Extracto
diafonía dinámica entre los receptores de factores de crecimiento, moléculas de adhesión celular y la matriz extracelular es esencial para la migración de las células del cáncer y la invasión. Las integrinas son receptores transmembrana que se unen las proteínas de la matriz extracelular y permiten la adhesión celular y la organización del citoesqueleto. Ellos también median la transducción de señales para regular la proliferación celular y la supervivencia. El tipo insulina receptor de factor de crecimiento tipo 1 (IGF-IR) media crecimiento de células tumorales, la adhesión y la inhibición de la apoptosis en varios tipos de cáncer. Hemos demostrado anteriormente que la β
1 integrinas regulan el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de próstata (AEP) mediante la regulación de la expresión de IGF-IR y funciones de la transcripción mediada por los receptores de andrógenos. Además, recientemente hemos informado que el IGF-IR regula la expresión de β
1 integrinas en las células APCR. Hemos diseccionado el mecanismo a través del cual el IGF-IR regula β
1 integrina expresión en APCR. Aquí mostramos que el IGF-IR es crucial para el crecimiento celular y que PrcA β
1 integrinas contribuyen a la regulación de la proliferación por el IGF-IR. Se demuestra que la β
1 regulación de la integrina por el IGF-IR no se produce en el ARNm. expresión exógena de un CD4 - β
1 integrina dominio citoplásmico quimera no interfiere con dicha regulación y no para estabilizar
1 la expresión de la integrina β en ausencia de IGF-IR. Esto parece ser debido a la falta de interacción entre la β
1 dominio citoplásmico y el IGF-IR. Se demuestra que el IGF-IR estabiliza la β
1 subunidad protegiéndolo de la degradación proteasomal. La α
5 subunidad, una de las parejas de unión de β
1, también está regulado por disminución junto con β
1 al derribo de IGF-IR mientras que no se observa en la expresión de la α
2 , α
3, α
4, α
6 y α
7 subunidades. Nuestros resultados revelan un papel crucial para el mecanicista α
5β
1 integrina, aguas abajo de IGF-IR, en la regulación del crecimiento del cáncer
Visto:. Sayeed A, C Fedele, Trerotola M, Ganguly KK , Languino LR (2013) IGF-IR Para promover el crecimiento del cáncer de próstata mediante la estabilización de α
5β
1 integrina niveles de proteína. PLoS ONE 8 (10): e76513. doi: 10.1371 /journal.pone.0076513
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Julio, 2013; Aceptado: 23 Agosto 2013; Publicado: 9 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Sayeed et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Contrato de subvención patrocinador: NIH; el número de concesión del contrato: R01 CA-89720 y CA-109 874 (a LIF), P01 CA-140043 (a LIF); Sociedad Americana del Cáncer (ACS) -IRG-08-060-04 (AS); Contrato de concesión patrocinador: Departamento de Salud de Pennsylvania. Este proyecto también es financiado, en parte, gracias a una subvención Programa de Fomento de la Investigación de la Universidad Libre Asociado con el Departamento de Salud de Pensilvania (IDH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Dra. Languino, el autor correspondiente, es miembro del consejo editorial de la revista PLoS One. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La adhesión de las células a la matriz extracelular (ECM) está mediada principalmente por integrinas y es crucial para el crecimiento celular y la supervivencia. Las integrinas son receptores transmembrana heterodiméricos, que consta de subunidades alfa y beta, que están asociados de forma no covalente; se enlazan físicamente el ECM al citoesqueleto de actina intracelular, pero también son capaces de transducir señales bidireccionalmente a través de la membrana plasmática [1]. Mediante la unión a ligandos de ECM, las integrinas se activan y capaz de regular las funciones celulares iniciando cascadas intracelulares de señalización. Hasta el momento, 24 heterodímeros de integrinas, 18 α y 8 β subunidades y cinco β
1variantsubunits β
1Aβ
1Bβ
1Cβ
1C-2 y β
1D, generada por splicing alternativo , se han descrito [2], [3]. Las integrinas son reguladores críticos de crecimiento, diferenciación, supervivencia, migración y la invasión [4], [5]. Se ha informado de que la progresión del cáncer de próstata (AEP) para los estadios avanzados se asocia con cambios en los perfiles de expresión de la integrina [6], [7], [8].
