Extracto
Se presenta cambios mecánicos de células en respuesta a la alteración de la expresión de lo humano equilibrador de nucleósido Transporter- 1 (hENT1), una membrana de plasma transportador de nucleósidos más abundante y ampliamente distribuido en las células y /o tejidos humanos. La modulación del nivel de expresión hENT1 altera la rigidez de células de cáncer pancreático Capan-1 y Panc 03.27, que fue analizado por microscopía de fuerza atómica (AFM) y en correspondencia con la plataforma de microfluidos. La reducción inducida hENT1 desmontables de rigidez celular tanto en células de hasta 70%. Además, no se observaron cambios fenotípicos celulares, tales como la morfología celular, la migración, y el nivel de expresión de marcadores de transición (EMT) epitelio-mesénquima después de hENT1 caída. Las células con hENT1 suprimida se hicieron alargadas, migran más rápido, y habían reducido E-cadherina y elevados de N-cadherina en comparación con las células parentales que son consistentes con la transición epitelio-mesenquimal (EMT). Esos cambios fenotípicos celulares estrechamente correlacionados con cambios en la rigidez celular. Este estudio sugiere que el nivel de expresión hENT1 afecta fenotipo celular y el comportamiento elástico de células puede ser un marcador biológico para la expresión física hENT1 cuantificar y detectar cambio fenotípico. Por otra parte, la mecánica de células pueden ser una herramienta fundamental en la detección de la progresión y la respuesta al tratamiento de la enfermedad
Visto:. Lee Y, Koay EJ, Zhang W, Qin L, Kirui DK, Hussain F, et al. (2014) Human equilibrador transportador de nucleósidos-1 Mecánica Derribo Tunes celular a través de la transición epitelio-mesenquimal en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 9 (10): e107973. doi: 10.1371 /journal.pone.0107973
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 3 Julio, 2014; Aceptado: August 16, 2014; Publicado: 14 Octubre 2014
Copyright: © 2014 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel y su apoyo a los archivos de información
Financiación:. Los autores agradecen el apoyo financiero de las siguientes fuentes: Departamento de Defensa otorga W81XWH-09-1-0212 y W81XWH-12-1- 0414, Instituto Nacional de Salud subvenciones U54CA143837 y U54CA151668, la subvención RP121071 CPRIT del Estado de Texas, y la Cátedra Distinguida Ernest Cockrell Jr.. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
adenocarcinoma pancreático (PDAC) es uno de los cánceres humanos más letales con un muy mal pronóstico [1]. PDAC tiene baja tasa de supervivencia, incluso después de la resección completa del tumor, que es la única posibilidad de curación. Desafortunadamente, la mayoría de los tumores son inoperables y metastásico. Por lo tanto, la quimioterapia y /o radioterapia son las únicas opciones [2], [3]. La gemcitabina (2 ', 2'-difluorodesoxicitidina) es uno de los agentes anticancerígenos eficaces para el cáncer de páncreas [1]. Es un análogo de desoxinucleósido citotóxica pirimidina que se transporta en el compartimento celular a través de la proteína de transporte primaria, humano equilibrador transportador de nucleósidos-1 (hENT1), y, finalmente, inhibe la replicación del ADN. El nivel de expresión hENT1 en las células de cáncer de páncreas previamente se ha correlacionado con la eficacia terapéutica en los que se demostró que las células con mayor expresión hENT1 para responder mejor a la gemcitabina. Además, los estudios a nivel celular han demostrado también que las células de cáncer pancreático con baja expresión hENT1 son altamente resistentes a la gemcitabina [4]. Por otra parte, los estudios clínicos han demostrado que la expresión hENT1 afecta a cómo los pacientes responden al tratamiento en pacientes cuyo tumor se expresa bajo biomarcador hENT1 pobre respuesta a la terapia con gemcitabina [3], [5].
