Extracto
El carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) representa alrededor del 90% de cáncer de esófago diagnosticados en los países asiáticos, con su incidencia en el aumento. cáncer de células madre (CSC, también conocida como células iniciadoras del tumor, TIC) es inherentemente resistente a la quimioterapia citotóxica y la radiación y se asocia con un mal pronóstico y fracaso de la terapia. Orientación de la terapia contra el cáncer de células madre ha surgido como un enfoque terapéutico potencial para desarrollar regímenes eficaces. Sin embargo, el marcador CSC adecuado de la CECA para la identificación y focalización es todavía limitada. En este estudio, hemos examinado los nuevos CSC marcadores de proteínas de membrana utilizando dos características distintas stemness de líneas celulares de cáncer por un enfoque comparativo. Después de la validación de RT-PCR, qPCR y análisis de Western blot, molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1) fue identificado como un potencial marcador de CSC de CECA. ICAM1 promueve la migración de células de cáncer, la invasión, así como el aumento de la expresión del marcador mesenquimal y la atenuación de la expresión del marcador epitelial. Además, ICAM1 contribuye a las propiedades de CSC, incluyendo formación de esferas, resistencia a los medicamentos, y la tumorigénesis en el modelo de xenotrasplante de ratón. Basado en el análisis de proteínas ICAM1 reguladas, especuló que ICAM1 regula propiedades CSC en parte a través de una vía de ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1. Por otra parte, se observó que ICAM1 y CD44 podrían tener un efecto de compensación en el mantenimiento de las características stemness de la CECA, lo que sugiere que la combinación de terapias de metas múltiples debe estar bajo seria consideración para adquirir un efecto terapéutico más potente sobre la CSC de la CECA.
Visto: Tsai ST, Wang PJ, Liou NJ, Lin PS, Chen CH, Chang WC (2015) ICAM1 es un marcador de la célula madre de cáncer de esófago potencial de carcinoma de células escamosas. PLoS ONE 10 (11): e0142834. doi: 10.1371 /journal.pone.0142834
Editor: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: 7 Septiembre, 2015; Aceptado: 27 Octubre 2015; Publicado: 16 de noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Tsai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán Subvenciones NSC102-2320-B-039-050 y 102-2911 MAS-I-002- 303. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de esófago es la octava causa de tumores malignos en todo el mundo con su incidencia en aumento [1]. Representa el 1% de los cánceres diagnosticados en los Estados Unidos, con un estimado de 17.500 nuevos casos reportados en 2012 [2]. El cáncer de esófago es clasificado patológicamente en dos subtipos principales, adenocarcinoma de esófago (EAC) y el carcinoma de células escamosas de esófago (CECA). ESCC representa aproximadamente el 90% de cáncer de esófago diagnosticada en los países asiáticos. Desde estrategias de detección precoz no han sido bien aplicado a la pantalla clínica, estos tumores a menudo son diagnosticados en estadios avanzados. Una vez que se produce la metástasis, la mortalidad por cáncer aumenta significativamente [3]. La tasa de supervivencia global a 5 años después de la resección quirúrgica es de 70% ~ 92% de los pacientes sin afectación ganglionar, pero sólo el 18% ~ 47% de los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos [4]. La falta de conocimientos fundamentales en relación con la radiación y la resistencia a la quimioterapia en estas células tumorales ha sido un obstáculo importante clínica para adquirir un mejor resultado. La comprensión limitada de la biología molecular de los tumores nos ha dejado con el empirismo en la clínica
El cáncer de células madre. (CSC; también conocida como célula iniciadoras del tumor, TIC) se define como un subconjunto de las células tumorales con auto capacidad -renew y consiste en la iniciación y progresión del cáncer. CSC también es altamente resistente a la radiación y la quimioterapia y la responsable de la recaída del cáncer después del tratamiento [5]. Por lo tanto, CSC ha sido visto como un objetivo atractivo para destructivamente eliminar las células cancerosas. Es importante identificar posibles marcadores de CSC que se pueden utilizar para aislar células madre cancerosas y caracterizar sus propiedades para ser dirigidos terapéuticamente. Aunque CSC ha sido ampliamente descubierto en los tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama, colon, glioma, de próstata, el hígado y melanoma [6-11], y múltiples marcadores para su identificación están disponibles, el marcador molecular para esofágico CSC es muy limitada.