Las vías de integrina y la señalización del factor de crecimiento son pensado para ser vinculado mecánicamente debido a la adhesión celular a ECM es crucial para que las células responden a ciertos factores de crecimiento [9]. señalización del factor de crecimiento puede alterar las adhesiones focales, los presuntos sitios de la señalización mediada por la integrina [9] y por lo tanto modular la adhesión celular mediada por integrinas y la motilidad. se ha informado de interacciones físicas y funcionales entre integrinas y componentes de las vías de señalización del factor de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) o sus proteínas de señalización aguas abajo [10], [11],. Nuestro laboratorio ha demostrado que β
1 integrinas modulan selectivamente tipo 1 del receptor de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) mediada por la señalización y funciones en PRCA [10], [12]. IGF-1 también se ha informado de inducir la adhesión y migración de células de mieloma múltiple humano en parte por la activación de β
1 integrinas [13]. Por otra parte, beta constitutivamente activa
1 integrinas promueven fenotipo maligno en las células y que las oriente PrcA se informó de inhibir la metástasis PrcA [14].
IGF-1 es un polipéptido de cadena que, además de su más clásica papel endocrino, media de crecimiento autocrino o paracrino y por lo tanto actúa como un potente factor de crecimiento y la supervivencia. IGF-1 provoca su acción sobre las células mediante la unión a su receptor, IGF-IR. El IGF-IR es un transmembrana heterotetrameric glicoproteína con actividad de tirosina quinasa [15]. El sustrato del receptor de insulina (IRS) proteínas funcionan proteínas de conexión como específicos para IGF-IR y la insulina receptor (IR) [16]. IRS1 y IRS2 no contienen actividad quinasa intrínseca, sino más bien la función mediante el reclutamiento de proteínas a los receptores, donde se ensamblan los complejos de señalización de la superficie. Señalización del IRS proteínas da como resultado la activación de vías incluyendo fosfatidil inositol-3-quinasa (PI3K) y activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) [17], [18]. Curiosamente, se sabe que también las dos vías para ser activado por la integrina compromiso [19], [20]. La asociación entre las integrinas y IRS1 se ha sugerido como un posible mecanismo para la acción sinérgica de factor de crecimiento y receptores de la matriz extracelular [21]. IGF-1 de señalización se ha informado que ser regulada por un mecanismo de retroalimentación negativa a través de ubiquitina /proteasoma mediada por la degradación de IRS2, con lo que se regula la magnitud y duración de la respuesta a la insulina o IGF-1 [22]. Nuestro laboratorio ha demostrado recientemente que la β
1 integrinas regulan la expresión de IGF-IR y son críticas para la mejora mediada por IGF-1 de la actividad del receptor de andrógenos (AR) [23]. También hemos informado que el IGF-IR fuertemente regula la expresión de β
1 integrina en las células PrcA [24], pero el mecanismo subyacente a este reglamento aún no se caracteriza.
A pesar del consenso limitada con respecto a los niveles de IGF IR expresión en el epitelio de próstata benignas como malignas, varios ensayos clínicos dirigidos a la IGF-IR en diferentes tumores, incluyendo PRCA, están en marcha. Identificar y comprender los efectores de IGF-IR ayudaría a definir mejor el papel funcional del eje IGF-1 en APCR. Dada la evidencia informado de una fuerte interacción física y funcional entre β
1 integrinas y el IGF-IR, este estudio investigó el mecanismo mediante el cual el IGF-IR regula β
1 integrinas. Se presenta una nueva vía de diafonía entre
1 integrinas IGF-IR y β, que promueve la proliferación de células cancerosas, y demostramos que el IGF-IR se estabiliza α
5β
1 integrina protegiéndolo de la degradación proteasomal.