cáncer de páncreas células que adquieren resistencia a gemcitabina se caracterizan por una transición fenotipo epitelial-mesenquimal (EMT) y mostrar distintos cambios morfológicos de epitelial a la motilidad celular en forma de huso y el aumento de [6], [7]. EMT es un proceso biológico que las células epiteliales polarizadas cambio a un fenotipo mesenquimal-como a través de múltiples cambios bioquímicos. Esta transición fenotípica se caracteriza por la pérdida de adhesión célula-célula y cambios dinámicos en la estructura del citoesqueleto, que causan que las células se separan de epitelio y para obtener la capacidad de migrar a sitios distantes [8], [9]. Por lo tanto, en este estudio, la hipótesis de que la modulación de los niveles de expresión hENT1 en células de cáncer pancreático puede alterar sus características fisiológicas, ya que puede inducir cambio fenotípico mediante la inhibición de la absorción de gemcitabina. Además de los métodos bioquímicos para identificar cambios fisiológicos celulares, la mecánica de células comprensión puede proporcionar nuevos conocimientos biológicos. Estudios recientes revelan que las propiedades mecánicas de células proporcionan información crucial para comprender varios comportamientos biofísicos que incluyen la forma celular, la motilidad y la adhesión de células que generan una cascada de señales bioquímicas que son críticos para las respuestas biológicas [10]. Las firmas mecánicas de células pueden ser una herramienta importante en varios aspectos: (1) La identificación de las células cancerosas de las células normales en función de su rigidez relativamente menor [11]; (2) previsión de una potencial metastásico de las células cancerosas como rigidez celular se correlaciona inversamente con la migración y la invasión [12] - [14]; (3) El reconocimiento de los cambios fenotípicos asociados con la alteración en la estructura intracelular y la motilidad de las células cancerosas mediante la medición de los aumentos o disminuciones en el módulo de elasticidad [11], [15] - [18]. Aunque no hay evidencia directa de que hENT1 está relacionada con eventos fenotípicos en células de cáncer pancreático, podemos especular que la expresión hENT1 puede modular comportamientos biofísicos celular basada en la estrecha correlación entre la expresión y la sensibilidad hENT1 gemcitabina. El cambio fenotípico celular a partir de células resistentes a gemcitabina establecidos mediante el cultivo de células en serie para aumentar la concentración de gemcitabina también apoya nuestra hipótesis.
En este estudio, dos métodos diferentes, AFM y una plataforma de microfluidos, se utilizaron para evaluar la forma en la modulación de la hENT1 influencias nivel de expresión en la rigidez de las células de cáncer de páncreas. A continuación, las alteraciones morfológicas que se acompañan, citoesqueleto reordenamientos, la motilidad celular, y cambios en los niveles de expresión de los marcadores de EMT para investigar cambio fenotípico celular se caracterizaron (Figura 1). Juntos, nuestros resultados en el nivel de expresión hENT1 y rigidez celular se correlacionan muy bien con las alteraciones mecánicas de la estructura del citoesqueleto intracelular, la motilidad celular, y sugieren que las propiedades elásticas celulares pueden estimar el nivel de expresión hENT1, así como cambio fenotípico.
El hENT1 desmontables induce cambios en la mecánica celular a través de la EMT acompañadas por alteraciones en e-cadherina y N-cadherina niveles de expresión, la morfología celular y la motilidad de las células de cáncer de páncreas. Además, hENT1 caída induce disminución en la rigidez de células como se ha demostrado en las curvas de separación de la fuerza representativos obtenidos a partir de células Panc 03.27 (gráfico superior a partir de una célula madre; el segundo gráfico a partir de una célula de derribo hENT1). AFM utilizando
Materiales y Métodos
cultivo celular
Todas las líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). El AsPC-1, BxPC-3, MIA Paca 2, y Panc-1 células fueron cultivadas en Dulbecco Modificado Eagles Medium (DMEM, Thermo Hyclone Scientific, Waltham, MA) con 10% de suero bovino fetal (FBS, ATLAS Biológicos, Fort Collins , CO), Capan-1 en DMEM con 20% FBS, y Panc 03,27 en RPMI 1640 (Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA) con 15% de FBS y la insulina humana recombinante (10 unidades /ml, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) en presencia de 5% de CO
2 a 37 ° C.
desmontables con siRNA transfección hENT1
las células fueron cultivadas en placa de 6 cm de cultivo celular a una densidad de 5 x 10
5 células /placa. Después del lavado con PBS, las células fueron tratadas con INTERFERin (Polyplus transfección ™) que contiene siRNA contra hENT1 (SmartPool: en-blanco más SLC29A, Dharmacon, Inc., Pittsburgh, PA) o siRNA (control negativo negativo silenciador Nº 1 siRNA, AM4635 , Invitrogen, Grand Island, NY) a una concentración de 50 nM en Opti-MEM (Invitrogen, Grand Island, NY). Después de 24 horas de la transfección, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante 3 días.