epitelial-a-mesenquimal transición (EMT) es un proceso de desarrollo esencial durante la formación de mesodermo y la formación del tubo neural, en el que las células epiteliales adquieren un fenotipo mesenquimal migratorio [12]. Los procesos de invasión tumoral y metástasis comparten muchas similitudes fenotípicas de la EMT, incluyendo una pérdida de la adhesión célula-célula y un aumento en la movilidad celular. El vínculo entre el CSC y EMT se estableció por primera vez en el epitelio mamario transformado [13], y los resultados experimentales mostraron que la EMT inducida por TGF se asoció con la adquisición de las células del cáncer de mama con CD44
+ /CD24
- /bajo fenotipo iniciadoras del tumor, rasgos mesenquimales, y una mayor capacidad para formar mammospheres. Recientemente pruebas obtenidas indicó que CSC juega un papel importante en la metástasis de varios tipos de carcinoma [14,15]. Por lo tanto, el aumento de nuestra comprensión general de la biología molecular del CSC probable que va a descubrir el papel de CSC en la metástasis de cánceres.
análisis integrados múltiples, incluyendo la genómica, transcriptómica, epigenomics, y la proteómica, han sido reclutados para el estudio de la biología de CSC. Entre ellos, la proteómica tiene una posición única en esta área. Por ejemplo, varios avances importantes en la investigación CSC se debieron a la identificación de proteínas utilizando el enfoque proteómico como factores estimulantes de colonias [16] y las moléculas de CD de la superficie celular [17]. Además, la proteómica se está convirtiendo en una herramienta poderosa para identificar los complejos de señalización que controlan la diferenciación CSC y regular las vías de mantenimiento CSC [18]. Un enfoque proteómico sistemático para caracterizar las propiedades CSC arrojará nueva luz sobre la biología y la CSC acelerar las aplicaciones clínicas en el pronóstico, el diagnóstico y la terapia del cáncer [19]
.
Las proteínas de membrana, incluyendo enzimas, receptores, canales iónicos, y transportadores, desempeñan muchas funciones biológicas. La desregulación de proteínas de membrana se ha relacionado con una variedad de cánceres humanos [20]. Por lo tanto, muchas proteínas de membrana se han caracterizado como marcadores para el diagnóstico y terapéuticos objetivos, alrededor del 70% de los objetivos existentes de drogas farmacéuticas es la proteína de membrana [21]. En este estudio, que tuvo como objetivo identificar posibles marcadores de la superficie del esófago CSC utilizando un enfoque proteómico. líneas celulares CECA con diversos capacidad de formación de esfera se utilizaron para la detección de marcadores de la superficie adecuados. Las propiedades de CSC marcador potencial se caracterizaron adicionalmente usando un ensayo de formación de colonias, ensayo resistente a los medicamentos, y el ensayo de tumorigenicidad en ratones inmunodeficientes.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
En este estudio, líneas celulares de cáncer de esófago humanos se adquirieron de la Colección Biorecursos y Centro de Investigación de la Industria de Alimentos Instituto de Investigación y Desarrollo (Hsinchu, Taiwán; http://www.bcrc.firdi.org.tw/). Las líneas celulares CE81T /VGH (CE81T; BCRC 60166) y CE146T /VGH (CE146T; BCRC 60167) se obtuvieron a partir de 57-, y 50 años de edad, varones taiwaneses, respectivamente. Ambas líneas celulares se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle esencial mínimo (DMEM; Gibco BRL) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) (Gibco BRL), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco BRL), y se mantiene a 37 ° C en un 5% de CO
atmósfera de aire 2/95%.