Materiales y Métodos
reactivos y anticuerpos
se utilizaron los siguientes reactivos. Opti-Mem y oligofectamine (todos de Invitrogen, CA), andrógeno sintético R1881 (Perkin-Elmer, CA), inhibidores de proteinasa (Sigma, MO), IGF-1 recombinante (amp I +; D Systems, MN), MG132 y epoxomicina (Sigma , MO). Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales murinos (mAb): a ß
1 integrinas (BD Transduction Laboratories, CA), para IGF-IR para citometría de flujo (αIR-3, EMD, NJ); a a
2 integrina (Abcam, Cambridge, Reino Unido); a a
7 integrina (8G2, EMD, NJ). Rat mAb de CD4 fue adquirido de Santa Cruz, CA. Se usaron los siguientes anticuerpos policlonales de conejo (Pabs): a IGF-IR (IGF-IR-β sc713), para AKT y ERK1 /2 (de Santa Cruz, CA); a survivina (Novus Productos Biológicos, CO). los pAbs de conejo a a
3, α
4, y α
5 específico para el dominio C-terminal de cada subunidad, eran una especie de regalo del Dr. E. Ruoslahti, Universidad de California en Santa Bárbara, Sanford -Burnham Instituto de Investigación médica, CA. La α
6 Ab (AA6A) específico para el dominio C-terminal de α humano
6 integrina fue una especie de regalo del Dr. Anne Cress, Universidad de Arizona, AZ. siRNA oligonucleótidos utilizados en este informe se han descrito antes [24].
Las células
células
LNCaP y C4-2B fueron adquiridos de ATCC. Las células se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en medio RPMI-1640 suplementado con 5% de FBS y 1% cada una de piruvato de sodio, HEPES y no esenciales aminoácidos. Para evaluar el efecto de los agonistas, después de la transfección las células se mueren de inanición con suero despojado de carbón vegetal al 2% (CSS) que contenía medio durante 24 h seguido por la estimulación ligando para adicional 24 h. células PC3 se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS. PC3-CH1, CH2 y PC3-PC3-CH β
1C células usadas para la expresión inducible de han descrito construcciones quiméricas anterior [25], [26]. Las células fueron privadas de suero durante 24 h y se trataron con 75 M ZnSO
4 de 6 h. La construcción quimérica Ch1 contiene el dominio extracelular de CD4 murino y los dominios transmembrana y citoplásmico de la β
integrina 1A; Ch β
constructo 1C (utilizado como control) es el mismo que Ch1 excepto que β
1A región integrina codificante se sustituye por β
codificación 1C región. Ch2 constructo representa otro control y lleva el dominio extracelular de CD4 murino unido al dominio transmembrana de la β
1 integrina subunidad. Todas las construcciones se expresaron bajo el control del promotor de metalotioneína 1 de ratón y la expresión de las variantes quiméricas se induce después de la adición de ZnSO
4 al medio de crecimiento.
Transient siRNA transfección
La transfección transitoria de células con siRNA oligonucleótidos se realizó tal como se describe [23]. Invertida-IGF-IR siRNA que tiene una secuencia objetivo inversa de IGF-IR siRNA sirvió como control.
Ensayo de proliferación de células
LNCaP y C4-2B fueron transfectadas transitoriamente con el control o IGF-IR siRNA . Veinticuatro horas después de la transfección, las células se trataron con tripsina y se analizaron para la eficiencia de IGF-IR y β
1 integrina regulación a la baja. Se contaron las células transfectadas y re-chapada por triplicado en placas de 6 pocillos a 3 × 10
4 células por pocillo en un 2% medio que contenía CSS-en presencia de 1 nM R1881. Las células vivas se contaron para los próximos tres días consecutivos por hemocitómetro. Imágenes de células vivas fueron tomadas el día 2 y 3 antes de ser cosechadas para el recuento.
independiente del anclaje ensayo de crecimiento
células LNCaP se sembraron y se transfectaron con el control o IGF-IR en combinación con siRNA o bien el vector solo, pBJ1, o una pBJ1-β
1 constructo [27]. Veinticuatro horas más tarde, las células se tripsinizaron y se sembraron en agar blando en platos de 6 pocillos a 5.000 células /pocillo. Las células se dejaron crecer durante dos semanas y colonias contadas. El tamaño de las colonias se midió utilizando un ocular equipado con un retículo de medición y las colonias con un tamaño de 0,1 mm se contaron en diferentes muestras. Las colonias se fijaron y tiñeron con cristal violeta y las imágenes de las colonias fueron capturados por microscopio estéreo.