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron con tampón RIPA Pierce (Thermo Scientific, Waltham, MA) con inhibidor de la proteasa cóctel (Thermo Scientific, Waltham, MA). Los lisados celulares (10 g) con tampón de carga (tampón de muestra LDS no reductoras, Thermo Scientific, Waltham, MA) se calentaron durante 5 minutos a 95 ° C. Los lisados celulares y la escalera de proteínas (Protein Xpert 2 prestained Marker, GenDEPOT) cargados en geles de poliacrilamida (Cualquier kD Mini PROTEAN TGX Precast Gel, Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfirieron a nitrocelulosa de membrana (Bio-Rad, Hercules, CA) . Las transferencias se bloquearon con tampón de bloqueo, TBST (NaCl 20 mM TRIS pH 7,6 /150 mM /0,05% de Tween 20) que contiene 5% de leche durante una hora. Las transferencias se incubaron durante la noche con TBST y 5% de leche que contiene anticuerpos primarios en determinados ratios: anticuerpo anti-hENT1 (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anticuerpo anti-E-cadherina (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anticuerpo anti-N-cadherina (1:500, Abcam, Cambridge, MA); citoqueratina 18 (1:1000, tecnología de señalización celular, Danvers, MA); Lamina A /C (1:1000, tecnología de señalización celular, Danvers, MA); anticuerpo anti-GAPDH (1:2000, tecnología de señalización celular, Danvers, MA). Después de lavar tres veces con TBST, los blots se incubaron con TBST y 5% de leche que contienen anticuerpos secundarios, anti-IgG de ratón, anticuerpo unido a HRP (1:5000, la tecnología de la señalización celular, Danvers, MA) o IgG anti-conejo, HRP anticuerpo -vinculada (1:5000, la tecnología de la señalización celular, Danvers, MA), durante una hora a temperatura ambiente. Luego, las transferencias colocan sobre una mezcla de Pierce ECL Western Blot sustrato (Thermo Scientific, Waltham, MA) y Lumigen TMA-6 (Lumigen, Inc., Southfield, MI), y se detectaron las proteínas.
Inmunofluorescencia
cáncer de páncreas células fueron sembradas en placas de 6 pocillos que contienen esterilizado, colágeno I (Invitrogen, Grand Island, NY) presenta el revestimiento cubreobjetos (22 × 22 mm, Corning) a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo. Las células se prepararon con tres grupos: 1) control (sin tratamiento); 2) scramble (transfectadas con ARNsi de control negativo); y 3) la caída hENT1. Las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído (Affymetrix, Santa Clara, CA) durante 30 min a temperatura ambiente y luego se permeabilizaron con 2% de Triton X-100 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 min. Después del bloqueo con 2% de albúmina de suero bovino (Calbiochem) durante 1 hora, las células se incubaron durante la noche con anti-anticuerpo Vinculina (1:200, Abcam, Cambridge, MA), anti-E-cadherina (1:200), anti- N-cadhrein (1:100), anti-cytoketarin 18 (1:200), o anti-Lamin a /C (1:200) a 4 ° C con agitación suave. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS durante 10 min y se incubaron con Alexa 488 o anticuerpos secundarios conjugados 594 durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, para la tinción de F-actina, las células se incubaron con Alexa Fluor 488 faloidina (1:250, Invitrogen, Grand Island, NY) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, los núcleos se tiñeron utilizando Hoechst 33342 (Molecular Probes, Life Technologies, Grand Island, NY) durante 10 min. Las células fueron controlados por confocal microscopio de escaneo láser (CLSM, Olympus FluoView FV1000).