extracción de proteínas de membrana y en la digestión-gel
La extracción de proteínas compartimental kits CNM (BioChain Institute) se utilizó para extraer proteínas de la membrana de las células cancerosas. El kit CNM incluye dos etapas de extracción química: (1) la eliminación de las proteínas citoplasmáticas y nucleicos por tampón de reacción que contiene HEPES, MgCl
2, KCl, sacarosa, glicerol, y ortovanadato de sodio; (2) proteínas de la membrana de extracción de desoxicolato de NP40 y sodio. Antes del análisis espectrómetro de masas, las proteínas de membrana se separaron mediante SDS-PAGE y se dividieron en diez fracciones de gel, que a continuación se cortaron en piezas de gel pequeñas (& lt; 1 mm
3) y se sometió a digestión en gel, en forma individual. El gel-en procedimiento de digestión incluye decoloración azul de Coomassie, la reducción de enlaces disulfuro, acrilación con yodoacetamida, y la digestión con tripsina, seguido nuestro método descrito previamente [22].
Matrigel invasión y la cicatrización de heridas ensayo
in vitro
invasión se analizó utilizando recubierta con Matrigel (1 mg /ml; BD Biosciences) membrana de PET transwell insertar (BD Biosciences) en una placa de 24 pocillos. Las células cancerosas (1,5 × 10
5 células en 200 l) se suspendieron en medio DMEM y se añaden a la mitad superior de la cámara de inserción. medio DMEM suplementado con 10% FBS se añadió como un quimioatrayente para la mitad inferior. Después de la incubación a 37 ° C durante 24 horas, las células cancerosas pasado a través de la inserción se fijaron con formalina al 3,7% (Sigma-Aldrich) y se tiñeron con cristal violeta al 0,1% (Sigma-Aldrich).
En la migración in vitro
se analizó utilizando ibidi Cultura-Insert (ibidi). Las células cancerosas (70μl; concentración: 7x10
5 células /ml) se añadieron a la Cultura-Insertar pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Después de la eliminación de la Cultura-Insertar, las células cancerosas se cultivaron durante 16 horas. La distancia de migración de las células cancerosas se registró y se midió utilizando una imagen de software J.
Esfera formación de ensayo
ensayo de formación de Esfera se llevó a cabo en la placa de cultivo de 6 cm recubierto con un 1% de agarosa. Las células cancerosas en suspensión en medio libre de suero fueron sembradas a una densidad de células de 5.000 /placa y se incubaron durante 7 días. Los números de la esfera primaria se contaron manualmente al 7º día bajo el microscopio. Para el ensayo de esfera secundaria, se recogieron las esferas de cultivo primario y se incubaron con tripsina a temperatura ambiente durante 10 min. se pasaron las células tratadas con tripsina de las esferas a través de la aguja 26 G tres veces. Las células disociadas se sembraron individualmente a 5.000 células /densidad de plato en plato de cultivo de 6 cm por 7 días. Los números de la esfera secundaria se contaron al 7º día.