inmunoprecipitación e inmunotransferencia
La inmunoprecipitación de células PC3 se llevó a cabo como se describe anteriormente [28]. Los lisados celulares se utilizaron para la inmunotransferencia como se describe [12]. Para el análisis de los lisados de células PC3 transfectadas con construcciones quiméricas, las células PC3-CH1 y PC3-CH2 fueron transfectadas con control o IGF-IR siRNA y 24 h más tarde, las células fueron cultivadas en medio libre de suero durante 24 h seguido de tratamiento con 75 M ZnSO
4 de 6 h y, a continuación, se recogieron por inmunotransferencia. La intensidad de cada banda se evaluó mediante análisis ImageJ y normalizado con control de carga.
análisis FACS
células PC3-CH1 y PC3-CH2 fueron tratados como anteriormente y se recogieron para el análisis FACS. Las células se tiñeron con 1 mg /ml Ab de CD4 o IgG de rata como control negativo, seguido por tinción con FITC-conjugado Ab secundario. Perfiles de expresión fueron adquiridos utilizando instrumento FACS Calibur (BD) y los datos se analizaron por software FlowJo (Árbol Star Inc., OR).
Proteasomal ensayo de inhibición
células LNCaP fueron transfectadas con control o IGF -IR siRNA y 24 h después, las células se mueren de inanición en 2% de medio que contenía CSS-durante 24 h. Las células fueron tratadas con 1 nM R1881, con o sin 10 mM MG132 durante 6 h. células PC3-2 se transfectaron en la misma manera que las células LNCaP y 24 h después de la transfección tratados con 10 mM MG132, ya sea para 6 o 24 h y se analizaron por inmunotransferencia. Para la inhibición específica de la función del proteasoma usando epoxomicina, células LNCaP fueron transfectadas como anteriormente, hambre con 2% de medio que contenía CSS-durante 24 h, seguido de tratamiento con 1 nM R1881 junto con 0, 100, 250 o 500 epoxomicina nM para 18 h y cosechada. Los lisados se analizaron mediante inmunotransferencia. intensidades de banda relativas de β
1 integrina subunidades
se llevó a cabo en tiempo real PCR cuantitativa
en tiempo real el análisis de PCR como se describe anteriormente [23]. Cada reacción se lleva a cabo, al menos por triplicado; desviaciones y el significado estándar se calcularon usando el software Excel (Microsoft). Las secuencias de oligos utilizados son los siguientes: β
1 integrina, (sentido: CTCAAGCCAGAGGATATTAC, antisentido: TCATTGAGTAAGACAGGTCC), IGF-IR, el sentido: AATGAGTGCTGCCACCCCGA, antisentido: ACACAGCGCCAGCCCTCAAA), GAPDH, (sentido: GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT, antisentido: GTTCTCAGCCTTGACGGTGC) , β-actina, (sentido: TCCATCATGAAGTGTGACGT, antisentido: GGAGGAGCAATGATCTTGAT).
El análisis estadístico
La significación estadística (valor de p y t-test) entre los conjuntos de datos se calculó utilizando el software Excel (Microsoft). Un valor de p bilateral de ≤0.02 fue considerado estadísticamente significativo. Los resultados se representaron en un gráfico usando el software DeltaGraph 4,5 (Rockware).
Resultados
Pérdida de IGF-IR y β
1 integrinas inhibe la proliferación de células PrcA
Hemos demostrado previamente que β
1 integrinas son cruciales para la proliferación de células c l cáncer mediada por IGF-IR [10]. Dado que el IGF-IR regula fuertemente β
1 la expresión de la integrina, se evaluó el efecto directo del agotamiento del IGF-IR sobre la proliferación celular. células LNCaP y C4-2B fueron transitoriamente agotando de IGF-IR y re-chapada en 2% de medio que contenía CSS-en presencia de 1 nM andrógeno sintético (R1881). La pérdida de IGF-IR inhibe sorprendentemente la proliferación celular en ambas líneas celulares (
* P & lt; 0,02) (Fig 1A, paneles superiores.). La reducción de expresión de IGF-IR y β
1 subunidades de integrina para ambas líneas celulares se confirmó mediante inmunotransferencia (Fig. 1A, paneles inferiores). R1881 se utilizó para mejorar los niveles de expresión de IGF-IR y β
1 y para aumentar los efectos de estos receptores sobre la proliferación. También se observaron efectos significativos sobre la proliferación celular en ausencia de R1881 en células LNCaP y C4-2B después de la depleción IGF-IR (datos no mostrados). densidad celular reducida en condiciones de cultivo se observa claramente en el análisis de las células C4-2B con reducidos
1 en los niveles de IGF-IR y beta en comparación con las células con expresión endógena de ambos receptores (fig. 1B). se muestran imágenes de densidad de células representativas de los ensayos de los días 2 y 3 de proliferación. Estos datos muestran que el IGF-IR y β
1 integrinas son esenciales para la proliferación de las células PRCA.