mediciones AFM
rigidez celular se midió por la técnica de la fuerza de la curva en un Bioscope (Bruker Corporation, Billerica, MAMÁ). Las células se cultivaron en 6 cm placa de cultivo celular y todas las mediciones se realizaron en medio de cultivo a 37 ° C. El AFM estaba equipado con un microscopio de luz invertida (Olympus IX81) de modo que fueron monitoreados constantemente las células. Para reducir al mínimo el daño celular, micropartículas de sílice (diámetro: 5 micras) de nitruro de silicio voladizos modificados (Novascan Technologies, Inc., Ames, IA) con valores constantes de resorte aproximada de ~0.06 N /m fueron empleados en todos los experimentos de AFM. El valor constante de muelle exacta se midió por el método de sintonización térmica. Las sondas se colocan en las proximidades de núcleos de las células bajo el control óptico, y curvas de fuerza se adquirieron a una frecuencia de muestreo de 1 Hz. El módulo de Young, E, se calcula a partir de curvas de fuerza obtenidos basado en el modelo de Hertz (Ec. 1) utilizando el programa de análisis Nanoscope de empresa Bruker. (1) donde F = fuerza, módulo E = de Young, ν = coeficiente de Poisson (ν = 0.5, en este estudio), R = radio del penetrador (R = 2,500 nm, en este estudio), y δ = profundidad de la huella.
curvas
Para obtener el módulo de Young, dos experimentos independientes se realizaron y de la fuerza de se recogieron al menos 50 células en cada experimento.
diseño de MS-chip y fabricación
Las obleas de silicio (4 pulgadas) de Corning Inc. SU-8 2015 fotoprotector, y SU-8 desarrollador de se han usado MicroChem Corp. y polidimetilsiloxano (PDMS RTV615) de Momentive Performance Materials Inc.. El patrón microchip fue diseñado con el software AutoCAD (Autodesk Inc.) y luego se imprime como 10 micras máscaras resolución de cromo por las fotos Science Inc. El patrón fotomáscara se tradujo por primera vez en una microestructura en una oblea de silicio-4 en el uso de SU-8 2015 fotorresistente, que es un molde para la fundición de materiales de PDMS. En pocas palabras, el molde se preparó por recubrimiento por rotación SU-8 2015 fotorresistente sobre una oblea de silicio y la reticulación por UV durante 180 segundos. Posteriormente, el patrón diseñado fue desarrollado utilizando SU-8 desarrollador (Microchem Corp.) y se limpia con alcohol isopropílico y gas nitrógeno. Los agujeros para las entradas y salidas fueron perforados con agujas. La capa de PDMS se limpió por lavado con alcohol isopropílico y agua desionizada, y se secó con gas nitrógeno. Después del tratamiento con plasma de oxígeno, la capa de PDMS se unió inmediatamente a un portaobjetos de vidrio 75 x 50 mm. Por último, el dispositivo de servidumbre se coció durante 2 horas a 80 ° C.
on-chip de separación de células
Los canales en MS-chip y el tubo de Tygon conectado a la entrada de chip se humedecieron con PBS y después se mantuvo con 0,5% de BSA en PBS durante 1 hora. BSA bloquea la adhesión de la superficie y evita además no específica de las células de PDMS. Membranas de las células control y hENT1 desmontables se tiñeron utilizando Alexa Fluor 594 o 488-conjugado con aglutinina de germen de trigo (Invitrogen, Grand Island, NY), respectivamente. Se preparó la mezcla de células en cantidades iguales a una densidad final de 1 × 10
5 células /ml. Las células suspendidas se aplicaron a la MS-chip a través de un tubo Tygon. Durante el experimento, se aplicó gas nitrógeno comprimido a la suspensión celular a una presión de ~ 10 psi (69 × 10
3 Pa). Una separación típica duró ~ 15 min, y la velocidad de flujo promedio se controló a 1-2 ml /h. Las células aplicadas a la MS-chip se obtuvieron imágenes por microscopía de fluorescencia (IX81, Olympus). Número de células retenidas en el chip después de la separación fue contado por Imagen J.
in vitro
cero ensayo
El ensayo se llevó a cabo cero en cualquiera de las células nativas (control) o transfectadas células (scramble y siRNA contra hENT1) para estudiar el efecto de la caída hENT1 sobre la migración celular. células Capan-1 o Panc 03.27 se sembraron en placas de 24 pocillos. Cuando las células son de aproximadamente 50 a 60% de confluencia, las células se lavaron con PBS y después se transfectaron con INTERFERin contiene siRNA contra hENT1 o siRNA negativo a una concentración de 50 nM en Opti-MEM. Después de 6 horas de transfección, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante 2 días. Un rasguño de la monocapa celular fue creado mediante el uso de una punta de pipeta. A continuación, las placas se lavó y se sustituye con el medio deseado. Se utilizó el lapso de tiempo del microscopio (Imaging System Auto EVOS FL, Life Technologies) con la cámara (95% de aire y 5% de CO
2) y el control de la temperatura (37 ° C) para la adquisición de las imágenes del mismo campo automáticamente 18 horas. Las imágenes obtenidas se analizaron cuantitativamente mediante una imagen J.
El análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± desviación estándar. La significación estadística fue identificado por análisis de dos vías ANOVA utilizando GraphPad Prism 5.0. Un valor de p. & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados y Discusión
Para investigar la correlación entre la mecánica de nivel de expresión hENT1 y celulares, dos tipos de líneas celulares de cáncer de páncreas, Capan-1 y Panc 03.27 con relativamente más alta expresión hENT1 (Figura S1 en el archivo S1), se eligieron. De siRNA transfección, las células se establecieron downregulated hENT1 (Figura 2). A continuación, medir los cambios en la mecánica de células mediante dos métodos diferentes, AFM y la separación de microfluidos. medidas de AFM propiedades elásticas de las células vivas a través de una interacción mecánica directa entre una sonda y la superficie celular. la rigidez de la célula afecta a la extensión de la deflexión en voladizo de la interacción con la superficie de células adherentes [19]. Una muesca en vivo de células induce la deformación de los compartimentos celulares que incluyen la membrana, citoesqueleto, núcleo, y diversos orgánulos. Por lo tanto, las propiedades elásticas de las células como resultado de los efectos agregados de deformación de numerosos componentes celulares. Se utilizó un micropartículas de sílice (diámetro: 5 micras) en voladizo modificado (Figura S1 S2 en Archivo) para reducir el daño de la membrana celular durante el contacto y sesgar el conjunto de datos de manera diferente que una punta afilada. Para optimizar la fuerza de indentación, se aplicó la fuerza hasta un 10 nN como se muestra en la Figura S1 S2 en Archivo. se obtuvo un módulo de células Panc 03.27 de una constante joven dentro de las fuerzas de indentación hasta 200 pN, lo que indica la medición de la rigidez celular utilizando AFM sólo es válida en pequeñas deformaciones de las células vivas. Ambas líneas celulares mostraron una tendencia similar bajo la misma fuerza de indentación, es decir, 100 pN. Las células de control y las células transfectadas por siRNA negativos fueron significativamente más rígidas que las células hENT1 desmontables (Figura 2 y la Figura S3 en S1 archivo). La rigidez celular promedio de ambas células de control es de 2.95 ± 1.55 kPa (Capan-1) y 1,91 ± 0,78 kPa (Panc 03.27); sin embargo, que las células de hENT1 desmontables mostraron significativamente disminuyeron módulos de Young con valores de 1,50 ± 0,63 kPa (Capan-1) y 0,59 ± 0,22 kPa (Panc 03.27).
(A) transferencias Western de hENT1 (55 kDa ) y GAPDH (37 kDa) en Capan-1 (izquierda) y Panc 03.27 células (derecha) y sin tratamiento (ctrl) o después del tratamiento de siRNA negativo (SCRL) o hENT1 siRNA (hENT1 ↓), (B) histogramas de barras muestran Young módulo de control, transfectadas siRNA negativo, y hENT1 desmontables células. (N.S: estadísticamente no significativa)
Desde AFM se limita a la medición local de la mecánica de las células, también se evaluó la deformabilidad celular utilizando el método de separación de microfluidos [20] para corroborar los resultados de AFM.. Un chip de separación mecánica (MS-chip, la Figura 3A) fue diseñado con microbarriers artificiales en combinación con fuerza hidrodinámica a deformable separada de células rígidas [21]. Para demostrar la capacidad de la MS-chip a las células separadas en base a la deformabilidad, hemos probado la separación de una mezcla que contiene dos células diferentes: control y desmontables hENT1. Membrana de control y células hENT1 desmontables se tiñó mediante el uso de Alexa Fluor 594 y 488 aglutinina de germen de trigo conjugada (WGA), respectivamente. Como se muestra en la figura S4 en S1 del archivo, el efecto de WGA en la rigidez célula es insignificante. La proporción de las dos líneas celulares varía a lo largo de la longitud del chip. Como se muestra en la figura 3D y 3G, los diámetros de ambas células, control y desmontables hENT1, fueron similares. La mezcla de células en cantidades iguales a una densidad de 1 × 10