Tumorigenicity ensayo en modelo de ratón inmunodeficiente
El procedimiento de animales (102-97-N) fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional (IACUC) en el hospital de la Universidad de Medicina china (Taichung, Taiwán). Varias dosis de células CE146T (10
2, 10
3, y 10
4) se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de ratones NOD-SCID macho de 5 semanas de edad, para generar tumores. flanco izquierdo se inyectó con el grupo de control de las células cancerosas, y el flanco derecho se inyectó con el grupo experimental. El tamaño del tumor se midió mediante medición del calibre semanalmente cuando los tumores se hicieron visibles, y la duración de observación fue de ocho semanas. El volumen del tumor se calculó con la fórmula: (longitud x anchura
2) /2
Análisis Espectrómetro de masas
análisis de espectrómetro de masas se realizó a través de la trampa de iones lineal transformada de Fourier-ion ciclotrón. espectrómetro de masas de resonancia (LTQ-FTICR MS; Thermo Fisher) equipado con una fuente de iones de nano-electrospray (New Objetivo) y un sistema nano-HPLC. separación de nano-HPLC utiliza un nano-columna inversa (75 micras de DI x 200 mm) empaquetada con resina de magia C18AQ (tamaño de partícula de 5 micras, tamaño de poro 200 Å; Michrom Recursos Biológicos) y una bomba de HPLC binario serie Agilent 1100 (Agilent Technologies) . El programa analítico se fijó en un gradiente lineal de 10% a 50% de ACN con un ciclo de funcionamiento 60 min. La encuesta de exploración de MS análisis (
m /z
320-2,000) se realizó en LTQ-FTICR MS con una resolución de masa de 100.000 a
m /z 400. Los diez
se multiplican más abundante iones cargados se aislaron de forma secuencial para MS /MS por LTQ. Los datos resultantes se aplicaron a la MaxQuant software [23] para la identificación de proteínas. Exacta cuantificación sin etiquetas se realizó utilizando el programa MaxLFQ por la normalización y la relación de péptido métodos de extracción máximas [24]. El umbral de significación para la identificación se establece en
P Hotel & lt; .01.
Estadísticas
Los datos se expresaron como media ± SD. La significación de la diferencia fue examinado por el estudiante de
t-test
(dos colas).
P Hotel & lt; 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
CE146T tiene potencial y características stemness más metastásicos que CE81T
Para elegir célula diana adecuada para la identificación de nuevos marcadores de CSC, primero caracterizado las propiedades metastásicas tales como la migración y la invasión y la capacidad de formación de esferas de esófago de células escamosas de cáncer y líneas CE81T CE146T. Los resultados mostraron que CE146T tiene notablemente más altas capacidades de migración y de invasión que CE81T (Fig 1A y 1B), que se identificó como una célula de cáncer bien diferenciado. Además, CE146T también tiene mayor capacidad de formación de esfera de CE81T (Fig 1C). Estudios recientes demostraron que la CSC de CECA expresa altos niveles de CD44 [25,26]. De acuerdo con ello, se utilizó citometría de flujo para analizar la expresión de CD44 en CE146T y CE81T. El resultado mostró que CE146T tiene niveles más altos de CD44 que CE81T (Fig 1D). Tomados en conjunto, estos datos indican que CE146T tiene más población CSC y exhibe más propiedades CSC que CE81T, dando a entender que somos capaces de identificar marcadores CSC mediante la comparación de los cambios proteómicos de CE146T y CE81T.
(A) Wound- ensayo de curación. CE81T y CE146T se cultivaron en el ibidi Cultura-Insertar bien, y las imágenes de migración de las células cancerosas se registraron a 0 HORAS (eliminación de Cultura-Insertar) y 16 horas. La distancia de migración se midió utilizando una imagen de software ensayo de invasión J. (B) Matrigel. fotografías representativas contienen invadidas anulan las células que se tiñeron con cristal violeta. ensayo de formación (C) Esfera. Diversos tamaños de las esferas en CE81T y CE146T se contaron en el día 7. Los experimentos se realizaron por triplicado (media ± SD). (D) la expresión de CD44 en CE81T y CE146T se midió mediante citometría de flujo.
Identificación de marcadores CSC utilizando una membrana comparativa enfoque proteómico
proteína de la membrana tiene la ventaja en el uso de diagnóstico y terapéutica . Por lo tanto, se utilizó un análisis proteómico de membrana comparativa para identificar los nuevos marcadores de CSC CE146T y CE81T. Aunque CE146T y CE81T no son isogénicas, CE146T puede expresar niveles más altos de proteínas asociadas con propiedades de CSC que CE81T basado en observaciones anteriores. En el análisis de MS, se realizaron dos repeticiones técnica para cada muestra. identificación y cuantificación de proteínas libre de etiquetas de señales de masa fueron analizados utilizando el software MaxQuant [23]. En este análisis, se identificaron en total 652 proteínas de membrana, que incluía 266 proteínas de la membrana plasmática en base a la definición de ontología de genes. Entre las proteínas de membrana, el total de 13 proteínas mostraron una expresión específica o un aumento de más de 50 veces de expresión en comparación con CE146T CE81T (Tabla 1).