células (A) LNCaP y C4-2B fueron transfectadas ya sea con el control de siRNA o IGF-IR siRNA y 24 h más tarde, se tripsinizaron y se contaron las células. Las células se volvieron a sembrar por triplicado a 3 x 10
5 células por pocillo en placas de 6 pocillos con 2% de medio que contenía CSS-en presencia de 1 nM R1881, recogieron y se contaron en el día 1, 2 y 3 después de la re-enchapado . Cada ensayo experimental se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan la desviación estándar a partir de tres valores independientes (
* P & lt; 0,01), en relación a los respectivos tratamientos de control de siRNA. Un conjunto paralelo de LNCaP y C4-2B lisados de células se analizó para la eficiencia de IGF-IR y β
1 integrina regulación a la baja de la subunidad por inmunotransferencia (paneles inferiores). (B) Imágenes representativas de las densidades de células C4-2B relativos en el día 2 y el día 3 se muestran.
Exógenos expresión de la β
1 integrina subunidad restaura el retraso del crecimiento independiente de anclaje de la AEP células tras la regulación por disminución de IGF-IR
nos
las conclusiones que el IGF-IR regula β
1 integrina expresión y que la derogación de IGF-IR en peligro el crecimiento de las células cancerosas, llevó a investigar si β
1 integrinas juegan un papel en la regulación del crecimiento mediada por IGF-IR. Con el fin de determinar si β expresión
1 integrina podría revertir la inhibición de crecimiento independiente de anclaje inducida por el agotamiento de IGF-IR, las células LNCaP fueron transfectadas con IGF-IR siRNA, con o sin β cDNA
1 integrina, y se dejaron crecer y formar colonias en agar blando durante dos semanas. agotamiento de IGF-IR reduce significativamente el crecimiento de colonias en agar blando (
** P & lt; 0,01) (Fig. 2). expresión exógena de la β
1 subunidad sin embargo, alivia parcialmente la supresión del crecimiento inducida por la caída IGF-IR tal como se mide por el número de colonias con tamaño ≥100 m (
* P & lt; 0,02). Imágenes representativas de colonias vivas se capturaron en un microscopio invertido y se muestran en el panel inferior (Fig. 2). Estos datos ponen de relieve el papel de β
1 integrinas en la regulación del crecimiento IGF-IR mediada por células en APCR.
LNCaP células fueron co-transfectadas con el control o IGF-IR siRNA y ya sea con el pBJ1 -β
1 constructo o la pBJ1 control de vectores. Las células se colocaron en placas en agar blando y se dejaron crecer durante 2 semanas. El tamaño de las colonias se midió usando un microscopio invertido equipado con un ocular que contiene un retículo de 25 mm y colonias totales con el tamaño se contaron ≥ 100 micras. Los números que se muestran en el gráfico representan los recuentos promedio de tres muestras independientes (
* P & lt; 0,02;
** P & lt; 0,001). Imágenes representativas de colonias vivas que reflejan la variación en tamaño de las colonias con o sin β exógeno
1 se muestran en los paneles inferiores. Las barras de medición representan un tamaño de 100 micras.