5 células /ml se inyectó a MS-chip y fluía por 15 min. La matriz de brechas entre los postes en este rango diseñado MS-chip de 22 micras a 2 micras. Los canales de evitar la obstrucción que se produce en la repetición de series de mensajes que regulan y equilibrar la presión hidrodinámica a través del chip. Se supone que no hay contacto físico entre los pilares y las células PDMS porque el PDMS está recubierto con BSA. La tensión de corte es un factor principal para interactuar con las células. Cuando el tamaño de la separación de las matrices de correos es más grande que el diámetro celular, fuerza de presión (F
p, 10 psi en este estudio) es la única fuerza que actúa sobre las células. Si el diámetro de la célula es el mismo o mayor que el tamaño de la separación, la fuerza de fricción (F
f) se opone a la fuerza de presión (Figura 3B). Si las células son más rígidos, empujan más duro en las matrices de correos, y entonces F
f se incrementa significativamente. La figura 3C muestra Panc 03.27 células atrapadas en MS-chip de imágenes de microscopía de fluorescencia; fluorescencia roja muestra control de las células y la fluorescencia verde muestra células hENT1 desmontables. En la entrada, el mismo número de control de rojo Panc 03,27 (o Capan-1) las células y hENT1 verde desmontables Panc 03,27 (o Capan-1) se observaron las células (Figura 3C y 3E-I). En esta región, los canales eran mucho más amplio que el diámetro de las células, dando como resultado ninguna separación significativa de células flexibles y rígidos. Debido al menor diámetro de las células Capan-1 (diámetro medio: 15 micras), la separación se logró con 8 micras de tamaño brecha de matrices de correos. Pero, en caso de Panc 03.27 células (diámetro medio: 19 micras), la mayor separación se produce a 12 micras. En estas líneas celulares, las células en el grupo de control estaban atrapados consistentemente mientras que las células hENT1 desmontables pasan a través de los huecos con más frecuencia. Estos experimentos demuestran la eficiencia global de la separación de los dos fenotipos diferentes con diámetro similar en el MS-chip. Por lo tanto, llegamos a la conclusión tanto de las células de control son relativamente más rígida que las células hENT1 una caída, y estos resultados están de acuerdo con los hallazgos de AFM.
(A) Fotografía (izquierda) del chip de microfluidos separación (MS-chip) visualizaron mediante roja teñir el interior y una imagen microscópica representante electrónica de barrido (derecha) de la matriz de correos (diámetro del pilar: 35 m, altura del pilar: 30 micras). imagen del campo brillante y el esquema de las células que fluyen en MS-chip cuando el diámetro de la celda es menor que el tamaño de brecha de pilar (B) (flecha roja indica que las células). Aquí se supone que la fricción se debe únicamente a la tensión de corte (F
p: fuerza de presión contra la presión aplicada (10 psi en este estudio), F
f: fuerza de rozamiento). (C) La imagen de fluorescencia de uno de los canales entre los ocho espectáculos retenido Panc 03.27 células en el MS-chip después de la separación de Panc-ctrl 03.27 (fluorescencia roja) y Panc-03.27 hENT1 desmontables (fluorescencia verde). Mayor aumento confocal de imágenes representativas microscópicas del chip MS (Tamaño de hueco de 12 micras a 6 micras) muestran la eficacia de la separación a través de huecos. la distribución del tamaño de las células (D: Capan-1, G: Panc 03.27 células). El análisis estadístico de las células (E: Capan-1, H: Panc 03.27) y la relación de fracción de células (F: Capan-1, I: Panc 03.27) retenido en el chip. Los valores representan la media ± desviación estándar.