Para validar los resultados de la EM, hemos utilizado RT-PCR, PCR cuantitativa (qPCR), y Western blot para examinar los niveles de expresión de genes y proteínas de las proteínas candidatas a excepción de dos antígenos de histocompatibilidad. qPCR resultados de RT-PCR y mostró que molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1) y prominin-2 (PROM2) tienen una mayor expresión de genes en CE146T que en CE81T, que es coherente con el hallazgo proteómico (Fig 2A y 2B). Western blot mostró que ICAM1 tiene una alta expresión en CE146T, pero no PROM2 (Fig 2C). De acuerdo con ello, se evaluó aún más el carácter de ICAM1 en las propiedades de CSC de la CECA.
(A) Los niveles de mRNA de las proteínas diana se analizaron usando el ensayo de RT-PCR. GAPDH sirvió como control. (B) Los niveles de ARNm de proteínas diana se analizaron mediante ensayo de qPCR. (C) Los niveles de proteína de tanto PROM2 y ICAM1 se analizaron usando el ensayo de western blot. β-actina sirvió como control de carga.
ICAM1 aumenta el potencial metastásico de las células cancerosas
Para evaluar las funciones de ICAM1 en las propiedades de CSC, se utilizó el vector lentiviral que expresa-ICAM1 específicos a corto horquilla de ARN (shRNA) para derribar la expresión ICAM1. Hay dos tipos de ICAM1 shRNA fueron transfectadas en CE146T (etiquetado como shICAM1#1 y#2 shICAM1), tanto en las células transfectadas mostraron caída evidente de ICAM1 en el ensayo de western blot (Figura 3A). knockdown ICAM1 no afectó el crecimiento de células de CE146T (Fig 3B), pero reduce significativamente la migración celular y la capacidad de invasión de CE146T en la curación de heridas y transwell ensayos, respectivamente (figura 3C y 3D). Además, dos inhibidores farmacológicos ICAM1, silibinina [27] y el ácido 18 beta-glicirretínico (GA-18β) [28], muestran un efecto similar en la reducción de las capacidades de migración e invasión de CE146T (Figura 3C y 3D). Los resultados indicaron que contribuye a ICAM1 CE146T propiedades metastásicas
in vitro
. Por lo tanto, determina además si la caída ICAM1 afecta a los niveles de expresión de marcadores de EMT. resultado de Western blot mostró que tanto shRNA y la inhibición farmacológica podrían aumentar los niveles de marcadores epiteliales, tales como ZO-1 y atenuar los niveles de marcadores mesenquimales tales como N-cadherina y fibronectina (Fig 3E).
(A) ICAM1 expresión fue derribado utilizando dos tipos de ARNhc shRNA, nº 1 secuencia diana es: GCCCGAGCTCAAGTGTCTAAA, y shRNA#2 secuencia diana es: CCTCAGCACGTACCTCTATAA. (B) El crecimiento celular de CE146T se analizó mediante el ensayo de MTT. ICAM1 caída no afectó significativamente el crecimiento de células CE146T. CE146T-shGFP sirvió como control. Los efectos de ICAM1 caída en la capacidad de migración celular y la invasión se analizaron mediante (C) de curación de heridas y (D) ensayos de invasión de Matrigel, respectivamente. Ambos experimentos se realizaron por triplicado (media ± SD). (E) La expresión de marcadores de EMT se determinó usando el ensayo de transferencia de Western. CE146T se trató con silibinina inhibidor ICAM1 (2 micras) o 18β-GA (10μM) para las 24 horas. Las expresiones de marcadores epiteliales ZO-1 y marcadores mesenquimales N-cadherina y fibronectina se examinaron utilizando anticuerpos específicos. β-actina sirvió como control de carga.