regulación de IGF-IR de β expresión
1 integrina no se produce en el nivel de ARNm
efecto cooperativo de estos receptores en las el crecimiento de las células cancerosas nos llevó a investigar el mecanismo por el que IGF-IR regula β
1 de expresión. Hemos demostrado anteriormente que el IGF-IR regula la expresión de β
1 subunidades de integrina en células PrcA [24]. Esta regulación puede ocurrir en el transcripcional, post-transcripcional, traduccional o los niveles posteriores a la traducción. la regulación de ARNm de β
1 integrinas por IGF-IR se analizó en las células LNCaP mediante la reducción de la expresión de IGF-IR por la interferencia de ARN, seguido de tratamiento con R1881 y /o IGF-1. análisis en tiempo real de transcritos de ARNm indican que IGF-IR mRNA es inducido 8 veces sobre R1881 y 2,5 veces en IGF-1 de tratamiento (Fig. 3). Sin embargo, no hay cambios significativos en β
1 los niveles de mRNA de la integrina se detectan en ambos tratamientos. El agotamiento de los resultados de expresión de IGF-IR en la reducción de cuatro veces de IGF-IR mRNA después de los tratamientos de ligando. Los datos indican que los niveles de transcripción β
1 integrina no cambian significativamente en caída IGF-IR. Análisis de perfil de expresión de GAPDH en este experimento sirvió como un control de referencia adicional. Los resultados indican claramente que el IGF-IR no regula ß
1 subunidades de integrina en el ARNm.
células LNCaP fueron transfectadas con el control o IGF-IR siRNA. Veinticuatro horas más tarde, las células fueron cultivadas en medio que contiene 2% CSS para adicional 24 h y se trataron con vehículo, 1 nM R1881 o 100 ng ml IGF-1 /por adicional 24 h. ARN aislado de estas células se evaluó para los niveles de transcripción de IGF-IR, β
1 integrina y GAPDH utilizando PCR cuantitativa en tiempo real. valores de expresión se normalizaron respecto a los niveles de transcripción de β-actina y los datos se presentan como expresión relativa. Cada reacción se realizó por triplicado y las barras de error representan la desviación estándar (
* P & lt; 0,01) en relación con las muestras sin tratar
expresión inducible de las células CD4-β
1A integrina quimera dominio citoplásmico hace. no proteger la β endógena
1 integrina subunidad de la degradación inducida por IGF-IR agotamiento
Para explorar si la expresión exógena del dominio citoplásmico de β
1A altera la regulación mediada por IGF-IR de la endógena β subunidades de integrina, construcciones quiméricas compuestas de transmembrana y el dominio citoplásmico de β
se utilizaron
1 integrina 1A con CD4 dominio extracelular (CH1). El dominio citoplásmico de la β
existe 1 subunidad en cinco formas diferentes de corte y empalme; la forma más ampliamente expresado en el cáncer, β
1A, regula β
1 localización, la proliferación celular y la migración [2]. Especulamos que la unión del dominio citoplásmico de β
1 integrinas a la IGF-IR daría lugar a una competencia para la unión de IGF-IR a diferentes formas de β
1 y el resultado en una β
1 de protección efecto en condiciones de IGF-IR agotados. La expresión de la quimera Ch1 (células CH1), o Ch2 quimera, que se corresponde con el dominio transmembrana de β
1 más el dominio extracelular de CD4 (células CH2), en células PC3 fue inducida por ZnSO
4 de tratamiento. agotamiento de IGF-IR en las células transfectadas de forma estable se confirmó por análisis de inmunoblot (Fig. 4A, panel superior izquierdo). La inducción de la β citoplásmica
variante 1 se confirmó por FACS (Fig. 4A, paneles inferiores). Tras la inducción, se espera que el IGF-IR para redistribuir y se unen tanto a la β endógeno
1 y la variante citoplásmica exógeno. inducción exógena de la β
1 dominio citoplásmico, sin embargo, no altera la regulación mediada por IGF-IR de β endógena niveles 1
integrina (Figura 4A, panel superior derecho). Con el fin de investigar si el β
1A variante citoplásmica interacciona físicamente con el IGF-IR, la inmunoprecipitación de CD4 en PC3-Ch1 y β PC3-CH células
1C (transfectadas de forma estable con dominio citoplásmico de β
1C integrina más el dominio extracelular de CD4 [29]) se llevó a cabo después de la incubación de las células con ZnSO
4. Los espectáculos de inmunotransferencia (panel superior) la presencia de IGF-IR en el lisado celular, pero no en muestras de CD4 inmunoprecipitadas. El panel inferior muestra que las células CD4 se inmunoprecipitó de manera eficiente; una banda irrelevante también se detectó en las muestras de IgG inmunoprecipitadas. Los datos indican que el dominio citoplásmico de la β
variante 1A integrina no interactúa con endógeno IGF-IR (Fig. 4B).
