistentes a la radioterapia debido a la heterogeneidad del cáncer de recto a la respuesta de la irradiación. Para esos pacientes, la radioterapia preoperatoria no sólo retrasa la pronta intervención de cirugía, pero también puede causar efectos tóxicos graves, como la pérdida de la anastomosis, la infección de la herida perineal, y afecta negativamente a la función del esfínter anal después de la cirugía de preservación del esfínter [19], [20]. Así que la exploración del mecanismo de radioresistance del cáncer de recto es muy importante para mejorar la eficiencia del tratamiento. Se ha demostrado que la apoptosis inducida por la radiación es un mecanismo importante de la radiosensibilidad en un panel de células de cáncer incluyendo el cáncer de colon [21], [22]. Por lo tanto, un agente que es capaz de mejorar la apoptosis inducida por la radiación de las células tumorales puede tener el potencial de convertirse en un agente radiosensibilizador. hPEBP4 es un nuevo miembro de la familia de proteínas phosphatidylethanolaminebinding, identificado a partir de células estromales de médula ósea humana [4]. La sobreexpresión de hPEBP4 en mama, próstata y ovario cánceres se ha demostrado que inhiben la apoptosis de las células cancerosas [4] - [8]. Así que le preguntamos si hPEBP4 jugar un papel en la respuesta del cáncer de recto a la radioterapia. En realidad, en un trabajo reciente, habíamos demostrado que la expresión hPEBP4 en una muestra de biopsia pretratamiento como un predictor independiente de la respuesta a la radioterapia preoperatoria en pacientes con cáncer de recto y nos encontramos una regulación al alza dramática de expresión hPEBP4 en tejidos de cáncer de recto después de la radioterapia preoperatoria CompraRED con el muestra de la biopsia durante la colonoscopia, lo que sugiere que hPEBP4 podría desempeñar un papel en la radioresistance del cáncer de recto, a través de un vínculo directo entre hPEBP4 y radioresistance no se proporcionó en ese momento [12]. Ahora, con el presente trabajo, se caracterizó la expresión relativamente específico de hPEBP4 en los cánceres rectales en comparación con los tejidos normales adyacentes rectales y proporcionó la prueba experimental directa sobre el efecto de radioresistance hPEBP4 en el cáncer de recto. También hemos descrito el mecanismo subyacente de ese efecto, que debe converger en la vía de señalización Akt-ROS. Sin embargo, no sabíamos el caso de la señal exacta a la baja de ROS, a través del cual hPEBP4 activa Akt para promover la radioresistance de signi rectal. Para la radiación de transferencia de energía lineal de baja, que se utiliza con mayor frecuencia en la radioterapia del cáncer de recto en la actualidad, el oxígeno y sus derivados, tales como los radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS) son muy importantes en la muerte de células tumorales en lugar de un ataque directo sobre el ADN de rayos radiactivos [23]. Pero el papel de ROS en la radioterapia de tumor es un poco complicado. Por un lado es ROS mediadores críticos del ionizante destrucción celular inducida por la radiación, y por otro lado ROS pueden proporcionar células tumorales con ventaja de supervivencia sobre homólogos normales bajo condiciones de estrés. De hecho ROS son importantes moléculas de señalización intracelular que regulan el equilibrio entre la supervivencia y la muerte celular [18], [24] - [26]. AKT parece ser un factor crítico en radioresistance por regulación de la apoptosis, el crecimiento celular, la captación de glucosa y la utilización, y la síntesis de proteínas tales como 2 Bcl-miembros de la familia, la caspasa-3/9, FKHRL1, la liberación de citocromo c de la mitocondria [27 ] - [30]. Crosstalk entre señal vía ROS y Akt se ha demostrado que existen en una gran cantidad de células tumorales. La radiación ionizante en el intervalo de dosis terapéutica puede inducir una transición de permeabilidad mitocondrial reversible y estimular una generación transitoria celular de ROS, que puede entonces actuar como segundos mensajeros en la transducción de señales [31] - [32]. Nuestro presente estudio mostró que la activación de Akt por hPEBP4 en células de cáncer rectal sobre la irradiación se suprimió después de antioxidante fue dado a inhibir la producción de ROS, pero hPEBP4 no tuvo efecto sobre el nivel intracelular de ROS, lo que sugiere que hPEBP4 promueve específicamente la activación de Akt de ROS después de la irradiación en células de cáncer de recto. En realidad, tanto una supervivencia y efecto apoptótico también pueden existir para la vía Akt señal después de activado por ROS [33] - [36]. Sobre la base de los datos que obtuvimos de este estudio, creemos que hPEBP4 puede representar una molécula señal de supervivencia mediante la activación de la vía de señalización ROS-Akt en el contexto de la radioterapia del cáncer de recto. En concreto se sobreexpresa en las células cancerosas, hPEBP4 ayuda a las células cancerosas para resistir desequilibrada muerte inducida por la radiación a través del fortalecimiento selectivamente la señal de supervivencia aguas abajo de ROS después de la radioterapia. Incluso podemos hacer una especulación atrevida que Src quinasa puede ser el esqueleto intermedio de la interacción entre hPEBP4, ROS y Akt, ya que hemos proporcionado la evidencia directa de la asociación entre hPEBP4 y Src en otro trabajo con células de cáncer de mama y Src se había demostrado que se requiere en la activación de Akt por ROS anteriormente [32], [37].
en resumen, es el primer informe que sugiere un papel de hPEBP4 en el radioresistance del cáncer de recto y también de forma preliminar seguido a cabo el mecanismo molecular de ese efecto. Además, el valor predictivo de hPEBP4 en el radioresistance del cáncer de recto con muestras tumorales clínicos en nuestro informe reciente [12], creemos hPEBP4 puede ser un objetivo potencial para mejorar la sensibilidad de la radioterapia para el cáncer rectal. Es necesario seguir trabajando para demostrar la eficacia de la terapia dirigida-hPEBP4 en la promoción de la radioterapia en modelos animales de cáncer de recto y revelar el cuadro negro del caso de la señal entre ROS y Akt, en la que se integra hPEBP4 para desempeñar su función.
Reconocimientos
Agradecemos al profesor Wang Fan para su discusión útil y la señorita Yu por su apoyo en el horario de trabajo.