Para entender cómo hENT1 influye en la mecánica de células, los cambios fisiológicos en las células después de hENT1 desmontables fueron estudiados por microscopía confocal. Hemos observado que los teléfonos cambios morfológicos asociados con la caída hENT1. Como se muestra en la Figura 4, las células se visualizaron utilizando microscopio de escaneo láser confocal y la redondez de células se analizó cuantitativamente mediante el cálculo de factores de forma (FF). El FF se obtiene por la ecuación, 4π (área) /(perímetro)
2, lo que da un valor de 1 para un perímetro perfectamente circular y los valores decrecientemente menor positivos para menos perímetros circulares [22]. células Capan-1 y Panc 03,27 son de tipo epitelial y que están estrechamente unidos entre sí a través de los complejos de adhesión intercelulares. Tienen formas cuadradas con valores FF de 0,74 ± 0,08 y 0,77 ± 0,06, respectivamente (Figura 4B). Por el contrario, tanto las células después de la caída hENT1 se hicieron alargadas con FF mucho más baja con valores de 0,44 ± 0,14 y 0,52 ± 0,16, respectivamente
(A) micrografías confocal representativos de las células pancreáticas (Panel superior:. Capan-1, Panel inferior: Panc 03.27) que muestra la distribución de F-actina, (B) factor de forma (f = 4πa /p
2; a: área; p: perímetro) analizados por J (celdas de imagen Capan-1, ctrl: n = 37, scrl: n = 59, hENT1 ↓: n = 29; Panc 03.27, ctrl: n = 36, scrl: n = 28, hENT1 ↓: n = 28, NS: estadísticamente no significativa)
.
Además, se evaluó el efecto de la caída en hENT1 organización del citoesqueleto. Estamos manchados para vinculina, que controla la formación de adhesiones focales (FAS) mediante la interacción directa con la actina y otras proteínas que están implicadas en la formación de FA [23]. Fas, sitios de adherencias entre la célula y la matriz extracelular (ECM), y las fibras de estrés en el margen tiene funciones claras en el movimiento hacia adelante de la célula [23], [24]. Los estudios han informado de que el tamaño de FA se correlaciona con la velocidad de células; AF grandes que se encuentran en las células más alargadas y de movimiento más rápido [25], [26]. En este estudio, hemos analizado la redistribución de la F-actina y los cambios en área de adhesión focal de células hENT1 desmontables (Figura 5). fibras de actina en los dos grupos de control se concentran sobre todo alrededor de la periferia de la célula, y se observaron, AF nacientes pequeñas. Pero, después de hENT1 caída, hubo un aumento en el número de fibras de estrés, así como áreas de adhesión focal medibles. Estos resultados sugieren un aumento de la motilidad celular en ambas líneas celulares.
micrografías confocal (z-pilas de plano basal, 0-1,5 micras) que muestra vinculina (rojo) y F-actina (verde) en (A) Capan- 1 y (B) Panc 03.27 células. Área de adhesión focal (píxel
2) es analizada por J. imagen
Además, con el fin de entender el efecto de la caída hENT1 sobre la motilidad celular, se analizó el efecto de la regulación a la baja de hENT1 en la migración celular. A cero herida se introdujo en monocapa de células confluentes, y después se observó el sellado de la herida durante 18 horas (Figura 6). La zona de cierre de la herida se calculó mediante el uso de Image J y la velocidad de migración (área de cierre de la herida (m
2) /hora) se calculó como se muestra en la figura 6. El sellado de zona y la migración de velocidad tanto de las células de control herida y las células transfectadas con siRNA scramble son similares. Pero hENT1 suprimida células Capan-1 o Panc 03.27 migran 1,8 (1,7) o 1,5 (1,5) -fold más rápido que el control de células (scramble siRNA transfectadas), respectivamente. Por lo tanto, se confirma que la regulación negativa de hENT1 induce la formación de adherencias focales más grandes y promueve la migración celular más rápido. Sobre la base de los cambios morfológicos de células y el aumento de la motilidad celular, es posible que ambas células están experimentando cambios fenotípicos, que se asocia con la adhesión entre las células y aflojado reordenamiento citoarquitectónica. Tras la EMT, la reorganización del citoesqueleto, junto con aumento de la dinámica de la FA es crucial para que las células dejan el epitelio y comienzan a migrar a través de la ECM [22], [27], [28]. Por ejemplo, un estudio reciente mostró un aumento de la migración de las células Skov-3-enviar EMT que fue factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), que genera fuerzas mecánicas FA mayor que el de las células pre-EMT [16]. TGF-β se informa como EMT inductor en diferentes líneas de células epiteliales incluyendo tubular proximal renal y las células epiteliales alveolares [16], [29], [30]. Una mayor interacción de citoesqueleto de actina y moléculas intracelulares con FAS iniciados por la asociación de α5β1 integrina y fibronectina mejora la motilidad celular [16]
.