ICAM1 aumenta la formación de esfera y resistencia a los medicamentos
CSC se ha sabido para aumentar la capacidad de formación de esferas y expresar altamente resistente a la radiación y la quimioterapia. Con el carácter de las funciones de ICAM1 de formación de esferas, que compararon la capacidad de formación de esferas entre shICAM1#1 y#2 shICAM1 y su grupo de control shGFP de CE146T. El resultado indicó que ICAM1 caída reduce significativamente la capacidad de formación de esferas de CE146Y, no importa en la esfera número o en tamaño de esfera (Fig 4A). Además, también se redujo significativamente la formación de esferas secundaria de CE146T (Fig 4B).
Los ensayos de formación de esferas secundaria (A) la formación de esfera primaria y (B) se realizaron en CE146T con o sin ICAM1 caída. Se observaron número y el tamaño de la esfera y se contaron de primaria en el séptimo día de cultivo. análisis (C) La resistencia al fármaco. CE146T-shGFP y ICAM1-shICAM1#1 se trataron con diversas dosis de cisplatino para las 24 horas, y la viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTT. Cada experimento se realizó por triplicado (media ± DE).
El cisplatino es un agente citotóxico se usa comúnmente en la quimioterapia del cáncer de esófago, mientras que el cisplatino tiene también un efecto clínicamente importante de radio-sensibilizador que hace posible la terapia de combinación [29]. Para evaluar las funciones de ICAM1 sobre la resistencia a cisplatino, se trataron CE146T con diversas dosis de cisplatino y se determinó la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT. El resultado mostró que ICAM1 caída reduce la capacidad de resistencia a cisplatino de CE146T y el IC
50 de CE146T en el grupo control (shGFP) y el grupo knockdown ICAM1 (shICA1#1) son 5 M y 3,5 M de cisplatino, respectivamente ( la figura 4C).
ICAM1 promueve la tumorigénesis en ratones inmunodeficientes
Para estudiar las funciones de ICAM1 en la tumorigénesis
in vivo
, se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de ratones NOD-SCID Los ratones con 10
2, 10
3, o 10
4 de células CE146T. flanco izquierdo fue inyectado con grupo de control de CE146T (shGFP), y el flanco derecho se inyectó con el grupo experimental de CE146T (shICAM1#1) (figura 5A). Los resultados mostraron que incluso una dosis baja de células CE146T (10
2) sin enriquecimiento subpoblación es capaz de inducir la tumorigénesis en ratones NOD-SCID, lo que sugiere que CE146T de hecho tiene una alta población de CSC (Fig 5B y 5C). Además, la dosis más alta de células CE146T knockdown ICAM1 (10
4) son necesarios para inducir la formación de tumores, revelando que ICAM1 caída reduce
in vivo
potencial tumorigénico, una de las propiedades importantes de CSC (Fig 5B y 5C).
(A) varias dosis de células CE146T, 1x10
2, 1x10
3, y 1x10
4, se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de 5 semanas de edad Los ratones NOD-SCID macho (
N
= 4). tumores subcutáneos representativos derivados de CE146T-shGPF en flanco izquierdo y CE146T-shICAM1#1 en el flanco derecho. (B) El número de formación de tumores en cada grupo fue grabado y resumido. (C) El tamaño del tumor se registró semanalmente y se representó gráficamente el volumen medio del tumor de cada grupo. La observación se continuó durante ocho semanas después de la inoculación.