(A) PC3-Ch1 (expresando dominio extracelular de CD4 murino y los dominios transmembrana y citoplásmicos de β
1) y las células PC3-CH2 control (que expresan el dominio extracelular de murino CD4 unidos al dominio transmembrana del fueron transfectadas con el control o IGF-IR siRNA la β
1). Veinticuatro horas después de la transfección, se recogieron las células para evaluar la eficiencia de caída IGF-IR (paneles superior izquierda). células PC3-CH1 y PC3-CH2 se mueren de inanición en medio libre de suero durante 24 h y donde se indique, se indujeron con 75 M ZnSO
4 para adicional 6 h para promover la expresión de las proteínas quiméricas. Las células se recogieron para el análisis de β
1 y la expresión de la subunidad (paneles superiores de la derecha). Un conjunto paralelo de muestras se procesó para confirmar la expresión inducible de las quimeras mediante análisis FACS utilizando un Ab de CD4 (paneles inferiores). 10.000 células en cada muestra fueron adquiridas y los datos se muestran en los histogramas con el eje x representa la expresión de CD4 relativa media y el eje y representa el número de células. (B) PC3-Ch1 y PC3-Chβ
1C (células de control que expresan dominio extracelular de murino CD4 y los dominios transmembrana y citoplásmico de la β
1C) se incubaron con 75 M ZnSO
4 para inducir la expresión del dominio citoplásmico de β
1A o β
1C integrinas, respectivamente. Los lisados se inmunoprecipitaron con IgG de control o Ab contra CD4 dominios quiméricos. Los inmunocomplejos se analizaron para la expresión de IGF-IR por inmunotransferencia. lisados de entrada se corrieron como controles.
Enhanced degradación proteasomal de β
1 subunidades de integrina en la ausencia de IGF-IR
Después de demostrar que el IGF-IR no regula β
1 integrina transcripciones, hemos tratado de determinar si la regulación de los niveles de β
1 integrina IGF-IR mediada ocurriría a nivel post-translacional. agotamiento transitoria de IGF-IR en las células LNCaP fue seguido por tratamiento R1881 solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, MG132, por 6 h. R1881 se utilizó para mejorar los niveles de expresión basales de IGF-IR y β
1 subunidad integrina como se informó anteriormente por nuestro grupo se analizaron [23] y los lisados celulares. La reducción de los niveles de β
1 integrina inducida por el agotamiento de IGF-IR fue abolida tras el tratamiento celular con este inhibidor del proteasoma (Fig. 5A). Los resultados de este experimento se confirmaron en células PC3 después de la transfección con cualquiera de ARNsi de control o IGF-IR siRNA seguido de tratamiento con MG132 de 6 o 24 h (Fig. 5B). Estamos, además, corroborado estos resultados mediante el uso de diferentes dosis de epoxomicina, otro inhibidor de proteasoma altamente específicos [30]. células LNCaP fueron transfectadas con el control o IGF-IR siRNA como anteriormente y se trataron con concentraciones crecientes de epoxomicina. β
1 integrina subunidades están presentes en cualquier precursor o formas maduras (110 y 130 kD, respectivamente) y ambos se downregulated en caso de pérdida de IGF-IR. Los datos muestran que epoxomicina bloquea la degradación de la forma madura de la β
1 integrina subunidad (Fig. 5C). El β madura
1 receptor solo parece seguir la degradación proteasomal después de la internalización. La forma precursora de β
1 (110 kD) que necesita modificaciones aún más después de la traducción a someterse a la maduración no se recupera por la inhibición proteasomal. Los datos muestran que el IGF-IR se estabiliza expresión de la subunidad β
1 integrina mediante la inhibición de su degradación proteasomal. Células LNCaP
(A) fueron transfectadas con el control o IGF-IR siRNA. Veinticuatro horas más tarde, las células fueron cultivadas en medio que contiene 2% CSS para adicional 24 h y se trataron con vehículo, 1 nM R1881 y /o 10 M MG132 durante 6 h. Los lisados celulares se analizaron para la expresión de β
1 de la subunidad de la integrina y el IGF-IR por inmunotransferencia. AKT se utilizó como control de carga. Las intensidades de las bandas de la β