Los arañazos se introdujeron en monocapa (A) Capan-1 y (D) Panc 03.27 Células. Se tomaron fotografías de inducción inmediatamente después de la herida durante 18 horas. Las áreas de (B) sellar la herida Capan-1 y 03.27 células (E) Panc se calcularon utilizando Image J y se comparó con el control, siRNA scramble transfectadas y las células hENT1 desmontables. velocidad de migración de (C) se calculó Capan-1 y células 03.27 (F) Panc.
Con el fin de confirmar los cambios fisiológicos producidos por las hENT1 desmontables están relacionados con la EMT, se analizaron los cambios en el marcador de la EMT proteínas, como la e-cadherina y N-cadherina, después de la caída hENT1. E-cadherina es una de las moléculas de adhesión célula-célula. Que mantiene contactos célula-célula y la arquitectura epitelial. La alternancia de la expresión de cadherinas de E-cadherina a N-cadherina, que se expresa principalmente en las células mesenquimales, se produce durante la EMT. Este cambio conduce a un cambio drástico en las propiedades adhesivas de las células, ya que pierde su afinidad para los vecinos epiteliales y las ganancias de afinidad para las células mesenquimales, que son uniones intercelulares no polarizados, la falta, y tienen un único husillo como la forma [27], [ ,,,0],31], [32]. Después de hENT1 regulación a la baja, ambas líneas celulares mostraron baja expresión de E-cadherina y alta expresión de N-cadherina, que son una importante característica de EMT (Figura 7). La pérdida de E-cadherina y el aumento de la N-cadherina aumenta la motilidad celular y el potencial metastásico. Varios estudios han demostrado que reduce la rigidez de células se correlaciona directamente con el aumento de potencial metastásico utilizando diversos métodos de análisis biomecánicos in vitro [11], [17], [33]. Reducción de la rigidez celular modula que las células están experimentando EMT después hENT1 desmontables como se demuestra en la Figura 2. Sin embargo, hay diferencia insignificante en los niveles de expresión de los filamentos intermedios, citoqueratina 18, y citoesqueleto nuclear, lamin A /C en las dos líneas celulares (Figura S5 en archivo S1).
Las transferencias Western y los niveles relativos de expresión de e-cadherina (110 kDa), N-cadherina (140 kDa) en (a) Capan-1 y (C) Panc 03.27 células después del tratamiento con hENT1 siRNA. Las columnas de los histogramas son la media de dos experimentos independientes (relación de intensidad de GAPDH para la E-cadherina o N-cadherina). confocal de imágenes representativas de la E-cadherina (fluorescencia roja) y N-cadherina (fluorescencia verde) 03.27 expresiones en las células Capan-1 y (D) Panc (B).
para confirmar nuestros estudios antes mencionadas, que sugieren que EMT puede ser caracterizada por cambios en la rigidez de células, se evaluaron los cambios fenotípicos de las células de cáncer de páncreas después del tratamiento con TGF-β. El TGF-β se ha informado en varios estudios para inducir EMT [15], [16], [30]. Por lo tanto, hemos examinado aún más estos resultados en otro experimento usando células de cáncer de páncreas EMT inducida. Panc 03.27 células fueron expuestas a TGF-β para 2 días a una concentración de 10 ng /ml para inducir la EMT, y luego medir la rigidez celular. Ligeramente suprimida E-cadherina y elevado N-cadherina y vimentina expresiones indican que la EMT se induce en Panc 03.27 células (Figura S6A en S1 Archivo). células Panc 03.27 tratados con TGF-β se demostró por una disminución de módulo de Young (1,42 ± 0,53 kPa) frente a las células no tratadas (1,91 ± 0,78 kPa). Este resultado sugiere que la rigidez celular disminuye cuando las células están experimentando EMT. Recientemente, hay un informe en relación con los cambios de rigidez celular en células A549 inducidas por el tratamiento con EMT TGF-β [15]. En su estudio, se midieron las propiedades mecánicas locales de las células A549 utilizando un voladizo DNP afilada (20 nm radio de la punta) que tiene un área de contacto más pequeña en comparación con un voladizo de micropartículas modificadas. A pesar de que existe evidencia crucial de cambio fenotípico de células de epitelio mesenquimal, es decir, cambios en la forma celular y el aumento de las fibras de estrés, siguen siendo consistentes con nuestro trabajo.