ICAM1 regula propiedades esofágicas CSC parte a través de la vía dependiente de p53
Para realizar el mecanismo potencial de ICAM1 en la regulación de las propiedades de CSC, se realizó un análisis proteómico comparativo para investigar el cambio de proteínas entre grupo y grupo shGFP shICAM1 de CE146T. Entre la lista identificada (S1 Tabla), nos dimos cuenta de un subgrupo relacionado p53 significativamente baja expresada junto con ICAM1 desmontables (Tabla 2). La p53 es un supresor de tumores bien estudiados en la biología del cáncer. Estudios recientes en el campo de células madre han puesto de manifiesto un profundo papel de p53 como la barrera para la formación de células madre de cáncer [30,31]. Por lo tanto, se examinaron los niveles de proteína p53 en el control de CE146T shGFP y en el tratamiento de shRNA o condición inhibidor ICAM1 farmacológica. Western blot reveló que ICAM1 desmontables y los inhibidores farmacológicos son capaces de aumentar los niveles de p53 de CE146T (Fig 6A), lo que implica que ICAM1 puede regular caracteres CSC esofágicas, al menos en parte, mediante la reducción de los niveles de p53 y de sus vías de señalización relacionadas. Hemos validado aún más el subgrupo relacionados con p53 del hallazgo proteómico utilizando el ensayo de RT-PCR. El resultado mostró que los niveles de ARNm de pituitaria gen-transformar tumor 1 Proteína La proteína de interacción (PTTG1IP) y ADN (citosina-5) metiltransferasa 1 (DNMT1) están obviamente reduce bajo ICAM1 condición desmontables, lo que es consistente con el resultado de proteómica (Fig 6B).
(A) Los niveles de p53 en el control de CE146T shGFP y bajo condiciones shRNA desmontables o inhibidores de ICAM1 se analizaron usando el ensayo de western blot. La proporción relativa de los niveles de p53 se normalizó con los niveles de beta-actina. (B) Los niveles de ARNm de las proteínas relacionadas con p53 PTTG1IP y DNMT1 se analizaron usando el ensayo de RT-PCR. GAPDH sirvió como control.
ICAM1 y CD44 podrían utilizar un mecanismo de compensación para mantener las propiedades CSC esofágicas
En el experimento de los xenotrasplantes, ICAM1 caída pierde su poder de inhibición de la tumorigénesis en el número de células de alta (10
4) la condición de inyección (figura 5B). Nos preguntamos si existe una reglamentación cruz en moléculas que afectan a las propiedades de CSC, por ejemplo ICAM1 y CD44. Para probar esta especulación, que recíprocamente derribado ICAM1 y CD44 y se determinó su expresión ICAM1 y CD44 mediante Western blot. El resultado reveló que ICAM1 desmontables utilizando tanto shRNA y la inhibición farmacológica reduce de manera eficiente la expresión ICAM1 y al mismo tiempo aumenta la expresión de CD44 de una manera correlación inversa (figura 7A). Además, CD44 caída también es capaz de aumentar ICAM1 por la correlación inversa de una manera similar (Fig 7B). Este hallazgo indica un posible mecanismo que las células cancerosas podrían utilizar un mecanismo de compensación para mantener sus propiedades CSC.
ICAM1 y la expresión CD44 se analizaron mediante ensayo de transferencia Western. (A) Tanto shRNA y la inhibición farmacológica reducir la expresión ICAM1 y aumentar simultáneamente la expresión de CD44. (B) CD44 desmontables conduce a aumentar los niveles de ICAM1 de manera compensativo. la expresión de CD44 fue derribado utilizando tres tipos de ARNhc shRNA, nº 1 secuencia diana es: CGCTATGTCCAGAAAGGAGAA, shRNA#2 secuencia diana es: ATGGACTCCAGTCATAGTATA, y shRNA#3 secuencia diana es: GGACCAATTACCATAACTATT. β-actina sirvió como control de carga.