1 subunidad integrina se cuantificaron por análisis de ImageJ y normalizado con los de AKT como control de carga. Los valores de intensidad relativa se expresan como porcentaje de la muestra de control transfectadas con siRNA de control solo. (B) células PC3 se transfectaron con el control o IGF-IR siRNA. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se trataron con 10 mM MG132 durante 6 o 24 h en medio RPMI que contiene 10% de suero. Los lisados celulares se analizaron para la expresión de β
1 de la subunidad de la integrina y el IGF-IR por inmunotransferencia. AKT se utilizó como control de carga. β
1 subunidades de integrina se cuantificaron mediante ImageJ como antes y se normalizaron los valores con los de AKT control de carga. valores de intensidad relativa de β
1 se expresan como porcentaje de la muestra de control transfectadas con siRNA de control solo. las células LNCaP (C) se transfectaron como anteriormente y 24 h más tarde las células fueron cultivadas en medio que contiene 2% CSS durante 24 h adicionales seguido de tratamiento con 0, 100, 250 o 500 epoxomicina nM en combinación con 1 nM R1881 durante 18 h. Los lisados celulares se analizaron para las formas madura y precursora de β
1 de la subunidad de la integrina y el IGF-IR por inmunotransferencia. AKT sirve como control de carga. intensidades de banda relativas de β madura
1 integrina se determinaron mediante análisis ImageJ que el anterior.
Análisis de α subunidades de integrina sobre regulación a la baja de IGF-IR
Las integrinas son heterodímeros que consisten en α y ß subunidades. Hay 24 posibles heterodímeros con la capacidad de activar vías de señalización [19]. β
1 integrinas, entre otras subunidades, se sabe que heterodimerizarse con α2, α3, α4, α5, α6 y subunidades de integrina a7, que se expresan en las células LNCaP. Ya que la reducción de los niveles de expresión de IGF-IR conduce a la regulación a la baja de la β
1 de la subunidad de la integrina, decidimos determinar qué subunidad integrina se vio afectada por la regulación por disminución de IGF-IR. Se demuestra una reducción significativa de la subunidad de integrina α5 en conjunción con una reducción de IGF-IR y ß
1 niveles (Fig. 6). No se detectaron cambios en los niveles de expresión de otros socios heterodiméricas integrina alfa (Fig. 6 y los datos no presentados). Estos resultados son consistentes con nuestras observaciones anteriores en células PC3 donde abrogación de β
1 integrinas por shRNA condujo a una reducción significativa en la expresión en la superficie de la subunidad α5 integrina [3]. Nuestros datos demuestran que el complejo mayor de regulada por IGF-IR es α5β
1 integrina.
células LNCaP fueron transfectadas con el control o IGF-IR siRNA y se tratan con 2% de medio que contenía CSS-para 24 h seguido de tratamiento con 1 nM R1881 durante 24 h. IGF-IR y la integrina β1 regulación a la baja se evaluó mediante inmunotransferencias. Los lisados se analizaron después para la expresión de diversas subunidades alfa de la integrina. Abs específica contra α
2, α
4, α
5, α
6 y α
Se han usado 7 subunidades de integrina para identificar el socio α integrina de la β
1 integrina subunidad, que está regulado por disminución en el agotamiento del IGF-IR.
Discusión
Este estudio describe una nueva observación de que las funciones de IGF-IR en células PrcA están parcialmente mediados por β
1 integrinas. Para diseccionar el mecanismo por el cual el IGF-IR regula β
1 integrina expresión, demostramos que el IGF-IR realza β
1 integrina estabilidad mediante la reducción de su degradación proteasomal. También muestran que la α
5 integrina subunidad asociada con β
1 se downregulated selectivamente en caso de pérdida de IGF-IR.
Los datos epidemiológicos y preclínicas significativas han identificado la vía de IGF-IR como un importante regulador de la biología de las células tumorales. Los resultados decepcionantes, sin embargo, de varios ensayos clínicos dirigidos a inhibir IGF-IR, están impulsando a los investigadores a desarrollar biomarcadores predictivos para mejorar la selección de los pacientes que se beneficiarían de las terapias dirigidas a IGF-IR. Por otra parte, es necesario una comprensión más clara de las proporciones relativas de los complejos de IGF-IR e IR en tumores.