Discusión
molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1, CD54) es una proteína transmembrana glicosilada de 90 kDa de la superfamilia de las inmunoglobulinas. ICAM1 juega un papel importante en la formación de sinapsis inmunológica, la activación de células T, el tráfico de leucocitos, y numerosas respuestas inmunes celulares [32]. Estudios previos observaron que ICAM1 expresa altamente en diversas células madre mesenquimales, incluyendo la médula ósea, placenta, tejido adiposo, el ligamento periodontal, y la gelatina de Wharton [33-36]. Recientemente, se identificó ICAM1 para servir como un marcador de células madre carcinoma hepatocelular [37]. En este estudio, se identificó ICAM1 expresar en propiedades stemness más altos de células de cáncer de esófago CE146T utilizando un enfoque proteómico comparativo. Nuestra investigación mostró la presencia de ICAM1 contribuye a la formación de células de cáncer esfera, resistencia a los medicamentos, y la tumorigénesis en el modelo de xenotrasplante de ratón, lo que indica que ICAM1 se puede utilizar como un potencial marcador de CSC de CECA y por lo tanto servir como una diana terapéutica para el diseño y desarrollo de fármacos.
sistemática metanálisis señaló la expresión positiva de p53 constituye una característica de pronóstico favorable y está consistentemente asociada con la supervivencia global de la CECA [38]. Nuestro estudio observó que la expresión de ICAM1 se correlaciona inversamente con los niveles de p53, lo que sugiere que la alta expresión de ICAM1 podría conducir a la malignidad del cáncer. Además, la comparación con el cambio proteómico de CE146T con y sin ICAM1 desmontables, hemos identificado un subgrupo de las proteínas relacionadas con la expresión y las funciones de p53. Consistente con el hallazgo de proteómica, tanto PTTG1IP y DNMT1 disminuir sus niveles de mRNA junto con knockdown ICAM1. PTTG1IP puede promover el crecimiento del tumor y la capacidad de invasión, y su alta expresión está asociada de forma independiente con un mal pronóstico y una menor supervivencia específica de la enfermedad [39]. Un estudio reciente demostró que PTTG1IP es capaz de disminuir la estabilidad de p53 por ubiquitinación mejora, que depende de la actividad de ligasa E3 de Mdm2 [40]. Este resultado da una explicación a nuestro estudio que ICAM1 caída disminuye los niveles PTTG1IP conduce a estabilizar p53, p53 y aumentar así los niveles. DNMT1 es la principal enzima implicada en el establecimiento de los patrones de metilación del genoma. sobreexpresión DNMT1 fue identificado en varios tipos de cáncer y podría dar lugar a alteración epigenética de múltiples genes supresores de tumores y en última instancia conducir a la tumorigénesis y mal pronóstico [41-46]. Además, DNMT1 sobreexpresión se demostró que se asocia con la pérdida de la represión de p53 en el nivel celular y clínica [46]. En resumen, nuestra observación y los datos relacionados sugieren un posible mecanismo que puede regular ICAM1 propiedades CSC por una vía ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1. Sin embargo, esta vía propuesta aún no se ha demostrado mediante experimentos detallados.
vía de señalización de la diafonía, por ejemplo mTOR /S6K1 y erizo vías [47] o EGFR y vías de VEGF [48], es bien reconocido para proporcionar interacción compleja y extensa comunicación, en respuesta a la estimulación celular, y dar lugar a efectos sinérgicos o antagónicos y, finalmente, los resultados biológicos deseables [49]. Si las células madre del cáncer utilizan un mecanismo similar, la diafonía molecular, para mantener sus características CSC sigue siendo difícil de alcanzar. En el estudio actual, se observó un fenómeno de compensación entre ICAM1 y los niveles de expresión de CD44, que, sin embargo, también plantea varias preguntas críticas. Hacen ICAM1 y CD44 comparten redes de señalización comunes para mantener stemness tumor? ¿Cuál es la relación estequiométrica entre ICAM1 y CD44 en el control de la población CSC y propiedades? investigación exhaustiva será útil para revelar los mecanismos subyacentes implicados en el mantenimiento de ICAM1 y CD44 en CSC de CECA. Sobre la base de tal mecanismo de compensación, nuestro estudio sugiere que la combinación de varias estrategias de selección debe estar bajo consideración para la adquisición de un efecto terapéutico más potente sobre la CSC de la CECA.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0142834.s001 gratis (PDF)
Reconocimientos
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán Subvenciones NSC102-2320- B-039-050 y el MOST 102 a 2911-I-002-303.